重组小鼠 IL-33成熟蛋白的原核表达、纯化及活性检测
约氏疟原虫丝苏氨酸磷酸酶5抗血清对有性阶段生长抑制作用的研究
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2020.23.001-基础免疫学•约氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶5抗血清对有性阶段生长抑制作用的研究①周丹于园超洪明阳朱晓彤崔立旺(中国医科大学免疫学教研室，沈阳110122)中图分类号R382.3T文献标志码A文章编号1000484X(2020)23-28174)5［摘要］目的:探讨约氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶5(PyPP5)作为传播阻断疫苗候选抗原的可行性。
方法:PCR扩增PyPP5蛋白优势抗原表位,克隆入pET32a(+)载体。
IPTG诱导PyPP5重组蛋白(rPyPP5)表达后，纯化并免疫小鼠获取抗血清。
体外实验观察抗-PyPP5免疫血清对配子体出丝、动合子形成和转化率的影响。
结果:成功制备抗-PyPP5免疫血清。
抗-PyPP5免疫血清(1:5倍稀释)使配子体出丝率、动合子数目和动合子转化率分别下降29.89%(P<0.05),38.59%(P<0.05)和64.30%(P<0.01)。
结论:PyPP5蛋白具有良好的抗原性。
抗-PyPP5免疫血清可有效抑制约氏疟原虫传播。
［关键词］约氏疟原虫;丝/苏氨酸蛋白磷酸酶5；传播阻断疫苗;有性阶段Inhibitive effect of Plasmodium yoelii serine/threonine phosphatase5on sexual stage developmentZHOU Dan,YU Yuan-Chao,HONG Ming-Yang,ZHU Xiao-Tong,CUI Li-Wang.Department of Immunology,China Medical University, Shenyang110122,China[Abstract]Objective:To investigate the possibility of selecting Plasmodium yoeli serine/threonine phosphatase5(PyPP5)as a transmission blocking vaccine candidate.Methods:PCR amplified the dominant antigen epitopes of PyPP5protein and cloned into pET32a(+)vector.The recombinant PyPP5(rPyPP5)protein was induced by IPTG,purified and immunized mice to obtain anti-PyPP5serum.The effects of anti-PyPP5serum on gametocyte exflagellation,ookinete formation and ookinete conversion rate were observed in vitro.Results:Anti-PyPP5serum was successfully prepared.Anti-PyPP5serum(at1:5dilution)decreased gametocyte exflagellation,the number of ookinete and the ookinete conversion rate by29.89%(P<0.05),38.59%(P<0.05)and64.30%(P< 0.01).Conclusion:PyPP5protein has good antigenicity.Anti-PyPP5serum can effectively block the transmission of Plasmodium yoelii.[Key words]Plasmodium yoelii；Serine/threonine protein phosphatase5；Transmission blocking vaccine；Sexual stage蛋白质可逆磷酸化修饰是存在于所有生物体的重要生理机制，在细胞信号通路传导和细胞周期调控中至关重要。
人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测
里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。
刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。
方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。
结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ—ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。
ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。
结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。
