EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)

三、凝胶滞留试验（EMSA）凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。

（一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。

裂解液：25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。

洗脱液：50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%（v/v）Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。

EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液：25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。

1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 µg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。

2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 µg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。

3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃、200 rpm培养6 h。

4 冰上放置10 min，4℃、3000×g离心15 min，收集菌体并称重。

5 每克菌体加入3 mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1，在冰上温和地搅动菌液30 min。

6 超声波破碎30 s（破碎10 s停10 s）。

7 4℃、12000×g离心30 min，上清液用0.45µm滤膜过滤，向滤液中加入5 M NaCl，使NaCl的浓度为200 mM。

8 去掉Glutathione Sepharose 4 Fast Flow中的储存液，用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂。

9 待裂解液流到树脂上沿以下时，加入已过滤的菌体裂解液。

流出液再过一次树脂，收集流穿液。

10 用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集洗涤液并置于冰上。

11 用5倍树脂体积的洗脱液洗脱目的蛋白，收集目的蛋洗脱液置于冰上。

12 洗脱结束后，用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集清洗液置于冰上。

13 用5倍树脂体积的双蒸水洗涤树脂，树脂保存于3倍体积的20%（v/v）乙醇中。

14 通过SDS-PAGE电泳分析流穿液、洗涤液、目的蛋洗脱液和清洗液中出现的目的蛋白。

15 用截留分子量不大于目的蛋白分子量1/3的超滤管超滤纯化目的蛋白，并加入透析液继续超滤至合适的体积，转移到1.5 mL离心管中，-20℃保存。

（二）蛋白质浓度的BCA法测定用Thermo Fisher公司生产的BCA蛋白定量分析试剂盒测量蛋白质溶液的浓度。

1用透析液稀释2000 µg mL-1标准蛋白质溶液，得到浓度分别为0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 µg mL-1 的标准蛋白质溶液。

2A液与B液按50：1的体积混匀，得到WR液。

3将200 µL WR液分别与25µL不同浓度的标准蛋白质溶液混匀，封口，37℃温育30min。

4冷却至室温后测量562nm波长的吸光值，测3次，取平均值。

做出标准曲线。

5将25µL待测蛋白质溶液加到200 µL WR液中，混匀，封口，37℃温育30min。

6冷却至室温后测量562nm波长的吸光值，测3次，取平均值。

根据标准曲线得出待测蛋白质溶液中的蛋白质浓度。

（三）转录因子直接结合DNA的EMSA验证用Thermo Scientific公司生产的Chemiluminescent Nucleic AcidDetection Module检测生物素标记探针。

1配制6%非变性PAGE凝胶：1800 µL双蒸水、3500 µL 1×TBE缓冲液（50 mMEDTA）、1400 µL 30%（w/v）Acr/Bis（29：1）、219 µL 80% Tris-硼酸和2 mM Na2（v/v）甘油、52.5 µL 10%（w/v）APS和3.5 µL TEMED。

EDTA、600 mM KCl、2配制4×结合缓冲液：200 mM pH 8.0Tris-HCl、4 mM Na24 mM DTT；3配制结合反应液：5 µL 4×结合缓冲液、1 µL poly（dI·dC）、5 µg纯化蛋白和0.1 pM生物素标记探针，用双蒸水补至20 µL。

竞争反应加入相应量的非标记探针。

室温下放置1 h。

4小型垂直电泳槽放置在冰中，将结合反应液加入6%非变性PAGE凝胶的进样孔中，在0.5×TBE缓冲液中100 V电压电泳60 min。

5剪出与凝胶大小相当的尼龙膜和滤纸（4张），将尼龙膜和滤纸在0.5×TBE 中浸泡10 min以上。

6在半干转膜仪中加入0.5×TBE，依次铺上2层滤纸、尼龙膜、凝胶、2层滤纸，每层之间不能有气泡。

500 mA电转1 h。

7移走滤纸将尼龙膜取出，在超净台紫外灯下约10 cm处紫外交联10 min。

8 从冰箱取出Blocking Buffer和4×Wash buffer，置37 ℃烘箱，使白色沉淀溶解。

9 将尼龙膜放在5 mL Blocking Buffer中，轻微振荡15 min。

10将16.7 μL Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加到5 mL Blocking Buffer中（1:300稀释）配制Conjugate/Blocking Buffer。

