蛋白体外表达与纯化
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
体外蛋白结合实验报告
一、实验背景蛋白质与蛋白质之间的相互作用在生物体内发挥着至关重要的作用，包括信号传导、基因表达调控、细胞骨架组织等。
体外蛋白结合实验是研究蛋白质相互作用的重要手段之一。
本实验旨在研究两种蛋白质A和B之间的相互作用，并通过一系列实验验证其结合能力。
二、实验目的1. 验证蛋白质A和B在体外是否具有结合能力。
2. 确定蛋白质A和B结合的最适条件。
3. 分析影响蛋白质A和B结合的因素。
三、实验材料1. 蛋白质A和B：分别从细胞培养液中纯化获得。
2. 蛋白质标记物：荧光素标记的蛋白质A和B。
3. 试剂：缓冲液、透析袋、SDS-PAGE凝胶、电泳缓冲液、Western blot试剂等。
4. 仪器：蛋白纯化系统、紫外分光光度计、电泳仪、Western blot系统等。
四、实验方法1. 蛋白质纯化：分别从细胞培养液中纯化蛋白质A和B，并鉴定其纯度。
2. 标记蛋白质：将蛋白质A和B分别用荧光素进行标记，获得荧光标记的蛋白质A（F-A）和荧光标记的蛋白质B（F-B）。
3. 蛋白质结合实验：a. 将F-A和F-B按照一定比例混合，在不同温度和pH条件下进行反应。
b. 反应结束后，通过SDS-PAGE和Western blot检测F-A和F-B的结合情况。
4. 影响结合因素分析：a. 研究温度、pH、离子强度等因素对蛋白质A和B结合的影响。
b. 通过改变反应体系中蛋白质A和B的浓度，研究其结合能力的变化。
五、实验结果1. 蛋白质纯化：蛋白质A和B的纯度均达到95%以上。
2. 蛋白质标记：荧光标记的蛋白质A和B的标记效率分别为85%和90%。
3. 蛋白质结合实验：a. 在一定范围内，蛋白质A和B在体外可以发生结合。
b. 在不同温度和pH条件下，蛋白质A和B的结合能力有所差异。
4. 影响结合因素分析：a. 温度对蛋白质A和B的结合有一定影响，最适温度为37℃。
b. pH对蛋白质A和B的结合也有一定影响，最适pH为7.4。
c. 离子强度对蛋白质A和B的结合有显著影响，高离子强度有利于蛋白质A和B的结合。
蛋白质体外表达与进化技术
［８］ＪｏｏｂｅｕｒＴｅｔａｌ．Ｐｌａｎｔ，２００４，３９（３）：２８３—２９７［９］ＦｅｕｉｌｌｅｔＣｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３，１００（２５）：１５２５３—１５２５８［１０］ＴａｎｋｓｌｅｙＳＤｅｔａｌ．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，１９９５，１１（２）：６３—６８［１１］ＳｃｈｗａｒｔｚＤＣｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，１９８４，３７：６７—７５［１２］王永军等．遗传学报，２００４，３１（１）：８７—９０［１３］杨立春等．中国农业科学，２００４，３７（１）：６５—７１［１４］ＭａｄｓｅｎＬＨｅｔａｌ．ＭｏｌＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓ，２００３，２６９：１５０—１６１文章编号：１０００－１３３６（２００５）０４－０３３３－０３蛋白质体外表达与进化技术王长松刘友生陈燕平１（第三军医大学西南医院病理学研究所，重庆４０００３８；１西南医院国际合作实验室，重庆４０００３８）摘要：蛋白质体外表达与进化技术包括核糖体展示技术和ｍＲＮＡ展示技术。
与蛋白质体内表达系统相比，体外表达技术可产生较大容量的蛋白质文库（约１０１２～１０１３左右），同时在回收编码蛋白质的信息时对文库进行了进化，增加了蛋白质文库的多样性，促进了抗体或配体类蛋白质的亲和成熟能力。
该文介绍了蛋白质体外表达技术在新蛋白质（如抗体或配体等）表达筛选中的应用。
关键词：蛋白质体外表达；核糖体展示；ｍＲＮＡ展示；进化中图分类号：Ｑ５１；Ｑ８１６———————————收稿日期：２００５－０５－１６国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０２７１３４２）作者简介：王长松（１９７２—），男，博士，主治医师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｏｌｄｅｎｆｉｎｇｅｒ８５０１２４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；刘友生（１９５５—），男，博士，教授，博士生导师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｕｓｈｅｎｇｌｉｕ６６０＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ从２０世纪８０年代至今，产生了多种筛选肽或蛋白质文库的新技术，这些技术方法大多以表面展示来命名，如细胞表面展示、质粒展示和酵母双杂交系统等。
泛素化相关蛋白纯化及体外泛素化体系的建立
泛素化相关蛋白纯化及体外泛素化体系的建立泛素化是通过连接泛素蛋白到其他蛋白质上，参与细胞信号传导和蛋白质降解的过程。
泛素化相关蛋白的纯化以及体外泛素化体系的建立对于研究泛素化的机制和功能至关重要。
本文将探讨泛素化相关蛋白的纯化方法和体外泛素化体系的建立。
首先，泛素化相关蛋白的纯化是研究泛素化机制的基础。
泛素化相关蛋白包括泛素连接酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接靶蛋白（E3）。
这些蛋白质的纯化需要从细胞或组织中提取，并进行一系列的纯化步骤。
通常，泛素化相关蛋白的纯化以重组蛋白的形式进行。
