GIV诺如病毒荧光定量一步RT-PCR方法的建立解析
RT-PCR详细图文解析
一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析 四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法的建立及临床应用
１ 资 料 与方 法
病毒名称
星状病毒
Ｉ 物或探针
上游日物 Ａｔｖ ｌ ｓｏＦ ｒ
下游引物 Ａｔｖ ｓ Ｒ ｒ ｏ
序列
１ Ｃｗ ｃＧＴ ＡＧＣ Ｃ １ ｒ ｃ ＴＴ ＧＧＡ ＴＡ ℃Ａ
Ｇ ｃＧＡ ＣＡ Ａｍ ＡＣ亿 ＣＴＴ ＡＣ 从 Ａ Ｃ Ａ
样收集后 ２ ４ ｈ内运 回实验室 ， 适量 ｐ 用 Ｈ＝ ． ７４的 Ｐ Ｓ Ｂ
ＡＧ ＣＴＴ ＣＣ￣ＧＣ ＡＡ ＴＴＣＧＡＴＣ ＴＡ Ａ
ＣＡ ｒＧ ｌＴＡ ’ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ ＡＣｃ． Ｃ 几Ｇ Ａ 兀 Ｆ Ｍ— ＴＡＧＧ ＣｒＧ Ｃ Ａ — Ｇ Ａ ＡＡ ＴＣＴＣＡ ＡＴ Ｍ Ｂ ｒ
肠道腺病毒 上游 物ＥｄＦ ｌ Ａｖ
行验 证。结果 成功建立 常见腹 泻病 毒 的多重 荧光 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｒ检测 方法 ， Ｃ 对星状病 毒 、 状病毒 、 轮 肠道腺 病毒 、 诺 如病毒 以外的病原体不发 生扩增反 应。该法检 测 星状病 毒 、 轮状 病毒 、 道腺 病毒 、 肠 诺如 病毒 的灵敏 度 可达 ５ ０ ０ ｃｐｅ／ Ｌ ５ ｏ ｉ ｍ 。２ ６份标本 中： ｓ 星状病毒 、 轮状 病毒 、 肠道腺 病毒 和 诺如 病毒 阳性 率 分别 为 ３ １ ％ （ ／ ５ ） ４ ． ７ ．２ ８ ２６ 、２９ ％
（ １／ ５ ）９ ３ ％ （４ ２ ６ 和 １． ６ （ ６ ２６ ， １０ ２ ６ 、．８ ２ ／ ５ ） ０ １ ％ ２ ／ ５ ） 与基 因 测序 方 法 检 测 结 果 符 合 率 达 到 １０ 。结 论 该 多重 荧 ０％
光Ｒ Ｔ—Ｐ Ｒ检 测方法具有快速 、 Ｃ 灵敏 、 特异 的优 点 ， 用于临床病原诊 断。 可
小鼠诺如病毒数字RT-PCR定量检测方法的建立
doi:10.3969/|.issn.1006-4907.2020.03.017小鼠诺如病毒数字RT-P C R定量检测方法的建立谭建锡\禹思宇\胡忆文1,周智君2,唐连飞(1.长沙海关技术中心，湖南长沙410004:2.中南大学实验动物学部，湖南长沙410008)摘要：为了建立快速、准确定量检测小鼠诺如病毒(11111111^1101：(^1115，1^1^)的方法，试验针对)^1^高度保守区的靶向扩增引物和探针构建M N V的数字R T-P C R定量检测方法，优化其退火温度，并对其敏感性、特异性及临床应用效果进行检测。
结果表明：建立的数字R T-P C R方法能对M N V进行定量检测；最佳退火溫度为57.5尤；分别对M N V、小 鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒3型等核酸检测，除M N V外均为阴性；最低可检测到7拷贝/(X L;对不同稀释度核酸进行3次重复试验，变异系数均小于7 %;对20个小鼠盲肠样本进行M N V检测，结果与焚光R T-P C R结果一致。
说明试验建立的数字R T-P C R方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可应用于M N V的临床快速定量检测。
关键词：小鼠诺如病毒;数字R T-P C R;定量;检测方法；灵敏度；临床应用中图分类号:S858.91 文献标识码：B文章编号：1006-4907(2020)00-0039-04小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV)是 Stephanie M.K arst等于2003年在基因缺失小鼠中 分离到的[11。
几乎所有的实验小鼠对此病毒易感，在 美国、加拿大、日本等国的实验小鼠体内均监测到 该病毒'国内小鼠中的感染率也比较高Pi。
MNV 的诊断方法目前主要为分子生物学方法m和血清 学方法e。
血清学方法由于受到抗原数量少，检测 耗时长等因素影响，其实际应用受到限制。
荧光定 量R T-P C R法等分子方法因具有较好的灵敏度和 特异性,应用更为广泛，但其定量测定需要依赖标 准品建立标准曲线来进行，操作耗时费力。
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
RT-PCR的步骤
RT-PCR的步骤引言逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，用于从RNA样本中扩增特定的DNA片段。
该技术可以检测和定量特定基因的表达水平，并在疾病诊断、药物研究等领域发挥重要作用。
本文将介绍RT-PCR的步骤及其基本原理。
步骤1. 提取RNA在进行RT-PCR之前，首先需要从细胞或组织中提取RNA。
常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、硅胶酸盐柱法等。
通过这些方法，可以将总RNA或特定种类的RNA从样本中纯化出来，为后续的实验步骤提供RNA样本。
2. 逆转录（RT）逆转录是将RNA转录为相应的cDNA（互补DNA）的过程。
逆转录反应中使用逆转录酶，该酶具有转录RNA为cDNA的能力。