关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅＬ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｌｎ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＷ８８ｐｕｎｆｉｅｄｂｙＮｉ・ＮＴＡａⅡｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｍａｔａｎｔａｄｉｐｏｎｅｅｆｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈ０８ｐｈａｔｏｎｅｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄ出啦ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥｓＴ４２ｆ戬啦＿ａｄｉｐ叫ｅｃ血ｗ啦ｅｍａｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｐｕｒｉｆｉｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｓｈｏｗｅｄａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｋｏ”６一ｐｈ０８ｐｈａｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｅｈａｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｖ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测徐岚;肖斌;陈慧芹;李晓荣;郝文波【摘要】The objective of this work is to construct a eukaryotic expression vector for the C-Src tyrosine kinase(Csk)gene from human. Total RNA was extracted from HeLa cells. The full-length cDNA sequence of Csk gene was isolated and amplified via RT-PCR,and cloned into a eukaryotic expression vector pENTER,the recombinant pENTER-Csk-his plasmid was constructed. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells,after 48 hours,the expression levels of Csk protein were determined by SDS-PAGE and Western blot. The localization of Csk protein was detected via indirect immunofluorescence,and the protein Csk was purified by nickel chelate beads;in addition,the activity of the protein was measured via his-pulldown and CO-IP. Results showed that:Double digestion and sequencing reveled that recombinant plasmid pENTER-Csk-his was constructed properly without mutation. Both SDS-PAGE and Western blot detected a 51 kD protein,indicating that Csk protein was expressed successfully in the 239T cells. The indirect immunofluorescence confirmed the expression of Csk protein in cytoplasm. Finally,the purified protein Csk by nickel chelate beads interacted with the IGF1R and SHC1 by his-pulldown and CO-IP. Conclusively,this study successfully acquired the full-length sequence of Csk,the eukaryotic expression vector pENTER-Csk-his was constructed,and the gene was expressed efficiently in 293T cells,moreover,the expressed protein presented bioactivity.%旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。
FANCJ在HEK293T细胞中的表达 、纯化及活性检测