首先，需要克隆并表达目标蛋白的基因。
可以通过基因工程技术将目标蛋白的编码序列克隆到合适的表达载体中，如原核表达系统（如大肠杆菌）或真核表达系统（如酵母或哺乳动物细胞）。
表达载体通常包含启动子和转录终止子，可以使目标蛋白在宿主细胞中高效表达。
之后，选择合适的培养条件和诱导剂使目标蛋白表达。
培养细胞并收获细胞，利用超声波或高压法破裂细胞膜释放蛋白质，得到总细胞提取物（whole cell lysate）。
细胞提取物中含有目标蛋白以及其他蛋白质和细胞器。
可以利用柱层析技术将目标蛋白与其他蛋白质分离。
常用的柱层析方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。
亲和层析是通过目标蛋白与柱子上的亲和基团的特异性结合来实现分离，如亲和树脂与目标蛋白之间的亲和相互作用。
常见的亲和层析方法包括金属螯合层析和抗体亲和层析。
离子交换层析是利用蛋白质与带电基团之间的静电吸引力进行分离。
根据蛋白质的电荷，可以选择合适的离子交换柱。
凝胶过滤层析是根据蛋白质的分子大小进行分离，较大的蛋白质无法通过凝胶颗粒的孔隙而留在柱子中，而较小的蛋白质可以通过。
通过柱层析分离纯化后，可以进行进一步的纯化和检验，如SDS-PAGE和Western blot。
这些步骤可以用于确定目标蛋白的纯度和存在形式。
在泛素化相关蛋白纯化之后，可以进一步建立体外泛素化体系来研究泛素化的机制和功能。
重组蛋白分离纯化的方法策略及案例介绍
肽配体结合为基础。同时，带有 GST 的蛋白与配体结合是可逆的，能够在温和，非变性的条件下通过加入还原型 谷胱甘肽被洗脱下来。
材料 BL21 感受态细胞 PGEX 表达载体 LB 培养基 Amp（氨苄青霉素） IPTG 蛋白酶抑制剂 缓冲液 1（100mmol/L Tris，PH 8.5，500mmol/L NaCl） 缓冲液 2（100mmol/L NaAc，PH 4.5，500mmol/L NaCl） PBS 缓冲液（100mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4） 洗脱缓冲液（50mmol/L Tris，PH 8.0,10mmol/L GSH） 微量紫外分光光度计 超声波破碎仪 高速冷冻离心机 GST 柱
由上表可知选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可避免破碎细胞的步骤，而且细胞外和周质空间内的 蛋白种类较少，目的蛋白易纯化；而在细胞质内表达重组蛋白时，重组蛋白通常是可溶性表达，但也易形成包涵体。 可溶性蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离且纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白质却变得相当困 难，通常需要对聚集的蛋白进行变，复性，而通常情况下活性蛋白的得率比较低。德泰生物凭借多年的蛋白表达服 务操作经验和相关的技术，可以提供可溶性重组蛋白保证型服务和更高纯度的上清蛋白。
分离纯化原则总结： 1 应尽可能利用蛋白质不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同技术多次纯化； 2 不同的蛋白在性质上有很大区别，每一步纯化步骤都应当充分利用目的蛋白和杂质成分物理性质差异； 3 在纯化早期阶段要尽量减少处理体积，方便后续纯化； 4 在纯化后期阶段，再使用造价高的纯化方法，有利于纯化材料的重复使用，减少再生复杂性。
大肠杆菌裂解液 体外蛋白表达
大肠杆菌裂解液是一种重要的生物工程工具，被广泛应用于体外蛋白表达和纯化领域。
本文将对大肠杆菌裂解液的主要特点和应用进行介绍，并探讨其在体外蛋白表达中的作用和影响。
一、大肠杆菌裂解液的主要特点1. 细胞壁破裂效果显著大肠杆菌裂解液具有高效破裂细胞壁的特点，能够有效释放细胞内的蛋白质和其他生物大分子。
2. 蛋白质保护能力强裂解液中含有丰富的蛋白酶抑制剂，能够有效保护被释放的蛋白质不受降解，有利于后续的纯化和分析。
3. 对细胞内组分影响小裂解液中的成分对细胞内其他生物分子的影响较小，不会对后续实验结果造成干扰。
二、大肠杆菌裂解液在体外蛋白表达中的作用1. 促进目的蛋白质的释放在体外蛋白表达中，通过添加大肠杆菌裂解液可以有效促进目的蛋白质的释放，提高表达效率。
2. 保护蛋白质不受降解裂解液中的蛋白酶抑制剂能够保护被释放的蛋白质不受降解，保证表达蛋白的稳定性和纯度。
3. 降低后续纯化的复杂性大肠杆菌裂解液中的成分对后续蛋白质纯化的影响较小，能够降低纯化过程的复杂性，提高纯化效率。
三、大肠杆菌裂解液的应用1. 体外蛋白表达和纯化大肠杆菌裂解液是最常用的细胞裂解方法之一，在体外蛋白表达和纯化过程中发挥着重要作用。
2. 药物开发在药物开发过程中，大肠杆菌裂解液可用于表达和纯化功能性蛋白，为药物研发提供重要的支持。
3. 生物工程研究在生物工程领域，大肠杆菌裂解液也被广泛应用于蛋白质的功能研究和分析。
四、大肠杆菌裂解液的影响因素1. 裂解液成分裂解液中不同的成分对目的蛋白质的释放和稳定性有影响，需要根据具体实验要求选择合适的裂解液。
2. 裂解条件裂解的温度、时间和压力等条件会影响裂解效果，需要进行优化以达到最佳表达效果。
3. 后续处理裂解后的样品需要适当的后续处理，比如清除细胞残渣、沉淀蛋白质等，以保证后续实验的准确性和可靠性。
大肠杆菌裂解液作为一种重要的生物工程工具，在体外蛋白表达和纯化中发挥着重要的作用，具有很高的应用价值。
蛋白质的体外合成和纯化作业
蛋白质的体外合成和纯化一、蛋白质体外合成方法概述无细胞蛋白质合成系统（The cell-free protein synthesis system）是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。
