SGS食品微生物FDA与ISO方法

�
产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可 以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使 发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有 疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步 试验。
21
大肠杆菌测定——革兰氏染色
Gram negative
Gram positive
Gram straining
22
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本步骤：
� � � 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染 1min ，水洗； 滴加革兰氏碘液，作用 1min ，水洗； 滴加95% 乙醇脱色约 15 ～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱 色，水洗； 滴加番红复染液，复染 1min ，水洗、待干、镜检。 结果：革兰氏阳性菌呈 紫色，革兰氏阴性菌呈 红色。
�
所有平板的菌落数都不足 25CFU ，报告EAPC/ml （g）为＜25*1/d 。 EAPC ：estimated aerobic plate count
� �
所有平板的菌落数都超过 250CFU ，但不足 100/cm 2 ，报告EAPC/ml （g ）为最接近 250CFU 的平板菌落数 的估计值，乘以相应的稀释度。 所有平板的菌落数都超过 100/cm 2 ，计算平板的面积（直径为 90mm 的平板面积为 65cm 2 ），估计最高稀 释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告 EAPC/ml （g ）为＞ 65*100* 1/d。 无法计数的平板报告 LA （Laboratory Accident ）。 最终结果保留前两位有效数字。按照 4 舍6入， 5是奇进偶不进。
15
大肠杆菌的生物学特性
培养特性：
� 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为 37 ℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围 15-46 ℃。
�
在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。
�
�
10
大肠菌群的定义
� 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 � 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有 关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血 清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（ 俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
�
大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该 菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行 HACCP 管理中，将大肠杆菌检测作为微 生物污染状况的监测指标和 HACCP 实施效果的评估指标。
14
大肠杆菌的生物学特性
基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约 0.5-0.8 μm*1.0-3.0 μm， 多单独存在或成双，但不呈长链排列。约 50% 的菌株有周生鞭 毛，但多数只有 1-4 根，一般不超过 10 根，故菌体动力弱。多 数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱 性染料着色良好，革兰氏染色阴性。
3
菌落总数测定——卫生学意义
� �
判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 及时反映食品加工过程是否符合 卫生要求，为被检食品卫生学评 价提供依据。
�
通常认为，食品中细菌数量越多， 则可考虑致病菌污染的可能性越 大，菌落总数的多少在一定程度 上标志着食品卫生质量的优劣。
4
FDA BAM 菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml 稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL 分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（ PCA） 35 ℃ ，48 ± 2h 菌落计数
5
FDA BAM 菌落计数方法
�
选择25~250CFU 之间的菌落进行计数，计算公式如下： N=∑ C/（1*n 1+0.1*n2）*d
16
大肠菌群及大肠杆菌测定 —— MPN法检验流程（ FDA BAM ）
检样 50g+450ml稀释液 适当十倍稀释样品 选择 3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管 LST肉汤（每管 9mlLST肉汤并加有导管）， 每管接种 1mL 35 没有产气管 报告阴性 接种BGLB 肉汤管
� �
23
大肠杆菌测定——生化鉴定
Test Indole MR V-P
positive 红色环 红色 玫瑰红色环 生长
negative 不变色 不变色 不变色 不生长
biotype1 + + -
biotype2 + -
reagent
Kovacs’ 甲基红
� 食品微生物检验方法
1
内容提要
� 菌落总数检测 � 大肠菌群及大肠杆菌检测 � 金黄色葡萄球菌检测 � 沙门氏菌检测 � 单核细胞增生李斯特氏菌检测
2
菌落总数测定——菌落总数的概念
� 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积 （cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所 生成的菌落的总数。
� �
6
ISO4833-2003 菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml 稀释液（磷酸盐缓冲液 ）
适当十倍稀释样品
选择 2~3个连续适宜稀释度 各取 1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行）
如果怀疑样品中含有在 培养基表面蔓延生长的 菌落，待琼脂凝固后， 4mL ） 在其上覆盖一层（ 在其上覆盖一层（4mL 4mL） 水琼脂。
每皿内加入适量（ 12~15mL） 平板计数琼脂（ PCA），
30±1 ℃ ， 72 ±3 h
菌落计数
平板叠放不 超过6个
7
ISO4833-2003菌落0CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如 下： N=∑C/（n1+0.1*n2）*d � 所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：NE =m 固体样品： NE=m×d-1 � 无菌生长：液体样品：less than 1; � 最终结果保留前两位有效数字。 固体样品：less than 1 ×d-1
�
初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是 否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可 维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许 “缓慢乳糖发酵 （Slow lactose fermentations ）”来促进菌体产气。BGLB 中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和 除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。 有数据表明 ，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证 实试验是必需的。
11
大肠杆菌的定义
� 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 � 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、 IMViC 试验（靛基质、MR、VP、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。 � 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ ETEC） 、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、 黏附性大肠杆菌（EAEC）。
9
菌落总数测定几点要求
�
每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过 15min ，主要为防止细菌增殖和产生片 状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间 放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。 检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时， 检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在 检验操作过程中有无受到来自空气的污染。 检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合 的平皿，不经培养，于 4 ℃放置，以便在计数检样时用作对照。
17
大肠菌群测定 ——MPN 法检验几点说明
�
MPN检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培 养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。 MPN 检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加 10倍。
12
大肠菌群和大肠杆菌的关系
耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中35/37 ℃ 培养48h产酸产 气，并在44.5℃培养24h产酸产气的细菌（依据ISO 标准）
13
卫生学意义
� �
大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的 食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性 的大小。
18
大肠杆菌测定 ——EMB选择性分离鉴别