FANCJ在HEK293T细胞中的表达、纯化及活性检测袁濮玉;刘松柏;撖荣;杜佳慧;储小玲;吴洁;杨凡;苏倩;邱桥成;薛胜利【摘要】目的构建包含FANCJ野生型(wt)及其突变体N196S蛋白的真核表达载体,并对纯化的野生型蛋白及突变体蛋白进行活性检测.方法从HEK293T中提取RNA,并反转录为cDNA,使用带有3xFlag标签序列的特异性引物通过PCR方法扩增出人FANCJ编码区全长,并克隆到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上;突变体N196S利用NEBaseChangerTM引物设计工具,并利用NEB公司的点突变构建试剂盒Q5?Site-Directed Mutagenesis Kit技术进行操作.重组的FANCJ及突变体N196S表达质粒通过脂质体polyJet转染到HEK293T细胞中进行表达.使用免疫沉淀及竞争洗脱的方法纯化FANCJ及N196S突变体蛋白.利用荧光标记DNA底物的方法检测FANCJ及N196S突变体蛋白的DNA解旋酶活性.结果 FANCJw t 基因及N196S突变体全长编码序列成功构建到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上,蛋白质印迹法(Western blot)及PAGE胶银染方法成功检测到了FANCJwt及N196S突变体蛋白的表达、纯化,荧光标记Oligo DNA底物方法发现FANCJwt 与N196S突变体蛋白DNA解旋酶活性存在差异.结论成功构建了FANCJwt及N196S突变体真核表达载体,通过生化实验发现FANCJ及N196S突变体蛋白存在差异的DNA解旋酶活性.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2018(047)036【总页数】4页(P4584-4587)【关键词】FANCJ;突变体;蛋白纯化;活性检测【作者】袁濮玉;刘松柏;撖荣;杜佳慧;储小玲;吴洁;杨凡;苏倩;邱桥成;薛胜利【作者单位】苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006【正文语种】中文【中图分类】Q814.1FANCJ(Fanconi anemia complementation group J)基因编码的蛋白是第1个被确认的同乳腺癌相关肿瘤抑制因子BRCA1(breast cancer 1,early onset)相结合的蛋白，因此其最初被命名为BRCA1结合的C端解旋酶(BRCA1-associated C-terminal helicase1， BACH1)；随后又被命名为BRCA1相互影响的蛋白C端解旋酶(BRCA1 interacting protein cterminal helicase 1，BRIP1)以避免同具有类似名称的转录因子相混淆；而近年来该蛋白被发现是范可尼贫血(fanconi anemia，FA)通路的成员之一，故被称为FANCJ蛋白[1-3]。
MicroRNA
人脂联素原核表达纯化及活性检测
人脂联素原核表达纯化及活性检测王云龙;刘旺根;梁晓艳;李永超;昌静峰;李玉林;王国强;邓黎黎;陈冬焕;董彩文;孙新城【摘要】为了克隆人脂联素基因(ACRP30),获得有免疫活性的重组人脂联素,以人皮下脂肪组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到ACRP30基因.构建重组质粒pET-CKS-ACRP30,转化表达茵BL21(DE3),以IPTG诱导表达人脂联素重组蛋白,利用镍亲和层析纯化,Western blot鉴定其活性,双抗体夹心法检测其免疫活性.获得了人脂联素基因,表达纯化了人脂联素融合蛋白,融合蛋白分子质量约为50 ku,表达量约占茵体总蛋白的30％,纯度达到90％,双抗体夹心法检测重组蛋白具有免疫活性.本研究成功表达了人脂联素重组蛋白且表达产物具有免疫活性,为人脂联素检测技术的建立奠定了基础.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2011(032)010【总页数】4页(P36-39)【关键词】人脂联素;原核表达;免疫活性【作者】王云龙;刘旺根;梁晓艳;李永超;昌静峰;李玉林;王国强;邓黎黎;陈冬焕;董彩文;孙新城【作者单位】河南工业大学,河南郑州450001;郑州职业技术学院,河南郑州450121;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南工业大学,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001;河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001【正文语种】中文【中图分类】Q789脂联素（adiponectin）是由脂肪细胞分泌的一种细胞因子，具有抗动脉粥样硬化、调节脂肪酸氧化和糖代谢、增加胰岛素敏感性、抑制肝糖产生、抑制反馈TNF－α的生成与释放，对损伤的肝细胞有重要的保护［1－3］。
杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具
杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具刘拂晓1,2 柳增善2 王志亮1【摘要】杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。
相对于其他表达系统，杆状病毒表达系统具有特殊的优势：杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因；杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋白的表达；昆虫细胞作为受体能够对外源蛋白进行加工修饰；杆状病毒通常只感染节肢动物，不会对人畜构成危害。
因此，该系统越来越受到人们的重视，并已应用于亚单位疫苗的研发与生产，特别其对于构建病毒样颗粒，即由一种或多种病毒结构蛋白自行装配而成且不含病毒基因组的蛋白颗粒，具有不可比拟的优势。
对此做详细评述并展望病毒样颗粒疫苗的发展趋势。