与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞合成系统具有多种优点，如可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸（如D-氨基酸）的特殊蛋白质，能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质，开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究。
基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为：分、切、连、转、选。
其中，“分”是指分离制备合格的待进一步操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出的目的基因；“连”是指用DNA连接酶，将目的DNA 同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内的目的基因被大量的复制。
基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
二、基因克隆方法操作步骤1、目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。
获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步，基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段。
所需目的基因的来源，不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。
常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选。
2、重组质粒的构建DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA 上，以便下一步转化之用。
基于生物素化技术的蛋白表达和纯化策略研究
基于生物素化技术的蛋白表达和纯化策略研究随着生物技术的高速发展和生物学研究的深入，对于蛋白表达和纯化的需求也越来越大。
其中，生物素化技术作为一种快速、高效、灵敏的标记技术，正受到越来越多的关注和研究。
本文将重点介绍基于生物素化技术的蛋白表达和纯化策略。
第一部分：生物素化技术的基础原理生物素是一种水溶性维生素，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物细胞中，是一种重要的共生信号分子。
生物素化技术即利用生物素和生物素结合蛋白(Biotin-binding protein, BBP)之间的高亲和力，并通过干扰生物素与其它蛋白质的结合来标记和纯化感兴趣的蛋白或酶。
生物素化技术还可以分为两种：一种是利用菌体表达S tagging的生物素化技术(Biotin tag)，另一种是利用体外生物素化技术(Biotinylation)。
前者是将生物素连接到蛋白N端或C端附近，后者则是在蛋白N端或C端附近引入一个生物素化底物，随后加入生物素化酶引入生物素，从而实现蛋白标记和纯化。
第二部分：基于生物素化技术的蛋白表达策略1. 菌体表达生物素标记蛋白(Biotin tag)菌体表达生物素标记蛋白(Biotin tag)是基于遗传工程的方法，将BBP结构域融合到目标蛋白的N、C端，在表达和纯化过程中即可利用高亲和力进行标记和纯化。
优点：操作简单、标记和纯化效率高、纯度高。
缺点：蛋白质结构和生物活性可能会受到BBP的融合影响。
2. 利用体外生物素化技术(Biotinylation)表达蛋白利用体外生物素化技术，首先在蛋白的表达载体中引入生物素化底物(Biotin acceptor peptide, BAP)，随后在表达过程中加入生物素化酶，即可引入生物素，实现蛋白的标记和纯化。
优点：BBP与蛋白质结合灵活，不影响蛋白结构和生物活性。
缺点：操作复杂，标记和纯化效率可能会受到底物和酶浓度的影响。
第三部分：基于生物素化技术的蛋白纯化策略基于生物素化技术的蛋白纯化策略包括干扰生物素与其它蛋白质的结合、利用高亲和力纯化带标记蛋白和对标记蛋白进行洗脱的操作步骤。
染色质体外组装相关蛋白的表达纯化及组装体系的建立
制 的 Ｓ ４ Ｎ Ｖ ０Ｄ Ａ染 色质 。 应用 纯 化 的重 组 果蝇 因子 的组 装体 系 因其 产 生
核小 体 的均一 性这 一 优 点 而被 广 泛 应用 。用 细胞 粗
提取 物 进 行 染 色 质 组 装 是 一 种 依 赖 Ａ Ｐ的 过 程 。 Ｔ Ｋ ｄｎｇ ａ ｏａａ等实 验室从 果 蝇提 取 物 中纯化 出两 种组 装 基本 因子 ： 蛋 白特 异 伴 侣 Ｎ Ｐ一１ ｎ ｃ ａ ｓ 组 Ａ （ ｕｌ ｒａ— ｅ
医 研 杂 ２２ 月 学 究 志 ０ 年１ 第４卷 第１ １ １ 期
・ 论
善 ・
染 色 质 体 外 组 装 相 关 蛋 白的 表 达 纯 化 及 组 装 体 系 的建 立
赵 忠 亮 赵 吉 成 代 辉 沈 翊 绯 张 业
摘 要 目的 提 取 并 纯 化 真 核 细 胞 核 内组 蛋 白 ， 达 并 纯 化 重 组 组 蛋 白 、 色 质 组 装 相 关 因 子 Ｎ Ｐ一１ ｎ ｃ ａ ａｓｍ ｌ 表 染 Ａ （ ｕ ｌ ｒ ｓｅ ｂｙ ｅ
ｐｏ ｉ ｒｔ ｎ一１ 及 Ａ Ｆ Ａ Ｐ—ｕｉｚ ｇｃｒｍ ｔ ｓｅ ｌ ａｄｒｍ ｄｌ ｇｆｃ ｒ ， 建 立 无 细 胞 体 外 染 色 质 组 装 体 系 。方 法 ｅ ） Ｃ （Ｔ ｔｉｎ ｈｏ ａｉ ａｓｍｂ ｎ ｅ ｏｅ ｎ ｔ ） 并 ｌｉ ｎ ｙ ｉ ａｏ
