乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验

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乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析

乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析樊惠华，侯磊磊，方莹，柴梅梅（榆林市食品检验检测中心，陕西榆林 719000）摘要：为了提升食品检验检测机构对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力，提高微生物实验室外部质量控制水平。

本实验室参加中国检验检疫科学研究院测试评估中心组织的ACAS-PT1108（2021）乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证，参考参试指导书、《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）、海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管和MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物生化鉴定仪。

结果表明，参试样品编号21-T031为单核细胞增生李斯特氏菌，样品编号21-U887未检出单核细胞增生李斯特氏菌，经鉴定为伊氏李斯特氏菌，最终能力验证结果评价为满意，可见本实验室具有成熟的单核细胞增生李斯特氏菌检验能力。

关键词：乳粉；单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证Results and Analysis of the Proficiency Testing of ListeriaMonocytogenes in Milk PowderFAN Huihua, HOU Leilei, FANG Ying, CHAI Meimei(Yulin Food Inspection and Testing Center, Yulin 719000, China)Abstract: In order to improve the ability of food inspection and testing institutions to detect Listeria monocytogenes in food and to improve the external quality control level of microbiology laboratory. The laboratory participated in the proﬁciency testing of Listeria monocytogenes in ACAS-PT1108 (2021) milk powder organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Sciences. Reference was made to the test guidelines, the GB 4789.30—2016, the complete biochemical identiﬁcation tubes of Listeria monocytogenes in Haibo and the MicroScan WalkAway 40 Plus automatic microbial biochemical identification instrument. The results showed that the sample number 21-T031 was detected as Listeria monocytogenes, and the sample number 21-U887 was not detected as Listeria monocytogenes, which was identiﬁed as Listeria.ivanovii. The ﬁnal proﬁciency test results were satisfactory. It can be seen that the laboratory has a mature ability to test Listeria monocytogenes.Keywords: milk powder; Listeria monocytogenes; proﬁciency test李斯特菌属目前包括17种公认的短杆状革兰氏阳性菌，其中单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌被认为是病原体[1]。

单增李斯特氏菌及其检测方法

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

乳与乳制品检验方法汇编

乳与乳制品检验方法汇编1.物理性质检验：-外观检验：观察乳与乳制品的外观，如颜色、气味、质地等，以判断是否符合标准要求。

-pH值测定：通过测定乳与乳制品中的酸碱度，了解其酸度和稳定性。

-脂肪含量测定：采用脂肪测定仪器，测定乳和乳制品中的脂肪含量，以评估其营养价值。

2.化学成分检验：- 蛋白质含量测定：使用含氮柱的色谱仪或Kjeldahl法，测定乳制品中的蛋白质含量。

-脂肪酸组成分析：使用气相色谱仪，分析乳与乳制品中脂肪酸的种类和含量。

-糖含量测定：采用光度计、高效液相色谱仪等方法，测定乳与乳制品中的糖含量。

3.微生物检验：-总菌落计数：采用平板计数法，将样品接种在培养基上，通过菌落的形成计数，评估样品的微生物质量。

-大肠菌群检验：采用MPN法、膜过滤法等，检测样品中的大肠菌群数量，判断是否符合卫生标准。

-酸奶发酵能力检验：将酸奶样品接种在特定的培养基中，观察培养过程中是否产生酸味和凝结物。

4.成分添加物检验：-防腐剂检测：采用色谱仪等仪器，分析乳与乳制品中的防腐剂种类和含量，判断是否符合标准。

-添加剂检测：例如甜味剂、食用色素等，使用色谱仪等仪器，测定其含量，确保在安全范围内使用。

5.食品安全检验：-重金属检测：使用原子吸收光谱仪等仪器，测定乳与乳制品中的重金属含量，以评估样品的安全性。

-农药残留检测：采用气相色谱仪、液相色谱仪等仪器，测定样品中的农药残留量。

-食品添加剂检测：例如苯甲酸钠、亚硝酸盐等，采用色谱仪等仪器，测定其含量，确保在安全使用范围内。

综上所述，乳与乳制品的检验方法包括物理性质检验、化学成分检验、微生物检验、成分添加物检验以及食品安全检验等多个方面的内容。

通过这些检验方法的应用，可以保证乳与乳制品的安全和质量，确保消费者的健康。

而为了确保检验的准确性和公正性，相关的检验机构和实验室需要制定相应的检验标准和操作规范，并进行检验结果的合格判定。

乳与乳制品微生物检验方法

乳与乳制品微生物检验方法1.菌群总数测定方法：菌群总数测定方法是衡量乳制品中微生物质量的基础方法之一、目前常用的菌群总数测定方法有总计数平板法、液体培养法和荧光素酶法。

