EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)

三、凝胶滞留试验（EMSA）

凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。

（一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化

以GST标签为例。

裂解液：25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM Na

EDTA、1mM DTT和

2

1×Complete Protease InhibitorCocktail。

洗脱液：50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%（v/v）Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。

EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液：25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na

2

Protease InhibitorCocktail。

1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 µg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。

2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 µg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。

3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃、200 rpm培养6 h。

4 冰上放置10 min，4℃、3000×g离心1

5 min，收集菌体并称重。

5 每克菌体加入3 mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1，在冰上温和地搅动菌液30 min。

6 超声波破碎30 s（破碎10 s停10 s）。

7 4℃、12000×g离心30 min，上清液用0.45µm滤膜过滤，向滤液中加入5 M NaCl，使NaCl的浓度为200 mM。

8 去掉Glutathione Sepharose 4 Fast Flow中的储存液，用5倍树脂体积

的裂解液清洗树脂。

9 待裂解液流到树脂上沿以下时，加入已过滤的菌体裂解液。流出液再过一次树脂，收集流穿液。

10 用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集洗涤液并置于冰上。

11 用5倍树脂体积的洗脱液洗脱目的蛋白，收集目的蛋洗脱液置于冰上。

12 洗脱结束后，用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集清洗液置于冰上。

13 用5倍树脂体积的双蒸水洗涤树脂，树脂保存于3倍体积的20%（v/v）乙醇中。

14 通过SDS-PAGE电泳分析流穿液、洗涤液、目的蛋洗脱液和清洗液中出现的目的蛋白。

15 用截留分子量不大于目的蛋白分子量1/3的超滤管超滤纯化目的蛋白，并加入透析液继续超滤至合适的体积，转移到1.5 mL离心管中，-20℃保存。

（二）蛋白质浓度的BCA法测定

用Thermo Fisher公司生产的BCA蛋白定量分析试剂盒测量蛋白质溶液的浓度。

1用透析液稀释2000 µg mL-1标准蛋白质溶液，得到浓度分别为0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 µg mL-1 的标准蛋白质溶液。

2A液与B液按50：1的体积混匀，得到WR液。

3将200 µL WR液分别与25µL不同浓度的标准蛋白质溶液混匀，封口，37℃温育30min。

4冷却至室温后测量562nm波长的吸光值，测3次，取平均值。做出标准曲线。

5将25µL待测蛋白质溶液加到200 µL WR液中，混匀，封口，37℃温育30min。

6冷却至室温后测量562nm波长的吸光值，测3次，取平均值。根据标准曲线得出待测蛋白质溶液中的蛋白质浓度。

（三）转录因子直接结合DNA的EMSA验证

用Thermo Scientific公司生产的Chemiluminescent Nucleic Acid

Detection Module检测生物素标记探针。

1配制6%非变性PAGE凝胶：1800 µL双蒸水、3500 µL 1×TBE缓冲液（50 mM

EDTA）、1400 µL 30%（w/v）Acr/Bis（29：1）、219 µL 80% Tris-硼酸和2 mM Na

2

（v/v）甘油、52.5 µL 10%（w/v）APS和3.5 µL TEMED。

EDTA、600 mM KCl、2配制4×结合缓冲液：200 mM pH 8.0Tris-HCl、4 mM Na

2

4 mM DTT；

3配制结合反应液：5 µL 4×结合缓冲液、1 µL poly（dI·dC）、5 µg纯化蛋白和0.1 pM生物素标记探针，用双蒸水补至20 µL。竞争反应加入相应量的非标记探针。室温下放置1 h。

4小型垂直电泳槽放置在冰中，将结合反应液加入6%非变性PAGE凝胶的进样孔中，在0.5×TBE缓冲液中100 V电压电泳60 min。

5剪出与凝胶大小相当的尼龙膜和滤纸（4张），将尼龙膜和滤纸在0.5×TBE 中浸泡10 min以上。

6在半干转膜仪中加入0.5×TBE，依次铺上2层滤纸、尼龙膜、凝胶、2层滤纸，每层之间不能有气泡。500 mA电转1 h。

7移走滤纸将尼龙膜取出，在超净台紫外灯下约10 cm处紫外交联10 min。

8 从冰箱取出Blocking Buffer和4×Wash buffer，置37 ℃烘箱，使白色沉淀溶解。

9 将尼龙膜放在5 mL Blocking Buffer中，轻微振荡15 min。

10将16.7 μL Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加到5 mL Blocking Buffer中（1:300稀释）配制Conjugate/Blocking Buffer。倒出Blocking Buffer，加入Conjugate/Blocking buffer，轻微振荡15 min。

11 用4×Wash buffer加纯水配制40 mL 1×Wash buffer。

12 将膜移动到新容器中，用10 mL 1×Wash buffer洗涤尼龙膜4次，每次5 min，轻微振荡。

13 将膜移动到新容器中，加入10 mL Substrate Equilibration Buffer，轻微振荡5 min。

14 将结合膜取出放置到滤纸上，吸掉水分，再放到新的滤纸上。