在 大 肠
杆菌 Ｂ２ Ｌ １中表 达 并 应 用 离 子 交 换 层 析 纯 化 组 蛋 白 ， 真 核 细 胞 Ｈ Ｌ 细 胞 核 中提 取 并 应 用 羟 基 磷 灰 石 纯 化 组 蛋 白八 聚 体 ， 用 从 ｅａ 利 杆 状 病 毒 表 达 系 统 在 昆 虫 细 胞 Ｓ９中 表 达 并 纯 化 组 装 相 关 因 子 ， 用 纯 化 得 到 的 蛋 白在 适 宜 条 件 下 进 行 染 色 质 体 外 组 装 ， 用 ｆ 应 并 微 球 菌 核 酸 酶 酶 切 检 测 。结 果 获 得 了 高 纯 度 的原 核 表 达 的 组 蛋 白 ， 核 细 胞 组 蛋 白 八 聚 体 及 组 蛋 白 特 异 伴 侣 Ｎ Ｐ一１和 真 Ａ Ａ Ｆ 建 立 了 由质 粒 Ｄ Ａ、 化 的 真 核 细 胞 核 内重 组 组 蛋 白 、 组 Ｎ Ｐ一１重 组 Ａ Ｆ及 Ａ Ｐ为核 心 成 分 的体 外 染 色 质 组 装 的 无 Ｃ ； Ｎ 纯 重 Ａ 、 Ｃ Ｔ
苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化
苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化摘要：根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）cry2Aa基因进行优化，并合成全长基因，将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a 上，转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达，优化表达条件，采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化，Western blot鉴定回收产物。
结果表明，IPTG浓度为0.50 mmol/L、27 ℃诱导4 h时Cry2Aa蛋白表达量最高，SDS-PAGE胶回收Cry2Aa 纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法。
关键词：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）；Cry2Aa蛋白；表达；纯化苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种能够产生多种杀虫晶体蛋白（Cry）的土壤细菌[1，2]，Bt的cry基因已成功转入很多主要农作物（Bt 农作物），包括玉米、棉花、西红柿等，使它们具有抗虫特性[3-6]。
Cry1类杀虫晶体蛋白对鳞翅目害虫具有特异毒性，在微生物和植物基因工程中得到了广泛的应用，但其存在着杀虫谱狭窄、昆虫产生抗药性等问题[7，8]。
Cry2类蛋白在结构和杀虫机制上不同于Cry1类，如Cry2Aa既对鳞翅目害虫有毒性又能杀害双翅目害虫[9]。
研究显示转cry2Aa基因的鹰嘴豆对豆荚蛀虫有较强的毒性[10]，而转cry2Aa基因的水稻对其传粉昆虫如中华通草蛉无危害性[11]。
本研究合成密码子优化的cry2Aa基因，体外重组表达Cry2Aa蛋白并进行优化，以期为进一步求证Cry2Aa的安全性奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白序列由华中农业大学林拥军教授提供，与NCBI （http：//）中相关序列（M31738）仅有少数氨基酸不同。
pET-44a 质粒、大肠杆菌TOP10和Rosetta菌株由广州市过敏反应与临床免疫重点实验室保存；Strep Trap HP预装柱和低分子量蛋白Marker购自GE公司；StrepⅡ标签抗体购于Merck公司。
蛋白体外表达与纯化
蛋白体外表达与纯化随着后基因组时代的到来,蛋白质组成为科学研究的热点。
蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者,其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。
蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统,真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
一:原核表达系统原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表,大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系,这也是外源基因表达的首选体系。
该表达体系的优点:遗传学和生理学背景清楚;容易培养;外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。
其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰;广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制;另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体;有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异,而的不到足够的产物。
二:真核表达系统真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表,酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制,形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。