在逆转录反应中，逆转录酶合成一个与RNA模板互补的cDNA链。
常见的逆转录酶包括M-MLV逆转录酶和SuperScript逆转录酶等。
3. PCR扩增PCR扩增是通过引物（寡核苷酸序列）将需要扩增的目标DNA片段进行反复循环扩增的过程。
在PCR反应中，每轮反应包括三个步骤：解链、引物结合和延伸。
通过不断循环这三个步骤，DNA片段将被指数级扩增。
4. 凝胶电泳PCR扩增后，我们需要将扩增产物进行凝胶电泳，以确认是否扩增成功，并确定目标DNA片段的大小。
在凝胶电泳中，将PCR产物加载到琼脂糖凝胶孔中，并施加电场，1使DNA片段在凝胶中迁移。
通过与已知大小的DNA分子量标准进行比较，可以确定PCR扩增产物的大小。
结论RT-PCR技术已经成为分子生物学领域中不可或缺的工具。
通过逆转录和PCR扩增，可以快速、准确地扩增RNA样本中感兴趣的DNA片段，为疾病诊断和基因表达研究提供了重要的技术支持。
了解RT-PCR的步骤和基本原理，有助于更好地应用该技术进行实验和数据解读。
2。
rtpcr的原理实验步骤及应用
RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。
本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。
原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。
RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。
在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。
2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。
3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。
4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。
5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。
通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。
实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。
提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。
2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。
需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。
按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。
反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。
rt-pcr的原理实验步骤及应用
RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。
下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。
•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。
引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。
•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。
2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。
•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。
2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。
•混合反应液，然后进行逆转录反应。
此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。
2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。
•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。
•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。
PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。
2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。
•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。
3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。
荧光定量 PCR 一步法 RT-PCR 使用说明书
荧光定量PCR一步法RT-PCR使用说明书本试剂盒适用于各种动、植物、病毒RNA的荧光定量PCR 检测，反转录PCR反应体系为30µl，用户在使用此试剂盒之前请详细阅读此说明书。