【期刊名称】生物技术通报【年(卷),期】2012(000)006【总页数】7【关键词】杆状病毒昆虫细胞病毒样颗粒杆状病毒表达系统疫苗1983年，Smith等［2］成功实践了美国学者Miller的提出的杆状病毒作为载体在昆虫细胞中表达外源基因的可行性理论：他们将干扰素基因插入至苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californi-ca nuclear polyhedrosis virus，AcNPV）表达载体，然后将其转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf）细胞，成功表达了具有生物活性的人β干扰素。
此后，杆状病毒蛋白表达技术逐步建立并完善起来。
相对于传统大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞蛋白表达技术，杆状病毒技术在病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）的构建及应用方面具有不可比拟的优势。
VLP是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，高度模仿真实病毒的衣壳空间构象而不含其基因组。
大多数VLP 是良好的免疫原，既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫［3-5］。
随着杆状病毒蛋白表达技术的成熟，利用其构建VLP的报道也屡见不鲜。
1 杆状病毒分子生物学根据国际病毒分类委员会最新病毒分类报告，杆状病毒科（Baculoviridae）分为4个属，即α杆状病毒属（Alphabaculovirus）、β杆状病毒属（Betabaculovirus）、δ杆状病毒属（Deltabaculovirus）、γ杆状病毒属（Gammabaculovirus）。
外源性IL-33在体外模拟糖尿病条件下抑制心肌成纤维细胞胶原蛋白的表达
外源性IL-33在体外模拟糖尿病条件下抑制心肌成纤维细胞胶原蛋白的表达王好;陶艾彬;张国辉;芮涛;陈永昌【摘要】目的：探索体外模拟糖尿病状态下外源性IL-33对心肌成纤维细胞的作用。
方法：体外分离培养新生乳鼠心脏成纤维细胞，设立对照组（DMEM／F12＋30 mmol／L甘露醇），高糖组（DMEM／F12＋30 mmol／L葡萄糖），高糖＋高迁移率族蛋白1（HMGB1）组（1μg／mL），高糖＋HMGB1＋IL-33组（3 ng／mL）。
经不同处理后，蛋白质印迹检测胶原蛋白Ⅰ、IL-33、二酰基甘油激酶ζ（DGKζ）表达量的变化；ELISA检测二酰基甘油（DAG）的分泌释放，以及蛋白激酶Cβ（PKCβ）活性的改变。
结果：心肌成纤维细胞经高糖处理后胶原蛋白Ⅰ生成增加，IL-33产量降低，HMGB1使上述情况进一步加剧，心肌细胞内DGKζ的表达下调，引起DAG的升高，并进一步促进PKCβ的激活，引发心肌纤维化。
加入外源性IL-33对上述过程具有抑制作用，可抗心肌纤维化。
结论：外源性IL-33在心肌成纤维细胞模拟糖尿病状态下起抗纤维化作用。
%Objective:To investigate the role of IL-33 on cardiac fibrosis under high glucose treatment on cardiac fibroblasts.Methods:Isolated rat cardiac fibroblasts were divided into following groups:control (DMEM/F1 2+30 mmol/L mannitol),high glucose(DMEM/F1 2 +30 mmol/L glucose),high glucose+HMGB1 (1 μg/mL),high glucose +HMGB1 +IL-33 (3 ng/mL).The expression of the collagen I,IL-33 and DGKζin the cardiac fibroblasts were evaluated by western blotting.The DAG and the activity of PKCβwas detected by ELISA.Results:When cardiac fibroblasts challenged with high glucose,the collagen I gen-eration was increased and the production of IL-33 was decreased.The effect of high glucose was exaggerated byHMGB1 .In addition,the DGKζexpression was decreased,DAG content was increased and further pro-moted the activation of PKCβ.Exogenous IL-33 attenuated above effects.Conclusion:Exogenous IL-33 plays a key role in anti-cardiac fibrosis induced by high glucose.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(026)005【总页数】4页(P380-383)【关键词】IL-33;糖尿病心肌病;心肌成纤维细胞;胶原蛋白;纤维化【作者】王好;陶艾彬;张国辉;芮涛;陈永昌【作者单位】江苏大学附属人民医院心内科，江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科，江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科，江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院心内科，江苏镇江212002;江苏大学医学院，江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】R542.23糖尿病心肌病是糖尿病的常见并发症之一，其临床诊断是基于糖尿病患者独立于冠心病、高血压等器质性心脏病而出现的心功能不全［1］。