因以大肠制备质粒DNA较方便,通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续,缩短时间。
作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件:安全无毒,不致病;遗传背景较清楚,容易进行遗传操作;容易进行载体DNA的导入;培养条件简单;有良好的蛋白分泌能力;有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。
三:哺乳动物细胞表达系统由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用,故此不赘述。
表达载体的种类及相应的分离纯化方法作为表达载体必须具备以下特征:稳定的遗传复制、传代能力,无选择压力下能存在于宿主细胞内;具有显性的筛选标记;启动子的转录是可调控的;启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止;具有外源基因插入的多克隆位点。
在原核表达系统中常用的表达载体有:PET-载体系列,用这类载体表达出的外源蛋白在N 端或C端或两端均具有his tag。
体外乙酰化[指南]
![体外乙酰化[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/f9b89efc541810a6f524ccbff121dd36a32dc49c.png)
体外乙酰化/去乙酰化实验方法1. GST蛋白表达纯化接菌：3mL LB+ 3ul 抗生素+ 一个菌落（经BL-21转化后的）37℃ 225rpm摇菌过夜。
IPTG:100 mL LB + 100ul 抗生素+ 1ml 菌液，37℃ 225rpm 4h；4h后，每瓶（100ml）菌液 + 40ul IPTG,30℃ 225rpm 2h；100ml菌液分装2个50ml离心管，离心4℃，5000rpm,10min,弃上清，置于-20℃保存备用。
GST：1.将-20℃保存的细胞（一管50ml离心管，另一管保留）置于冰上，加入3ml冰预冷的PBS，重悬细胞，再加入150ul Triton-100(20%)；2.将重悬好的细胞转移到15ml离心管中；3.将超声波细胞破碎仪预热10min；4.向15ml离心管中加入5ul PIC, 5ul PMSF, 5ul Na3VO4；5.破碎细胞：次数：6-8次，间隔：60-120s，每次：10-15s（实际使用：次数：6；间隔：60’’，每次：10’’）；6.beads预处理：用前混匀，133ul beads，离心4℃，2500rpm，5min，弃上清（吸取33ul上清，弃之），得100ul beads (2个样品) ;7.用1ml PBS洗1次beads，混匀，离心4℃，2500rpm，5min，弃上清，+ 150ulPBS重悬，分装4管，每管62.5ul；8.将破碎后的3ml样品分装到2个Ep管中，离心4℃，13000rpm，15min，将上清转移至分装好的beads管中，4℃摇床摇匀过夜or RT 摇床摇匀1h；9.离心4℃，2500rpm，5min，弃上清；10.加入预冷PBS 1ml，混匀，离心4℃，2500rp m，5min，弃上清；11.重复步骤10两遍，即用PBS洗3次；12.每1个Ep管中加入100ul PBS（即：每3ml原样品对应2支Ep管），4℃保存。
蛋白质体外表达技术
蛋白质体外表达技术
蛋白质体外表达技术是一种常用的研究蛋白质功能和结构的方法。
通过将目标基因插入到适当的表达载体中，转染到宿主细胞中，利用宿主细胞的生物合成机制和表达系统来大量生产目标蛋白质。
一般而言，蛋白质体外表达技术包括以下几个步骤：
1. 选择合适的表达载体：选择能够稳定维持目标基因的表达载体，如质粒、病毒载体等。
2. 将目标基因插入表达载体：将目标基因通过酶切和连接技术插入到表达载体中，构建带有启动子、转录终止子等重要元素的重组载体。
3. 转染宿主细胞：将重组载体转染到适当的宿主细胞中，如细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
4. 优化表达条件：通过调控培养条件、添加诱导剂、调整培养时间等方法，优化蛋白质的表达效率和纯度。
5. 收集和纯化目标蛋白质：从转染后的细胞中收集目标蛋白质，一般通过细胞裂解、柱层析、电泳等方法进行蛋白质的分离和纯化。
蛋白质体外表达技术的优点包括可以大量产生目标蛋白质、操作简单、时间和成本相对较低。
然而，该技术也存在一些限制，
如由于宿主细胞的限制，无法表达复杂蛋白质（如糖基化蛋白质）、产生副产物、蛋白质不可溶性等问题。
因此，在选择蛋白质表达系统时，需要根据目标蛋白质的特性和所需应用进行综合考虑和选择。
重组人血白蛋白的纯化研究
重组人血白蛋白的纯化研究引言：人血白蛋白（Human serum albumin，HSA）是一种重要的血浆蛋白，它是最常见和丰度最高的蛋白质之一，具有多种重要的生理功能。
由于其广泛的应用领域，尤其是在医药领域，重组人血白蛋白的纯化研究变得愈发重要。
本文将探讨重组人血白蛋白的纯化研究方法及其相关应用。
一、重组人血白蛋白的表达与纯化方法重组人血白蛋白的表达可以使用多种不同的宿主细胞。
其中，大肠杆菌是最常用的表达宿主，其背后的原因是其具备高表达水平和简单的培养条件。
其他常用的表达宿主包括酵母菌和昆虫细胞。
无论使用哪种宿主细胞，都需要进行合适的筛选，以获得具有相应重组蛋白表达的菌落或细胞株。
重组人血白蛋白的纯化是一个关键步骤，其目的是去除其他杂质，并获得高纯度的重组蛋白。
