蛋白体外表达与纯化

蛋白体外表达与纯化

随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。

蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

一：原核表达系统

原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统

真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。

三：哺乳动物细胞表达系统

由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。

表达载体的种类及相应的分离纯化方法

作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。

在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。

本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。

实验方法与步骤：

一：目的蛋白的粗提

1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞

2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期

4．向上述菌液中加入0.1-0.2 mM的IPTG，15℃ 150rpm摇培20小时。

5．菌摇好后于4600 g 4℃离心15分钟集菌

6．倒掉上清，用PA缓冲液悬浮沉淀

7．在第5步条件下离心，用PB缓冲液悬浮沉淀

8．向上述菌液中按0.8mg溶菌酶/g菌体加入溶菌酶，室温下放置10分钟，并轻轻摇动9．12100g 4℃离心 20分钟，吸上清

10.向上步所得上清液中缓缓加入终浓度25%的(NH4)2SO4,此步在磁力搅拌器作用下进行，保持在0℃下进行，搅拌40分钟，静置2小时以上

11.将上步蛋白溶液在第9步条件下离心，吸上清

12．按第10步的方法向上步蛋白溶液中加入终浓度45%的(NH4)2SO4,静置5小时

13．在第9步条件下离心，倒掉上清

14．将上步所得沉淀溶于适量PBS中，装入透析袋中于PBS溶液中透析过夜

15．将透析后的蛋白溶液用PEG8000处理，至剩余2-3 ml

16．将上步所得蛋白溶液上柱（Glutathione Sepharose 4B）,如果需要的话先将蛋白溶液过滤（直径45um）滤膜再上柱

二：目标蛋白的纯化

1．取处理好的1.33 ml Glutathione Sepharose 4B悬浮液于合适试管或离心管中

2．500 g 4℃，离心5分钟，去上清

3．加1 ml 4℃PBS于试管或离心管中，形成50%的Glutathione Sepharose 4B匀浆

4．将样品加入50%的Glutathione Sepharose 4B中，同时加1%TritonX---100

5．室温条件下温育20分钟，并轻轻搅动或吸吐

6．500 g 4℃，离心5分钟，去上清

7．用10倍胶体积的4℃的PBS洗胶

8．500 g 4℃，离心5分钟，去上清

9．将第7、8两步重复3次

10.洗脱，按每胶体积加 1 ml洗脱液（10 mM reduced glutathione in 50 mM Tris—cl,ph=8.0）

11.20--25℃温育10分钟

12．500 g 4℃，离心5分钟，吸上清

13．将10-12步重复3 次

14．将所吸上清加50%甘油-20℃保存

15．取适量纯化的蛋白溶液进行SDS—PAGE，鉴定纯化效果

蛋白体外表达与纯化的意义

1．对目标蛋白的生化特性进行研究。

2．制备目标蛋白的抗血清。

附录：缓冲液的配置

PA：0.4M NaH2PO4---Na2HPO4(pH=7.8) 0.3M NaCl

PB:1mM DTT

0.4M NaH2PO4---Na2HPO4(pH=7.8) 0.1mM EDTA(pH=8.0)

0.3M NaCl

2-Me (现用现加)

Tween-20

NP-40

50mM PMSF(现用现加)

PBS: 140mM NaCl

2.7mM KCl

10mM Na2HPO4

1.8mM KH2PO4