本试剂盒主要有两个部分组成：RT-PCR MIX 和2×反应缓冲液。
RT-PCR MIX由反转录酶和Taq DNA聚合酶组成的混合酶，既可cDNA合成又可PCR扩增。
2×反应缓冲液对其主要成分Mg2+、dNTPs及稳定剂都已经优化，直接用于荧光定量PCR的检测，用户只需加入引物探针和一定的模板即可，适用各种荧光定量PCR仪如：lightcycler、ABI7000、icycler等。
（本试剂盒不适合做sybr green染料法）编号：ZK00101规格：10次试剂盒组成：名称浓度体积2×反应缓冲液300µlRT-PCR MIX20µl实验操作:1．取103-106拷贝的特异目的模板或1pg-1µg的总RNA或1-10ng纯化的mRNA于一支0.2或0.5ml离心管中，65-70℃保温5-10分钟，离心数秒，放置冰浴中。
（此步骤是为了变性RNA，建议保留）2．反应体系的配制：组分体积终浓度2× 反应缓冲液15µl 1×下游引物*(25pmol/ul) 1ul 0.5-1µM上游引物*(25pmol/ul) 1ul 0.5-1µM荧光探针*(25pmol/ul)0.3ull 0.2-0.5uMRT-PCR MIX2µlRNA样品或对照** YµlDEPC-ddH2O（加至终体积为30µl）Xµl终体积30µl按照指定的体积将DEPC-ddH2O、2x 反应缓冲液、RT-PCR MIX、特异上下游引物探针加入到置于冰上的0.2ml薄壁反应管中，配制成反应混合物，将反应管轻柔震荡10秒以使该混合物混匀。
实时荧光定量PCR的方法学建立
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR）的方法学建立QRT-PCR原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
检测方法包括SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法，在基础研究中，应用比较广泛的为SYBR GreenⅠ法，因此，以下主要针对SYBR GreenⅠ法的方法学建立。
一、RNA的提取及质量检测Trizol法提取RNA的原理：Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
1、用液氮将组织研碎，按照50-100 mg组织加入1mL的Trizol® Reagent（若样品为细胞，则按照5-10x106个细胞加入1mL的Trizol® Reagent来裂解细胞），室温裂解5 min，使核蛋白复合物充分分离。
2、每1 mL的Trizol® Reagent加入200 μl氯仿，剧烈摇晃、混匀，室温静置5 min。
于4℃离心机12000 g离心15 min，离心后，混合物分为下层（红色酚氯仿）中层和上层（无色的水相层，约占总体积的50%），RNA存留于上层水相中。
用移液器吸出样品中的水相转移至另一EP管中，勿吸出中间相和有机相。
3、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl异丙醇，轻轻混匀，室温孵育10 min。
于4℃离心机12000 g离心10 min，RNA沉于管底，弃上清。
4、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl 75%的乙醇洗涤RNA，于4℃离心机7500 g 离心10 min，用75%乙醇洗涤RNA两次。
5、去除管中75% 乙醇，将RNA自然晾干5 min。
流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术
流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后根据ct值和标准曲线，对未知模版进行定量分析。
常用的实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记的SYBR Green 法和特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。
一、实时荧光定量PCR原理：1、SYBR Green法：SYBR Green是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双链DNA中后发出荧光信号，其强度与双链DNA的数量相关，随着扩增产物量的增加，检测到的荧光信号增强。
2、TaqMan法：在扩增反应液中，加入一特异性探针，该探针5‘端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置靠近，5‘端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成Taq 酶的5‘→3’外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处时，发生链的置换，Taq酶的5’→3’外切活切将探针5‘端连接的报告基团从探针上切割下来，5’端报告基团的荧光能量脱离3’端荧光淬灭基团的吸收，可检测到荧光信号，每经过一个PCR循环，荧光信号也和扩增产物一样，有一个同步增长的过程。
3、分子信标法：探针设计成茎环结构的发夹状，环部核苷酸序列与扩增产物序列互补，两端核苷酸序列互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告基团和淬灭基团空间位置靠近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，此时，检测不到荧光信号，与模板结合后，探针的构象由发夹状改变为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧光信号。