总计数平板法是将样品分别接种在琼脂平板上，通过平板上菌落的形成来计数。

液体培养法是将样品接种在适当的培养基中，通过测量培养液的浑浊度或菌液悬浮液中的细菌数量来计数。

荧光素酶法是通过加入荧光素酶底物，菌落会释放出荧光，通过测量荧光强度来计数。

这些方法可以快速、准确地测定样品中菌落总数，从而确定乳制品的微生物质量。

2.根据德国奶酪乳制品行业协会VDF指南的要求，共有500多种病原菌可以检测，包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及其他致病菌。

这些方法多是PCR技术、荧光定量PCR技术等。

以沙门氏菌检测为例，主要有传统培养法、分子生物学培养法、酶免的葡萄糖酸盐液体培养基、黄金标准法等多种方法。

其中，PCR技术可以通过扩增沙门氏菌的DNA序列，快速、准确地检测样品中的沙门氏菌。

3.酸奶产品中乳酸菌数量的测定：乳酸菌是酸奶中的一类重要菌群，其数量多少直接影响酸奶的质量。

常用的测定乳酸菌数量的方法有直接显微法、涂布法、测定菌落数量法等。

直接显微法是将样品显微镜下直接观察和计数乳酸菌的数量。

涂布法是将样品涂于适当的培养基上，通过菌落的形成来计数。

菌落数量法是将样品稀释后均匀涂布在琼脂平板上，通过菌落的形成来计数。

这些方法可以可靠地测定乳酸菌的数量，从而评估酸奶的质量。

4.冷藏和储存条件检验方法：乳制品的储存条件对其微生物质量有着至关重要的影响。

常用的储存条件检验方法包括温度检测、湿度检测、pH值检测等。

温度检测可以通过温度计或温度记录器来测量乳制品的储存温度，确保其符合相关标准。

湿度、pH值等的检测可以通过仪器设备进行测量和监控。

这些方法能够及时发现和纠正乳制品储存条件的问题，保证乳制品的微生物质量稳定。

总结起来，乳与乳制品微生物检验方法包括菌群总数测定方法、病原菌检测方法、乳酸菌数量测定方法和储存条件检验方法等。

单核细胞增生李斯特菌检验

血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清学分型.虽然Lm有16种血清型,1/2a、1/2b 、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、 4d、4e、5、6a、6b和7,但只有3种血清型 <1/2a、1/2b、4b>可引起疾病.从食品和患者中分离的菌株95％以上是1/2a,1/2b,1/2c 和4b等血清型,而3a、3b、3c、4a、4c、4e 、4d和7等血清型在食品中非常少见,也没有引起李斯特菌病的报道.
溶血反应＋－＋－＋－
协同溶血
葡萄糖
麦芽糖
MR-VP
甘露醇
鼠李糖
木糖
七叶苷
＋
＋
＋
＋/＋
－
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－
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V
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＋/＋
－
V
－
＋
动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培养基中,于30℃培养24h-48h,李斯特菌有动力, 呈伞状生长.
PCR检测方法：〔1取1ml被检样李斯特氏菌增菌肉汤用于提取DNA的,模板DNA的制备, 根据试剂盒说明书进行；〔2PCR反应体系：20μl .
H2O<二馏灭菌水>12.8μl,
10×buffer2.0μl,
Mg2+<25mol/l> 2.0μl,4×dNTP<10mmol/ml> 1.6μl,Primer<30pmol/μl>各0.25μl,

单增李斯特菌的检验方法

单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌
效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。

上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸0.1mlLB1增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。

二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。

（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。

此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。

七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿
素
硝
酸
盐
还
原
VP MR H2O2
++----+++。

单增李斯特氏菌能力验证结果与分析

单增李斯特氏菌能力验证结果与分析作者：白雯静王艳炜王海峰来源：《食品界》2022年第10期引言单核细胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然环境中的革兰氏阳性、嗜冷、兼性厌氧细菌。

同时，也是一种食源性的人畜共患病的病原菌，欧美国家曾多次暴发由于食用了受单增李斯特氏菌污染的肉制品、奶制品、蔬菜及水果等而引发的严重的食物中毒事件。

在《GB 29921-2021 食品安全国家标准食品中致病菌限量》中，对乳制品、肉制品（包括熟肉制品和即食生肉制品）、水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品均有五份样品中均不得检出单增李斯特氏菌（n=5，c=0，m=0）的规定;同样，在2022年3月7日实施的《GB 31607-2021 食品安全国家标准散装即食食品中致病菌限量》中“部分或未经热处理散装即食食品”：单核细胞增生李斯特氏菌限量为0/25g（mL）。