传统的纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
离子交换层析是最常见的方法之一，根据蛋白质的电荷差异进行分离。
凝胶过滤层析则根据蛋白质的分子量差异进行分离。
亲和层析是根据特定的亲和剂与重组蛋白之间的特异性相互作用进行分离。
根据具体需求，可以采用单一的纯化方法，也可以采用多种方法的组合。
二、重组人血白蛋白的特性分析在纯化过程中，对重组人血白蛋白的特性进行分析非常重要。
这些特性包括分子量、保真性、溶解性、吸收光谱和理化性质等。
分子量可以通过凝胶电泳等方法测定。
保真性指的是重组蛋白的纯度，可以通过SDS-等方法进行检测。
溶解性通常通过自身的溶解实验和温度、pH值等条件的优化来确定。
吸收光谱可以通过紫外光谱分析来评估重组蛋白的含量和纯度。
三、重组人血白蛋白的应用重组人血白蛋白在医药领域具有广泛的应用价值。
首先，作为一种胶体溶液，重组人血白蛋白可以用于体外营养支持和血浆代替疗法。
其次，重组人血白蛋白还可以用于制备药物的稳定剂，包括蛋白质和肽类药物。
此外，重组人血白蛋白还可以用作疫苗的辅助剂、细胞培养的添加剂等。
总结：重组人血白蛋白的纯化研究对于其应用具有重要意义。
两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较
基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第9期，第4136-4144页研究报告Research Report两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较邱淑彬1,2荆韧威3郭正隆3谢晓东1,2*1天津农学院农学与资源环境学院,天津,300384;2天津市作物抗逆的机理及遗传改良国际联合研究中心,天津,300384;3天津医科大学基础医学研究中心,天津-牛津基因治疗联合实验室,天津,300070*通信作者,*************.cn摘要为了比较两种不同的原核表达载体体外表达纯化CP05-GFP蛋白的能力，本研究通过构建pET28b-CP05-GFP(双His-Tag)、pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)、pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)三个原核表达质粒，诱导表达并纯化带有不同标签的CP05-GFP蛋白。
通过考马斯亮蓝染色技术比较两种不同的原核表达载体表达以及体外纯化CP05-GFP蛋白的能力，发现3个原核表达载体均能诱导表达出CP05-GFP蛋白，且能纯化出CP05-GFP蛋白，但是不同标签纯化CP05-GFP蛋白的纯化效率是不同的：pET28b-CP05-GFP (双His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白，但其表达量低易纯化；pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白，其表达量高但不易纯化；pGEX-6p-1-CP05-GFP (GST-Tag)原核表达系统可表达出足量的CP05-GFP(GST-Tag)蛋白，并且易纯化。
本研究有助于选择合适的载体进行融合蛋白的表达和纯化。
关键词原核表达,载体构建,蛋白纯化Comparison of Two Different Prokaryotic Expression Vectors in Protein Expression and PurificationQiu Shubin1,2Jing Renwei3Guo Zhenglong3Xie Xiaodong1,2*1College of Agronomy and Resource Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384;2Tianjin Joint Research Center for Crop Stress Resistant and Genetic Improvement,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384;3Tianjin-Oxford Joint Laboratory Gene Therapy,Research Cen-ter of Basic Medical Science,Tianjin Medical University,Tianjin,300070*Corresponding author,*************.cnDOI:10.13417/j.gab.039.004136Abstract To compare the ability of two different prokaryotic expression vectors in the expression and purification of CP05-GFP in vitro,the pET28b-CP05-GFP(Double His-Tag),pET28b-CP05-GFP(Single His-Tag) and pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)expression vectors were constructed.Afterwards,the CP05-GFP proteins with different tags were expressed and purified.The expression efficiency of these two vectors and the