倒出Blocking Buffer，加入Conjugate/Blocking buffer，轻微振荡15 min。

11 用4×Wash buffer加纯水配制40 mL 1×Wash buffer。

12 将膜移动到新容器中，用10 mL 1×Wash buffer洗涤尼龙膜4次，每次5 min，轻微振荡。

13 将膜移动到新容器中，加入10 mL Substrate Equilibration Buffer，轻微振荡5 min。

14 将结合膜取出放置到滤纸上，吸掉水分，再放到新的滤纸上。

15 在暗室中将Luminol/Enhancer Solution和Stable Peroxide Solution 等体积混合配制Substrate Working Solution，将Substrate Working Solution 加到尼龙膜上。

16用保鲜膜覆盖尼龙膜，放上X-感光片，曝光，显影，拍照。

蛋白原核表达及激酶活性测定吴赴清提供一、蛋白原核表达（一）载体选择1、蛋白表达的载体系统很多，常用的有pET系统(有his-tag)，pGEX-4T-1（GST tag），pMAL系统（MBP tag）。

2、由于pET系统标签小，纯化洗脱都比较方便，因此一般首选这个系统；如果pET表达困难，可以考虑用pGEX-4T-1和pMAL系统，GST标签与MBP标签一方面都可以增加蛋白的可溶性，另一方面也利于增加难表达蛋白的表达水平。

二者的区别是某些情况下，pMAL系统表达复杂结构蛋白能力更强些，但MBP融合蛋白不容易从树脂上洗脱下来。

（二）表达菌株表达菌株使用最多的是BL21（DE3），另外对某些表达特别困难的蛋白也可以选用由这个菌株优化的新菌株，如rostta(DE3), BL21（DE3）plysS等。

（三）融合蛋白表达纯化1、His蛋白表达纯化（1）测序正确的质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，涂板后培养8-16h。

（2）挑取3单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃摇菌至OD600=0.6。

（3）取1 ml菌液保存菌种，取2ml加入IPTG使终浓度为1mM，16℃，160rpm, 16h诱导，另2 ml不加IPTG，16℃，160rpm, 16h，作未诱导对照。

（4）诱导结束后，诱导和未诱导的，各取1ml, 10000 rpm离心1min, 去上清，沉淀中加入50 µl PBS重悬，再加入50µl 2×蛋白上样缓冲液，100℃煮样5min, 10000 rpm离心5min, 得到的上清为总蛋白。

取10-20 µl 电泳检测目的蛋白表达情况。

（5）如果要检测表达的蛋白是在上清中还是在沉淀中，则按下面步骤进行：取5 ml诱导和5ml未诱导菌液，离心收集沉淀，加入300-500ul PBS重悬，超声破碎，至菌体变为澄清，12000 rpm离心5min，取50ul上清加入50ul 2×蛋白上样缓冲液; 取沉淀加入100-200ul PBS,再加入等体积2×蛋白上样缓冲液，100℃煮样5min, 10000 rpm离心5min, 取10-20 µl 电泳检测目的蛋白表达情况。

（6）融合蛋白纯化如果小量诱导发现蛋白有表达，则进行纯化，下面以1升LB为例介绍纯化过程。

1）诱导完毕后，7000rpm, 4℃，离心5min收菌。

沉淀可在-20℃保存数月。

2）用40ml 冷PBS重悬细胞沉淀, 加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)，和2mM DTT, 200µl Triton X-100轻微涡旋混匀。

4）超声破碎细胞，至菌体澄清，12000 rpm，4℃，离心10min，小心转移上清到一个新的50ml 离心管中。

5）取0.5-1ml Ni-NTA His•Bind树脂到结合柱中，让液体流下，加入2x5ml PBS 漂洗树脂，结束后将树脂加到4）的蛋白上清中。

6）将离心管封严平放在冰盒中，摇床上100rpm摇动结合1-2h。

7）将上述结合混合物上柱子，让溶液流出，收集树脂。

8）用3X5ml 冰中预冷的PBS漂洗树脂。

9）配制梯度咪唑溶液（100mM、200mM、300mM、400mM、500mM）放置冰中, 分别用500ul上述溶液从低浓度到高浓度依次洗脱目的蛋白。