紫贻贝LC3B蛋白的原核表达及抗血清制备
紫贻贝LC3B蛋白的原核表达及抗血清制备余振兴;朱倩;姚翠鸾【摘要】LC3B是检测自噬程度的标志性分子,但是在低等动物体内缺少特异性强的LC3B抗体.为研究贝类的自噬性细胞死亡,本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆到pET-32a原核表达载体中构建重组表达载体,进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进行摸索;采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,并采用SDS-PAGE检测及Western blot进行验证;利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体.结果显示,在20℃,转速为150 r/min条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导表达10h后,可以得到高表达量、可溶性的重组MgLC3B-His融合蛋白,亲和层析纯化后,获得单一条带的MgLC3B-His可溶性重组蛋白;采用纯化后的MgLC3B-His融合蛋白对新西兰兔进行多次免疫,采集分离兔抗血清并利用proteinA纯化,获得紫贻贝的LC3B多克隆抗体,效价为25 600.紫贻贝LC3B多克隆抗体的成功制备,为今后深入开展紫贻贝及相近物种的细胞自噬研究奠定了基础.%Autophagy is a cellular process for degradation of damaged proteins and organelles via forming autophagosome.Microtubule-associated protein 1 light chain 3 B (LC3B) is a marker protein for autophagy detection.However,in many lower animals,autophagy detection is limited for a lack of available specific LC3B antibody.In the present study,the coding sequence of LC3B ofMytilus galloprovincialis was cloned and inserted into a pET-32a prokaryotic expression vector.To obtain a high-level and soluble expression of recombinant MgLC3B-His protein,the IPTG concentration and induction time were investigated.Then,the purification conditions of this recombinant protein were also studied.Our results showed that MgLC3Bwas inserted in the pET-32a prokaryotic expression vector successfully.The recombinant MgLC3B-His protein was induced at 20 ℃,150 r/min with IPTG concentration of 0.6 mmol/L after 10 h culture.A single-band recombinant protein was obtained after affinity purification.After immune injection,and the rabbit polyclonal antibody was also obtained,with a titer of 25 600.Therefore,our results will be helpful for the investigation of autophagy in mussels and similar species.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2017(041)004【总页数】8页(P498-505)【关键词】紫贻贝;LC3B;重组表达;细胞自噬;多克隆抗体【作者】余振兴;朱倩;姚翠鸾【作者单位】集美大学水产学院,福建厦门361021;集美大学水产学院,福建厦门361021;集美大学水产学院,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q785;S917.4细胞自噬是细胞死亡的重要调控方式之一。
IL-33在中枢神经系统中的作用及其与疾病关系的研究进展