ability of different tags to purify the CP05-GFP proteins were compared by coomassie blue staining.The CP05-GFP proteins with different Tags could be obtained from the pET28b-CP05-GFP(Double His-Tag),pET28b-CP05-GFP(single His-Tag)and pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)expression vectors.While the abilities of different tags to purify to purify CP05-GFP in vitro were compared by Coomassie blue staining technique.The results showed that the CP05-GFP protein with double His-Tag was expressed in a low level,but easy to be purified.In contrast,the CP05-GFP protein with a single His-Tag could be expressed with high abundance but difficult to be purified. Significantly,the CP05-GFP with a GST-Tag could be expressed with high abundance and easy to be purified.基金项目：本研究由国家自然科学基金(31771858)资助引用格式：Qiu S.B.,Jing R.W.,Guo Z.L.,and Xie X.D.,2020,Comparison of two different prokaryotic expression vectors in protein expression and purification,Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue(Genomics and Applied Biology),39(9):4136-4144(邱淑彬,荆韧威,郭正隆,谢晓东,2020,两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较,基因组学与应用生物学,39(9):4136-4144)体外重组蛋白表达技术已经渗透到生物学的各个领域。
互作蛋白体外表达
互作蛋白体外表达
互作蛋白体外表达是一种实验方法，用于研究蛋白质之间的相互作用。
该方法通常涉及将目标蛋白质与其互作蛋白一起在体外进行表达和纯化，以便分析它们之间的相互作用。
具体步骤如下：
1、设计和合成含有目标蛋白质和互作蛋白的基因序列。
2、将基因序列插入到表达载体中，如质粒或噬菌体。
3、将表达载体转化到适当的宿主细胞中，如细菌、酵母或哺乳动物细胞。
4、在适当的条件下培养宿主细胞，使目标蛋白质和互作蛋白在体外表达。
5、对表达的目标蛋白质和互作蛋白进行分离和纯化，通常使用各种色谱技术。
6、通过分析蛋白质之间的相互作用，例如通过共结晶、免疫共沉淀、表面等离子共振等技术，来验证它们之间的相互作用。
需要注意的是，互作蛋白体外表达的结果可能受到多种因素的影响，例如表达条件、纯化方法、蛋白质的修饰和折叠等。
因此，实验结果需要谨慎解释和验证。
体外组装蛋白亚基
体外组装蛋白亚基
"体外组装蛋白亚基"这个术语涉及到蛋白质在实验室条件下的组装过程，通常是在离体（体外）的环境中进行的。
在生物学和生物化学研究中，科学家们常常需要通过体外的实验来理解蛋白质的结构、功能以及相互作用。
以下是关于体外组装蛋白亚基的一般过程：
1. 基本原理：蛋白质通常是由多个亚基组成的。
这些亚基可能是多肽链、蛋白质子结构或其他辅助分子。
在体外组装的实验中，科学家会尝试通过操纵条件，使这些亚基在实验条件下进行组装。
2. 表达和纯化亚基：首先，科学家会使用基因工程技术在细菌、酵母或其他表达系统中表达蛋白质的亚基。
然后，利用不同的生化技术，如蛋白质层析、电泳等，纯化出这些亚基。
3. 优化组装条件：一旦获得了纯化的亚基，科学家会尝试优化体外组装的条件。
这可能包括调整pH、温度、盐浓度和其他添加物的浓度，以提高亚基的组装效率。
4. 监测组装过程：使用各种技术，如凝胶电泳、质谱分析、光谱学等，科学家可以监测和验证亚基的组装过程。
这有助于确认组装是否达到预期的结构和稳定性。
5. 功能研究：一旦成功组装了蛋白质亚基，科学家可以进行进一步的功能研究。
这可能包括了解组装后蛋白质的结构、活性和与其他生物分子的相互作用。
总的来说，体外组装蛋白亚基是一种用于研究蛋白质结构和功能的实验方法，特别适用于那些难以在生物体内进行的研究。
人心室肌球蛋白轻链1基因的克隆及其体外的表达与纯化
人心室肌球蛋白轻链1基因的克隆及其体外的表达与纯化葛宏华;肖亚中;姚建平
【期刊名称】《安徽大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2004(028)006
【摘要】通过聚合酶链式反应方法扩增人心室肌球蛋白轻链1的基因片段,并将其克隆到pET-22b质粒,构建表达重组体,转化大肠杆菌BL21细胞,转化子细胞经IPTG诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,凝胶成像扫描检测,其表达量接近细胞总蛋白的40%,经Ni2+亲和层析使目的蛋白得到纯化.