核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。
流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。
GIV诺如病毒荧光定量一步RT-PCR方法的建立要点
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＧＩＶ ＮｏＶｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
诺如病毒（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ，ＮｏＶ）是单股正链、无包膜 的ＲＮＡ病毒，属于杯状病毒科诺如病毒属，是引起 全世界所有人群非细菌性Байду номын сангаас肠炎的主要病原体之 一…。根据诺如病毒衣壳区的核苷酸序列，将ＮｏＶ 分为５个基因组（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ，Ｇ），ＧＩ．ＧＶ，感染人的包 括ＧＩ、ＧＩＩ和ＧＩＶ，而ＧＩＩＩ和ＧＶ分别感染牛和鼠。 ＧＩＶ进一步分为两个基因型，感染人的ＧＩＶ．１型和
万方数据
主堡塞墅塑Ｉ堕压瘟童堂盘查！！！！至！旦筮！！鲞箜！翅鱼！也！！！』垦！Ｐ鱼！ｉ！！！竺！！垒Ｐ！ｉ！！！！！：∑！！：ｉ！：盟！：１
１材料与方法 １．１病毒标本与处理本实验中ＧＩＶ ＮｏＶ阳性毒 株（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＫＣ８９４７３１）是通过４５４高通 量测序发现，来源于河北省卢龙地区２０１１年７月的 儿童腹泻粪便标本。采用处理液ＰＢＳ对其制成 １０％便悬液，保存于一２０℃。 １．２试剂与仪器
ＲＴ－ＰＣＲ
０．２５
Ｉｘｌ；Ｑｕａｎｔｉ
Ｔｅｃｔ
ｔｘｌ；
Ｍｏｎ４Ｆ（１０ ｉｘｍｏｌ／Ｌ）、Ｍｏｎ４Ｒ（１０ ｌ＿ｚｍｏｌ／Ｌ）各１斗ｌ；
探针Ｒｉｎ９４（１０斗ｌ／Ｌ）０．５斗ｌ；ＲＮＡｓｅ・ＦＲＥＥ水７．２５
Ｎｕｃｌｅｉｃ 斗ｌ；Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡ ２．５
核酸提取试剂盒Ｖｉｒａｌ
Ｉｘｌ。反应条件为：５００Ｃ
Ａｃｉｄ ＩＩＩ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
１．７荧光定量一步ＲＴ－ＰＣＲ法使用Ｑｉａｇｅｎ公司 的Ｑｕａｎｔｉ
Ｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ
Ｋｉｔ，一步法ＲＴ－ＰＣＲ反
实时荧光定量PCR检测GI型诺瓦克样病毒方法的建立
ＡＢ Ｔ Ｓ ＲＡＣ Ｔｏ ｄ ｖ ｌｐａ Ｔａ Ｍ ａ ａ ｅ ｅ ｌ ｉ ｌｏ ｅ ｃｎ ｕ ｎｉａｉｅ ｒｖ ｒ ｅｔａ ｓｒｐ ｉｎ ｐ ｌｍｅ ａｅ ｒａ ｔ ｎ（ Ｔ： ｅ ｅｏ ｑ ｎ ｂ ｓ ｄ ｒａ— ｍｅｆｕ ｒｓｅ ｔｑ ａ ｔ ｔ ｅ ｅ ｓ ｒ ｎ ｃｉｔｏ ｏｙ ｒ ｓ ｅ ｃｉ Ｑｚ ｔ ｔ ｖ ｏ
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常规rt-pcr快速检测诺如病毒方法的建立
第21卷第2期北华大学学报(自然科学版)Vol.21No.22020年3月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science)Mar.2020文章编号:1009-4822(2020)02-0188-03DOI :10.11713/j.issn.1009-4822.2020.02.010常规RT-PCR 快速检测诺如病毒方法的建立曲㊀莉,王洪艳,李㊀环,母润红,王艳双(北华大学医学院,吉林吉林㊀132013)摘要:目的㊀建立一种可同时检测G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒(Norovirus,NOV)的常规RT-PCR 方法.方法㊀针对G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒RdRp 区域的基因进行引物设计,优化PCR 反应体系及条件,评价该方法的灵敏度㊁特异度.结果㊀该引物对诺如病毒的特异度强,同一体系内的G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒相互之间无干扰,与轮状病毒㊁星状病毒㊁肠道腺病毒㊁甲型肝炎病毒同时检测无交叉反应;对G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒核酸的最低检测限值是103拷贝/μL.结论㊀本研究建立常规RT-PCR 检测方法对G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒进行快速检测,具有很好的灵敏度和特异性.关键词:诺如病毒;双重RT-PCR;G Ⅰ型;G Ⅱ型中图分类号:R155.5文献标志码:A收稿日期:2019-03-31基金项目:吉林省科技发展计划项目(20190303093SF,20190303047SF);2018年国家级大学生创新创业训练项目(201811923016).