IL-33在中枢神经系统中的作用及其与疾病关系的研究进展刘红超;刘晶瑶;冯学敏【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2016(020)008【总页数】3页(P1396-1398)【作者】刘红超;刘晶瑶;冯学敏【作者单位】吉林大学白求恩第一医院二部神经内科，吉林长春 130031;吉林大学白求恩第一医院二部神经内科，吉林长春 130031;吉林大学白求恩第一医院二部神经内科，吉林长春 130031【正文语种】中文IL-33作为白介素的家族成员于2005年被发现，早在1989年其受体ST2已被发现[2]。
近年的研究对IL-33的功能已经有了明确的认识，IL-33/ST2信号系统通过胞内信号转导，参与多种疾病的发生与发展。
IL-33与中枢神经系统疾病的关系以往研究较少，但近年来越来越多的学者对此进行了临床研究。
在中枢神经系统，IL-33是通过小胶质细胞和诱导炎症因子和炎症趋化因子起作用的一种促炎介质，它是一种神经保护因子还是具有神经毒性则取决于受损组织条件[3]。
本文旨在阐述IL-33的生物学活性，以及针对中枢神经系统等疾病进行简要综述，为今后的临床研究提供参考。
IL-1受体(IL-1R)3种，分别为IL-1RI,IL-1RII和IL-1R辅助蛋白(IL-1RAcP)。
而IL-33的受体复合物却是由IL-1RAcP和ST2[4]组成。
其中IL-33在体内起诱导作用主要由IL-1RAcP来完成。
ST2基因共编码了两种蛋白：跨膜形式蛋白(ST2L)和可溶性蛋白(可溶性ST2)，它们都是由前mRNA选择性剪切而产生，同时ST2基因也是IL-1受体家族成员之一。
IL-33是ST2的配体[1]，同时它还是一种核因子，主要起到两方面的作用：转录因子的作用和细胞因子的作用。
细胞因子的作用主要体现它可结合周围细胞或是分泌细胞自身的受体分子而起到相应的作用。
ST2由两条链共同组成，它们的作用分别为与配体的结合和活化信号到胞内的传导。
重组缓释白介素4的克隆表达与鉴定
重组缓释白介素4的克隆表达与鉴定张冲;黄子珂;李思光【摘要】目的重组表达可以缓释的抗炎因子白介素4(Interleukin 4,IL-4).方法根据小鼠IL-4的氨基酸序列,并基于大肠杆菌密码子偏爱性合成IL-4的基因,通过聚合酶链式反应(PCR)方法将胶原蛋白结合域(collagen binding domain,CBD)的编码序列和组氨酸标签序列连接到IL-4基因上,运用无缝克隆技术将上述重组基因插入pET-30a(+)载体.重组蛋白通过组氨酸标签进行纯化,纯化的蛋白被用于诱导M0巨噬细胞分化成M2巨噬细胞,同时检测M2巨噬细胞相关基因表达以及对白介素10(Interleukin 10,IL10)的分泌.与Ⅰ型胶原蛋白的联用验证胶原蛋白对重组因子的吸附和缓释功能.结果带有CBD序列和组氨酸纯化标签的IL-4通过镍柱纯化,具有与商业化IL-4相似的生物活性.功能实验证实其能够被胶原蛋白吸附,并能脱离胶原蛋白缓释.结论通过大肠杆菌表达纯化获得了能够缓释的抗炎因子IL-4.【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】6页(P28-33)【关键词】缓释;胶原蛋白结合域;白介素4;Ⅰ型胶原蛋白【作者】张冲;黄子珂;李思光【作者单位】同济大学医学院再生医学系,上海200092;同济大学医学院再生医学系,上海200092;同济大学医学院再生医学系,上海200092【正文语种】中文【中图分类】R34CBD的氨基酸序列TKKTLRT是胶原酶酶解Ⅰ型胶原蛋白的识别序列，能特异性地与Ⅰ型胶原上的α2链结合。
Ⅰ型胶原蛋白是目前最广泛使用的天然植入材料之一，通过将CBD序列重组到蛋白类药物上，使重组药物可以吸附在Ⅰ型胶原蛋白上，形成药物缓释系统，将蛋白类药物缓慢释放到局部环境中[2-4]。
因为Ⅰ型胶原蛋白是哺乳动物体内含量最高的蛋白，也有报道直接将重组蛋白直接注射到组织内，依靠自体胶原蛋白达到缓释的效果[3,6]。
PKB的PH结构域在原核表达及其纯化和活性
PKB的PH结构域在原核表达及其纯化和活性施冬云;魏廉;黄伟达;刘珊林;徐伯赢;申宗侯【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2002(029)006【摘要】目的利用原核系统表达原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶B(PKB)的PH结构域,为进一步研究其结构和功能奠定基础.方法我们构建了PKB的PH结构域的表达质粒,在大肠杆菌中表达出PH结构域,并利用蛋白N端加入的组氨酸标签进行亲和层析及离子交换层析纯化蛋白.结果在大肠杆菌中表达的PH结构域以包涵体形式存在,经变性和复性后成为具有天然构象的可溶性蛋白,经亲和层析和离子交换层析纯化的PH结构域具有与磷脂酰肌醇PI*.4,5*.P2的结合能力,证明其具有生物学活性.结论本方法成功表达纯化了PKB的PH结构域,可用作PH结构域结构和功能的进一步研究.【总页数】5页(P423-427)【作者】施冬云;魏廉;黄伟达;刘珊林;徐伯赢;申宗侯【作者单位】复旦大学医学院生化与分子生物学系,上海,200032;复旦大学医学院生化与分子生物学系,上海,200032;复旦大学生命科学学院生化系,上海,200433;复旦大学医学院生化与分子生物学系,上海,200032;复旦大学医学院生化与分子生物学系,上海,200032;复旦大学医学院生化与分子生物学系,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】Q55【相关文献】1.拟南芥Alpha-dioxygenase 1的原核表达、纯化及活性的检测 [J], 张小梅;韩念法;张美祥;李广录;范三红;郭蔼光2.小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样结构域的原核表达、纯化及活性鉴定 [J], 王伟;殷小涛;李云奇;田仁礼;阎瑾琦;高江平;于继云3.人fg12凝血酶原酶FRED结构域的原核表达、纯化及其凝血活性的鉴定 [J], 李学军;宋善俊;李永敢;阳文捷;许力;魏华萍4.人表皮生长因子受体结构域蛋白的原核表达、纯化及活性检测 [J], 郭靖;王涛;李齐宏;李玲;梁迎春;洪甜;梅国徽;冀全博;纪贝贝5.PUMA-BH3结构域短肽的原核表达、纯化及促凋亡活性鉴定 [J], 张宇雯;刘兴汉;林慧敏;李冀红;马洪星;刘远莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