【总页数】5页(P76-80)
【作者】葛宏华;肖亚中;姚建平
【作者单位】安徽大学,现代实验技术中心,安徽,合肥,230039;安徽大学,生命科学学院,安徽,合肥,230039;安徽省生物研究所,安徽,合肥,230031
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
【相关文献】
1.人APOBEC3G基因克隆、表达、纯化及多克隆抗体制备 [J], 李岚;杨怡姝;李泽琳;曾毅
2.人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达 [J], 周雪莹
3.脊尾白虾肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链基因的克隆与表达分析 [J], 王佳佳;李健;葛倩倩;高海钰;李吉涛;赵法箴
4.人Ⅱ型成对免疫球蛋白样受体β基因(PILRβ)的克隆、表达、纯化及其多克隆抗体的制备 [J], 厉建中;陈霞;郭葆玉
5.人载脂蛋白A5基因的克隆、表达、纯化及多克隆抗体制备 [J], 任东升;官家发;李德华;梁波;吴洽庆
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蛋白体外表达与纯化
随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。
蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。
蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
一：原核表达系统
原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。
该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。
其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。
二：真核表达系统
真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。
因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。
作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。
三：哺乳动物细胞表达系统
由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。
表达载体的种类及相应的分离纯化方法
作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。
在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。
用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。
PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。
本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。
实验方法与步骤：
一：目的蛋白的粗提
1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞
2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期
4．向上述菌液中加入0.1-0.2 mM的IPTG，15℃ 150rpm摇培20小时。
5．菌摇好后于4600 g 4℃离心15分钟集菌
6．倒掉上清，用PA缓冲液悬浮沉淀
7．在第5步条件下离心，用PB缓冲液悬浮沉淀
8．向上述菌液中按0.8mg溶菌酶/g菌体加入溶菌酶，室温下放置10分钟，并轻轻摇动9．12100g 4℃离心 20分钟，吸上清
10.向上步所得上清液中缓缓加入终浓度25%的(NH4)2SO4,此步在磁力搅拌器作用下进行，保持在0℃下进行，搅拌40分钟，静置2小时以上
11.将上步蛋白溶液在第9步条件下离心，吸上清
12．按第10步的方法向上步蛋白溶液中加入终浓度45%的(NH4)2SO4,静置5小时
13．在第9步条件下离心，倒掉上清
14．将上步所得沉淀溶于适量PBS中，装入透析袋中于PBS溶液中透析过夜
15．将透析后的蛋白溶液用PEG8000处理，至剩余2-3 ml
16．将上步所得蛋白溶液上柱（Glutathione Sepharose 4B）,如果需要的话先将蛋白溶液过滤（直径45um）滤膜再上柱
二：目标蛋白的纯化
1．取处理好的1.33 ml Glutathione Sepharose 4B悬浮液于合适试管或离心管中
2．500 g 4℃，离心5分钟，去上清
3．加1 ml 4℃PBS于试管或离心管中，形成50%的Glutathione Sepharose 4B匀浆
4．将样品加入50%的Glutathione Sepharose 4B中，同时加1%TritonX---100
5．室温条件下温育20分钟，并轻轻搅动或吸吐
6．500 g 4℃，离心5分钟，去上清
7．用10倍胶体积的4℃的PBS洗胶
8．500 g 4℃，离心5分钟，去上清
9．将第7、8两步重复3次
10.洗脱，按每胶体积加 1 ml洗脱液（10 mM reduced glutathione in 50 mM Tris—cl,ph=8.0）
11.20--25℃温育10分钟
12．500 g 4℃，离心5分钟，吸上清
13．将10-12步重复3 次
14．将所吸上清加50%甘油-20℃保存
15．取适量纯化的蛋白溶液进行SDS—PAGE，鉴定纯化效果
蛋白体外表达与纯化的意义
1．对目标蛋白的生化特性进行研究。
2．制备目标蛋白的抗血清。
附录：缓冲液的配置
PA：0.4M NaH2PO4---Na2HPO4(pH=7.8) 0.3M NaCl
PB:1mM DTT
0.4M NaH2PO4---Na2HPO4(pH=7.8) 0.1mM EDTA(pH=8.0)
0.3M NaCl
2-Me (现用现加)
Tween-20
NP-40
50mM PMSF(现用现加)
PBS: 140mM NaCl
2.7mM KCl
10mM Na2HPO4
1.8mM KH2PO4。