作者简介:曲㊀莉(1978 ),女,讲师,主要从事食品分子生物学研究,E-mail:chenning_qu@;通信作者:王艳双(1971 ),女,副教授,主要从事分子生物学研究,E-mail:wangys5521@.Establishment of Detection of Norovirus with RT-PCRQU Li,WANG Hongyan,LI huan,MU Runhong,WANG Yanshuang(Medical College of Beihua University ,Jilin 132013,China )Abstract :Objective To establish RT-PCR method for detecting simultaneously Norovirus G Ⅰand GⅡ.Method Primers were designed for RdRp genes of Norovirus G Ⅰand G Ⅱ,the PCR reaction system and con-ditions were optimized,and the sensitivity and specificity of the method were evaluated.Results The primer processed high specificity for Norovirus and without any evident cross-reaction with each other or with other enteric viruses,including Rotavirus,Stellatevirus,Enterovirus and Hepatities.A virus at the same time,the detection limit of conventional RT-PCR was 103copies /μL.Conclusion The establishment of conventional RT-PCR has good sensitivity and specificity to detect rapidly Norovirus.Key words :Norovirus;double RT-PCR;G Ⅰ;G Ⅱ㊀㊀诺如病毒(Norovirus,NOV)属于嵌杯病毒科诺瓦克样病毒属,是一种单链RNA 病毒,人和动物感染后可引起急性胃肠炎,根据其病毒的RNA 聚合酶和衣壳蛋白核苷酸序列分为5个基因型,其中,G Ⅰ㊁G Ⅱ和GⅣ基因型主要感染人类,G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒引起人类感染急性胃肠炎较多见[1-2].目前针对诺如病毒的检测方法有电镜法㊁免疫学法㊁分子生物学法.电镜法检测的灵敏度较低,免疫法的特异度有待提高,分子生物学检测方法主要以反转录(RT)-PCR 为主,RT-PCR 通过对病毒目标基因片段进行扩增检测,其灵敏度和特异度较好[3].对诺如病毒的保守区域进行引物设计,如ORF1-ORF2[4]连接处㊁RNA 聚合酶区域[5]是检测诺如病毒理想的引物设计区域[6-7].本实验主要针对RNA 聚合酶区域进行引物设计,该区域特异性较好,有利于提高检测的灵敏度和特异度.诺如病毒感染人类后,其免疫保护时间短,传播途径多样,人群普遍易感染,具有高度感染性和快速传播的特点,所以加强对诺如病毒的检测,建立灵敏度㊁特异度高的检测方法,将有利于疾病的预防和控制.1㊀材料与仪器1.1㊀材㊀㊀料G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒㊁轮状病毒㊁星状病毒㊁肠道腺病毒㊁甲型肝炎病毒(由吉林省疾控中心赠送).1.2㊀主要试剂和仪器反转录试剂盒(Thermo 公司,美国);DNA Marker(宝生物工程(大连)有限公司);2xTaq PCR Master Mix(上海天根生物技术公司);琼脂糖㊁PBS (GIBCO 公司,美国);高速冷冻离心机(Eppendorf 公司,德国);紫外凝胶成像分析仪(Biorad 公司,美国);9700PCR 扩增仪(ABI 公司,美国);DYY-8B 型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂).2㊀方㊀㊀法2.1㊀RT-PCR 方法的建立2.1.1㊀反转录病毒RNA 反转录及cDNA 的合成:用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录,具体步骤:将无核酸酶PCR 管放置在冰面上,加入模板RNA 引物无水酶至总体积12μL.65ħ水浴5min,转至冰上;5ˑ缓冲液4μL㊁RNA 酶抑制剂1μL㊁10mmol 的dNTP 混合物2μL㊁M-Mul VRT 1μL,轻轻混匀,短暂离心.用随机片段引物合成cDNA,25ħ水浴5min,42ħ水浴60min.终止反应温度达到70ħ,5min.2.1.2㊀引物设计针对诺如病毒的聚合酶(RdRp )区,采用primer3在线设计引物(上海生工生物工程有限公司合成).引物序列见表1.