TAT介导多肽药物过表达纯化和穿膜活性检测
TAT介导多肽药物过表达纯化和穿膜活性检测王中山;张梦;张美娴;陈淑漫;朱焘;方佳炜;杨静;戴毅【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2018(029)003【摘要】目的:获得NR2B羧基端多肽(NR2Pep),探讨TAT-NR2Pep在细胞中的跨膜特性.方法:利用酶切连接方法构建pWaldo-TAT-pep质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,检测不同浓度诱导剂和不同温度对蛋白质表达的影响;利用镍柱亲和层析及分子筛方法纯化TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,利用GFP发荧光的特性采用In-gel检测蛋白质的表达情况;以融合蛋白C端His标签特异性抗体,通过Western印迹确定融合蛋白的表达;荧光显微镜下观察TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白在CHO和C2C12等细胞中的跨膜活性.结果:构建了TAT-NR2Pep-GFP表达载体,重组菌经0.1 mmol/L IPTG于22℃诱导20 h能够表达较多高质量的目标蛋白;In-gel荧光检测证实融合蛋白TAT-NR2Pep-GFP拥有正确构象,GFP能够发出绿色荧光;Western印迹分析表明融合蛋白相对分子质量符合预期;细胞穿膜实验证实TAT能够介导多肽穿过细胞膜.结论:原核表达并纯化得到TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,该蛋白散发绿色荧光,能够穿过细胞膜.【总页数】5页(P340-344)【作者】王中山;张梦;张美娴;陈淑漫;朱焘;方佳炜;杨静;戴毅【作者单位】徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221004;徐州市中心医院,东南大学附属医院妇产科,江苏徐州221009;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004;徐州医科大学临床学院,江苏徐州221004;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.细胞穿膜肽TAT与小鼠干细胞转录因子Oct4融合表达及纯化 [J], 王军;雷楗勇;陈蕴;金坚2.Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性 [J], 关新刚;苏维恒;于欣;佟海滨;孙新3.重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测[J], 张睿;王晓杰;王怡;田海山;焦悦;高丽昌;李婷婷;李校堃4.TAT-N24穿膜融合多肽的表达与鉴定 [J], 王桂华;孙黎;邓豫;李小兰;曹小年;来森艳;陶德定;胡俊波5.穿膜肽介导苦荞金属硫蛋白的表达、纯化及抗氧化损伤作用 [J], 何永吉;李云龙;胡俊君;范晓军;李红梅;程哲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备的开题报告
pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备的开题报告一、研究背景XBP1（X-box binding protein 1）是一种在细胞内负责调节内质网（ER）应激反应的转录因子，在内质网应激（ER stress）发生时能够通过非常规剪切的方式产生活性的转录因子形式（XBP1u），并进一步调节众多靶基因的表达，以保证机体能够有效地适应外界环境的变化。
由于XBP1在疾病发生发展过程中起着重要的作用，因此对其进行深入的研究具有重要的意义。
而构建pET32a-XBP1u质粒系统并进行原核表达、纯化以及多克隆抗体制备是进行深入研究的前提和基础。
因此，本研究计划对pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备进行探究。
二、研究目的1. 利用pET32a-XBP1u质粒系统成功进行XBP1u的原核表达，并进行相关酶学检测和分析；2. 通过一系列的纯化步骤，获得高纯度的XBP1u蛋白；3. 制备高效、高特异性的XBP1u多克隆抗体，并进一步验证其特异性和识别能力。
三、研究内容及方法1. 构建pET32a-XBP1u质粒系统：对XBP1u编码区域的序列进行合成、克隆和验证，构建成pET32a-XBP1u质粒系统。
2. 原核表达和酶学活性检测：将pET32a-XBP1u质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，利用IPTG诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况，并通过酶学检测法分析蛋白的酶活性。
3. 蛋白的纯化：通过多步纯化，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，获得高纯度的XBP1u蛋白。