由此类标准可见，国家对于食品中“单核细胞增生李斯特氏菌”的管理是十分严格的。

目前，国内单核增生李斯特氏菌的检验方法主要有：分子生物学检测技术（结合等温扩增技术、结合聚合酶链式反应技术）、免疫学检测技术、生物传感器检测技术、光谱学检测技术、其它检测技术（除了基于核酸檢测、特有蛋白检测之外，还可以与色谱、核磁等多项技术技术相结合对单增李斯特氏菌进行检测）。

《GB 4789. 30-2016食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》与旧版标准相比较，主要增加了“第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法”和“第三法单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法”。

目前，对单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法是比较成熟的。

而且，随着检验检测技术日新月异的发展，使得较短时间内完成精准检测成为可能。

另外，对于实验室而言，质量控制具有十分重要的意义。

质量控制的工作包括很多方面。

比如，实验室内部控制和实验室间控制等等。

实验室内部控制工作可通过多种工作方式来展开。

比如，内部质量监督以及通过购买质控样品开展相关检验检测工作等等。

单增李斯特菌的检验方法

单增李斯特菌的检验方法
一. 增菌：
1. EB肉汤
2. LB 肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB 增菌效
果优于EB）
LB分为LB和LR,两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基-- 杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。

上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液, 使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB增菌液中，30C培养24h，吸O.lmlLB i
增菌液到LR增菌液中，30C培养24h。

二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37 C培养24h,观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。

（国标上使用的选择性培养基是MM,A 但是其选择性不强,科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。

此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）
三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM, 25C培养3---5d ,观察伞状生长情况、TSI （三糖铁）斜面30C培养24h—48h,观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S不产气的培养物•
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。

单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则

单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则1、目的根据《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验进行单核细胞增生李斯特氏菌检验。

2、适用范围适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。

3、职责检测人员负责按照本规程对被测样品进行检测；校核人员负责对检测操作人员是否规范以及检测结果是否准确进行审核；授权签字人负责综合管理和检测报告的签发。

4、试剂及器材4.1 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株4.2 马红球菌4.3 小白鼠：16-18g4.4 TSB-YE4.5 TSA-YE4.6 EB增菌液4.7 李氏增菌液（LB1，LB2）4.8 三糖铁琼脂4.9SIM动力培养基4.10 琼脂4.11 改良的Mc Bride琼脂（MMA）4.12 硝酸盐培养基4.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水4.14 糖发酵培养基4.15 过氧化氢4.16 1%盐酸丫啶黄溶液4.17 1%萘啶酮酸盐溶液5、仪器设备5.1 恒温培养箱：30±1℃、24℃±1℃5.2 恒温水浴锅：46±1℃5.3 离心机：4000r/min5.4 显微镜5.5 均质器6、检测步骤6.1样品的收集及处理：无菌取样25g（ml）放灭菌均质器中加225mlEB和LB1增菌液中，充分搅拌成均质。

如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。

6.2增菌培养：EB增菌液30℃培养48小时，LB1增菌液225ml放30℃培养24小时，吸取0.1ml，加入10ml LB2增菌液中二次增菌。

6.3分离培养：将EB增菌液和LB2二次增菌分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30℃48小时，挑选可疑菌落，用白织灯45。