4. 抗体制备：利用高纯度的XBP1u蛋白免疫小鼠，产生多克隆抗体。
通过酶联免疫吸附实验（ELISA）和Western blot验证抗体特异性和识别能力。
四、研究意义1. 通过pET32a-XBP1u的构建和蛋白的表达，为深入研究XBP1u的分子机制提供了基础；2. 通过纯化获得高纯度的XBP1u蛋白，为后续的酶学研究、体外结合实验和晶体结构分析提供了可靠的物质基础；3. 成功制备出高效、高特异性的XBP1u多克隆抗体，为进一步研究XBP1u在疾病发生发展过程中的作用提供了可靠的试剂基础。
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ＤＥ ＮＧ Ｆ ａ ｎ ｇ — ｂ ｏ ，Ｓ ＵＮ Ｘｕ ｎ ，Ｗ Ａ ＮＧ Ｄａ — ｎ ａ ｎ，Ｌ Ｖ Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ — ｌ ｏ ｎ ｇ
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摘要 ：目的 为了在大肠埃希菌中表达具有生物学活的小 鼠 Ｉ Ｌ 一 ３ ３ 成熟蛋 白。方 法 利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术从 ｐ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ —
１ Ｌ 一 ３ ３ 质粒 中扩增小鼠 Ｉ Ｌ 一 ３ ３成熟蛋 白的基因 ， 将其插入原核表达载体 ｐ Ｅ Ｔ ２ １ ａ （ ＋ ） ， 构建成 ｐ Ｅ Ｔ ２ １ ａ — ｍ Ｉ Ｌ 一 ３ ３质粒 ， 转化 至大肠埃希菌 Ｂ Ｉ ２１ ， 筛选出可表达 ｍ ｌ Ｌ 一 ３ ３的大肠埃希菌工程菌株 。经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导表达 ， 用镍柱亲 和层 析法纯化 。结
activity白细胞介素33interleukin33il33是新近发现的细胞因子是il1家族成员且是il1受体家族成员st2的相应配体小鼠的il33由编码266个氨基酸组成其相对分子质量为29900il33蛋白需要加工以释放生物活性形式的成熟蛋白体外实验已证明il33全长蛋白可被半胱天冬氨酸蛋白酶1加工产生相对分子质量为18000il33成熟蛋白作为新近发现的细胞因子il33与哮喘究证实il33参与炎症性肠病的发生及进展同时也参与肠黏膜上皮的修复过程但其具体机制并不明确810为了进一步研究il33在炎症性肠病中的作用及其可能的作用机制实验通过基因工程的方法在大肠杆菌中高效表达出鼠il33成熟蛋白并对免疫学活性进行初步研究旨在为深入研究il33的免疫学作用及其分子机制奠定基础
果
经Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ分析获得纯度高达 ９ ５ ％的 ｍ ｌ Ｌ 一 ３ ３ 蛋 白， 相对分 子质量 １ ８ ０ ０ ０ 。Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ试验显示 ｍ Ｉ Ｌ 一 ３ ３可以有效
利用大肠埃
的促进肠系膜淋 巴细胞产生 Ｔ ｈ ２型细胞因子（ Ｉ Ｌ 一 ５ ） ， 与未处理组的差异具有显著的统计学意 义。结论 关键词 ： 白细胞介素 ３ ３ ； 原核 表达 ； 纯化 ； 检测； 活性 中图分 类号：Ｒ ３ ９ ２ ． １ １ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ５ ． ５ ６ ７ ３ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ５ ０ ０ １ ３ ０ ４
Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｉ ｍ ｍ ｕ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｓ ｈ ｅ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ １ １ ０ １ ２ ２ ，Ｌ ｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
朱俊 丰 一， 桑 力轩 ， 杨芳 丽 ， 李岩 ， 翟景 波 １ ．中国医科大学， 基础医学院免疫学教研室 ， 辽宁 沈阳 ， 高植鹏 ， 邓 芳博 ， 孙逊 ， 王 大 南 ， 吕昌龙
１ １ ０ １ ２ ２； ２ ．辽宁大学 ， 生命科学 学院 ， 辽宁 沈 阳 １ １ ０ ０ ３ ６
Ｄ ｏＩ ：１ ０ ． １ ３ ３ ０ ９ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｐ ｍｉ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ５ ． ０ ０ ３
希菌表达系统表达 了具有 生物活性的 ｍ Ｉ Ｌ 一 ３ ３蛋白， 为继续开展 Ｉ Ｌ 一 ３ ３在炎症性肠病的免疫治疗研究奠定 了基础。
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微 生 物 学 免 疫 学进 展
２ ０ １ ５年 １ ０月 第 ４ ３卷第 ５期
Ｐ ｒ ｏ ｇ ｉ ｎ Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｌ ｍｍ ｕ ｎ ｏ ｌ ，Ｏ ｃ ｔ ２ ０ １ ５． Ｖ ０ １ ． ４ ３ Ｎ ０ ． ５
・ｌ ３・
・
论
著 ・
重组小 鼠 Ｉ Ｌ 一 ３ ３成 熟 蛋 白的原 核表 达 、 纯 化 及 活 性 检 测