角斜光照射平板。

6.4选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁琼脂和SIM动力培养基，培养于25℃。

一般观察2天-7天，阳性者可做下一步鉴定。

6.5纯培养：将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于TSA-YE上纯培养，做以下鉴定。

单核细胞增生李斯特氏菌国家标准检验方法的验证与探讨

斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌菌落形
态与单增李斯特氏菌相似，只是菌落
周围没有水解圈。
2.2 菌株生化特征
实验样品及四种李斯特氏菌标准
菌株生化反应中，与葡萄糖、MR-VP、
麦芽糖、七叶苷、甘露醇等具有相同
的反应结果。另外，与木糖反应结果中，
除伊氏李斯特氏菌的木糖反应为阳
性，其他都为阴性。其中，通过溶血
反应区分单增细胞李斯特氏菌和英诺
关键词：李斯特氏菌；方法验证；生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是李斯特氏菌属中唯一具有致病性，也是致病力最强的细菌，是一种人畜共患的病原菌。它可以穿过宿主三个屏障，即肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，然其引起的疾病的发生率不高，但死亡率可达 20%~30%[1]。单增李斯特氏菌易于在冷藏食品中存活，是对人类健康危害最大的一种。在 4 ℃的储存条件下依然能够生存繁殖，主要存在于牛奶、乳制品、生牛排、羊肉、腌腊食品、西红柿、沙拉、水产品等中。在我国，食品中单增李斯特菌要求为不得检出。
按国家标准检验检测方法 GB4789.30-2010[2]。首先使用酒精灯对样品表面进行烧灼消毒，之后用无菌剪刀切割并取样 25 g 深层肌肉，然后加入 225 mL LB1 增菌液，30 ℃ 培养 24 h。取 0.1 mL，转种于 10 mL LB2 增菌液内，30 ℃培养 24 h。在李斯特氏菌显色平板以及 PALCAM 平板上，通过接种环将 LB2 增菌液以划线方式接种，并于 36 ℃环境中培养 24~48 h；同时，接种单增李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、马红球菌标准菌株 [3]，分别作为阳性对照和阴性对照。从李斯特氏菌显色平板、PALCAM 琼脂平板上取 5 个以上的可疑菌落，然后，将菌落接种于木糖、鼠李糖中，在 36 ℃条件下培养 24 h；并在 TSA-YE 培养基上纯培养后，再按照染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验和协同溶血试验的顺序进行操作。最后，使用李斯特氏菌属鉴定试剂盒和全自动微生物生化鉴定仪鉴定了 TSA-YE 上纯培养的菌株。

食品微生物检验——单增李斯特菌

食品微生物检验——单增李斯特菌食品中单增李斯特检测技术李斯特氏菌属包括七个种：单核细胞增生李斯特氏菌绵羊李斯特氏菌英诺克李斯特氏菌威尔斯李斯特氏菌西尔李斯特氏菌格氏李斯特氏菌默氏李斯特氏菌其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。

单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。

它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх 1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状。

兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性。

该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。

该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2－5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。

该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8－4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。

在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。

在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。

在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45度角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。

该菌触酶阳性，氧化酶阴性。

发酵多种糖类，产酸不产气。

如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。

食品中单增李斯特菌检测

食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测实验目的1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。

2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。

基本原理单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。

单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。

李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。

此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。

人也可作为无症状携带者。

据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。

李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。

该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5µm ´0.5～2.0µm。

多单在，有时是V字型排列。

无芽孢，不产生荚膜。

在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20µm或更长的丝状。

在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。

本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。

对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。

加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。

在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。

在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。

在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。

不形成菌环、菌膜。

在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。

MM FS CNJ 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法

MM_FS_CNJ_0344出口食品单核细胞增生李斯特氏菌斜射光镜MM_FS_CNJ_0344出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法1.适用范围本方法适用于牛乳、乳制品、水产品、肉及肉制品食品。

其他食品可参照采用。

2.原理概要单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。

在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）、选择性培养基（MMA）等平板上用45°角斜射光照射可观察到蓝色菌落；水解七叶苷并与柠檬酸铁铵反应产生黑色菌落。

3.主要试剂和仪器3.1.主要试剂（包括培养基）胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB－YE）（见B1）；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）（见B2）；增菌培养液（EB）（见B3）；选择性培养基（MMA）（见B4）；牛津琼脂（见B5）；改良缓冲蛋白胨水（MBP）（见B6）；7％羊血琼脂（见B7）；糖发酵培养基（见B8）；半固体琼脂；尿素琼脂；硝酸盐培养基；MR－VP培养基；三糖铁琼脂（TSI）。

胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）；盐酸吖啶黄素；萘啶酮酸；复达新；甘氨酸酐；氯化锂；苯乙醇；放线菌酮；多粘菌素E；头孢双硫唑甲氧；磷霉素；柠檬酸铁铵；七叶苷；酚红；D－葡萄糖；D－甘露醇；哥伦比亚琼脂；酵母浸膏；牛肉浸膏。

3.2.仪器微生物学实验室常用设备；解剖镜；斜射灯；平面镜。

4.过程简述4.1.样品如为冷冻食品，应于2～5℃解冻，且不超过18h，若不能及时检验，应置于－15℃保存。

非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。

4.2.前增菌和增菌4.2.1.前增菌：巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品，冻肉及其它加工食品均应进行前增菌。

无菌操作称取25g样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP）的均质杯内，高速均质1～2min，制成1∶10样品匀液，转入500mL广口瓶内；液体食品可用吸管吸取25mL样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP）的广口内，充分振摇制成1∶10样品匀液，于30℃培养24、48h。

牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立

牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一,导致食源性疾病的有病原微生物、寄生虫及其代谢产物、天然毒素以及化学性有毒有害物质等等。

微生物引起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。

在发达国家70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的,在我国甚至达到90%;引起沙门氏菌中毒的食品中,蛋类、奶类等动物性产品约占90%,沙门氏菌生存能力较强,可在乳制品中生存几个月。

单增李斯特菌广泛存在于自然界中,且在冷藏温度4℃下依然能够生长,引起单增李斯特菌食物中毒的食品主要有:奶及奶制品、肉制品、水产品、蔬菜及水果,其中以乳制品最为常见,单增李斯特菌能够给高风险人群带来严重的感染性疾病。

志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引起人类细菌性痢疾中最为常见的食源性致病菌,该菌也是食品卫生相关法规及标准中要求必须检测的项目之一。

本文以牛奶中常见的食源性致病菌单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌种,利用环介导等温扩增技术和高分辨率熔解曲线技术建立了多重LAMP检测体系和多重HAND-HRM检测体系,结果如下:1.针对单增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H(ipaH)序列的高度保守序列设计引物,通过引物筛选分别建立了三种食源性致病菌的LAMP反应体系。

进一步经过引物筛选,及对影响反应效率和特异性的镁离子浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化,建立了多重LAMP反应体系。

对多重LAMP反应体系进行特异性和灵敏度检测。

在特异性检测中含有目标菌的模板出现扩增,空白对照和非目标菌均未发生特异性扩增,提示该多重LAMP反应体系特异性强。

在灵敏度检测中单增李斯特菌的灵敏度为23fg/μl,沙门氏菌和志贺氏菌的灵敏度为250fg/μl,相较PCR灵敏度提高了一个数量级。

将三种致病菌菌液稀释成不同浓度,并污染牛奶样品,煮沸法提取基因组DNA,进行多重LAMP检测。

4789.18乳与乳制品检验

检样的处理
1. 乳及液态乳制品的处理:将检样摇匀，以无菌操作开
启包装。塑料或纸盒（袋）装，用75 %酒精棉球消毒盒盖或袋口，用灭菌剪刀切开；玻璃瓶装，以无菌操作去掉瓶口的纸罩或瓶盖，瓶口经火焰消毒。用灭菌吸管吸取25 mL（液态乳中添加固体颗粒状物的，应均质后取样）检样，放入装有225 mL灭菌生理盐水的锥形瓶内,振摇均匀。 2. 炼乳:清洁瓶或罐的表面，再用点燃的酒精棉球消毒瓶或罐口周围，然后用灭菌的开罐器打开瓶或罐，以无菌手续称取25 g检样, 放入预热至45 ℃的装有225 mL灭菌生理盐水（或其他增菌液）的锥形瓶中，振摇均匀。
8.4±0.2的磷酸氢二钾缓冲液稀释。对于含较高淀粉的特
殊配方乳粉，可使用α-淀粉酶降低溶液粘度，或将稀释液加倍以降低溶液粘度。
检样的处理
6. 酪蛋白和酪蛋白酸盐: 以无菌操作，称取25 g检样，按照产品不同，分别
加入225 mL灭菌生理盐水等稀释液或增菌液。在对粘稠的样品溶液进行梯度稀释时，应在无菌条件下反复多次吹打吸管，尽量将粘附在吸管内壁的样品转移到溶液中。 – 酸法工艺生产的酪蛋白：使用磷酸氢二钾缓冲液并加入消泡剂，在pH 8.4±0.2的条件下溶解样品。 – 凝乳酶法工艺生产的酪蛋白：使用磷酸氢二钾缓冲液并加入消泡剂，在 pH 7.5±0.2的条件下溶解样品，室温静置15 min。必要时在灭菌的匀浆袋中均质2 min，再静置5 min后检测。 – 酪蛋白酸盐：使用磷酸氢二钾缓冲液在pH 7.5±0.2的条件下溶解样品。
6. 乳粉、乳清粉、乳糖、酪乳粉的采样
– 原包装小于或等于500 g的制品：取相同批次的最小零售原包装，采样量不小于5倍或以上检验单位的样品。 – 原包装大于500 g的制品：将洁净、干燥的采样钻沿包装容器切口方向往下，匀速穿入底部。当采样钻到达容器底部时，将采样钻旋转180°，抽出采样钻并将采集的样品转入样品容器。采样量不小于5倍或以上检验单位的样品。