表1㊀常规RT-PCR 应用的引物Tab.1㊀Primer sequence of conventional RT-PCR 方法诺如病毒引物序列(5ᶄң3ᶄ)片断/bp RT-PCRG ⅠLEFTGTTGCAACTGCTGGACAAAT 162RIGHT TAAATGGGCGAGGAAAGGAT G ⅡLEFT GCCCTGACAAAACTGAAGGA 111RIGHTGCTCCAGTTTTCCAAACCAA2.1.3㊀PCR 扩增及产物检测本实验的PCR 体系为25μL,其组分:2ˑTaq PCR Master Mix 12μL,上下游引物各1μL,模板2.0μL,用灭菌双蒸馏水补足至25μL.PCR 的反应条件:95ħ预变性3min;95ħ变性30s;60ħ退火30s;72ħ延伸30s;共30个循环,72ħ最终延伸5min.PCR 产物检测:将PCR 产物在1.5%的琼脂糖凝胶上鉴定,电压为60~80V,20min,经紫外光线检测拍照.2.2㊀灵敏度实验用紫外分光光度计对阳性G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒的RNA 进行定量,调整至相同浓度后,以10倍梯度系列稀释病毒液,运用建立的RT-PCR 对100㊁101㊁102㊁103㊁104㊁105拷贝/μL 的G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒进行检测,分析实验的灵敏度.2.3㊀特异性实验对G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒㊁轮状病毒㊁星状病毒㊁肠道腺病毒㊁甲型肝炎病毒进行检测,验证其特异性.3㊀结㊀㊀果3.1㊀PCR 鉴定结果通过对诺如病毒的RNA 聚合酶区域进行引物设计,通过反复梯度PCR 实验,最终确定退火温度60ħ,在该条件下,可以得到G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒目的基因片段.3.2㊀灵敏度结果105㊁104㊁103拷贝/μL 的G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒均扩增出相应的目的条带,即最低检测限为103拷贝/μL 时,对G Ⅰ㊁G Ⅱ型诺如病毒的检测具有较好的灵敏度.见图1.3.3㊀特异性结果G Ⅰ㊁G Ⅱ诺如病毒分别在162bp 和111bp 出现目的基因片段,诺如病毒亚型间无交叉反应,与轮状病毒㊁星状病毒㊁肠道腺病毒㊁甲型肝炎病毒同时检测均无目的条带扩增,说明该方法具有良好的特异性.见图2.M.DNA marker;1~6.诺如病毒G Ⅰ(A)㊁G Ⅱ(B)105~100拷贝/μL;7.阴性对照图1常规RT-PCR 对G Ⅰ(A )㊁G Ⅱ(B )型诺如病毒检测的灵敏性Fig.1Sensitivity of conventional RT-PCR for NVs G Ⅰ(A )and G Ⅱ(B )981第2期曲㊀莉,等:常规RT-PCR 快速检测诺如病毒方法的建立M.DNA marker;1~6.诺如病毒GⅠ㊁GⅡ㊁轮状病毒㊁星状病毒㊁肠道腺病毒㊁甲型肝炎病毒;7.阴性对照.图2常规RT-PCR对GⅠ(A)㊁GⅡ(B)型诺如病毒检测的特异性Fig.2Specificity of conventional RT-PCR for NVs GⅠ(A)and GⅡ(B)4㊀讨㊀㊀论诺如病毒是引起秋冬季托幼机构及学校等人群密集场所急性胃肠炎暴发的主要病原体之一,具有高度传染性.据报道,美国95%的非细菌性胃肠炎是由诺如病毒引起的[8],在我国的广州[9]㊁北京[10]㊁天津[11]等地,诺如病毒也是引起急性胃肠炎特别是婴幼儿急性腹泻的主要病原体.由此可见,诺如病毒是全世界引发非细菌性胃肠炎暴发的主要病原体,可引起严重的公共卫生问题.诺如病毒属于单股正链RNA病毒,容易发生变异,存在多种型别,GⅠ㊁GⅡ型诺如病毒其基因型可以分为14和17个基因型[7].因此,建立针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒操作简单㊁重复性好㊁特异性强的检测方法尤为重要.本研究应用基于核酸扩增的PCR技术进行诺如病毒的检测,设计区分度高㊁特异性好的引物是关键.在目的基因的选择上针对其RNA聚合酶区域自行设计引物,该区域是诺如病毒不同基因型较为保守且特异的区域[5],扩增162bp和111bp长度序列,适用于快速检测和今后定量实验.在退火温度的选择上,经过反复梯度温度实验摸索,将退火温度确定为60ħ,在该温度下,双重引物PCR 体系目的基因条带清晰.灵敏度实验结果显示:该方法的最低检测限为103拷贝/μL,作为常规PCR 该检测限灵敏度较高.该方法的引物对诺如病毒显示出很好的特异性,GⅠ㊁GⅡ型诺如病毒间无交叉反应,在与轮状病毒㊁星状病毒㊁肠道腺病毒㊁甲型肝炎病毒同时进行检测时,能与其他常见腹泻病毒区分开.诺如病毒基因型复杂,目前不能进行细胞培养,但在外界存活能力强,致病量低,较低病毒浓度即可引起感染,人感染后可引起急性胃肠炎[5].本研究成功建立常规RT-PCR方法及反应体系,稳定快速的扩增GⅠ㊁GⅡ型诺如病毒目的基因片段,而且片段大小适用于荧光定量检测,为今后荧光定量实验奠定了基础.此外,该方法对突发公共卫生事件中GⅠ㊁GⅡ型诺如病毒的快速检测具有较好的应用价值.致谢:本文是国家级大学创业训练项目(201811923016)研究成果的一部分,医学院2015级林国娇㊁符钧朝㊁张嘉溪参加了本实验研究工作.参考文献:[1]KRONEMAN A,VEGA E,VENNEMA H,et al.Proposal for a unified norovirus nomenclature and genotyping[J]. 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[11]阴杰莹.天津市轮状病毒和诺如病毒腹泻的研究[D].天津:天津医科大学,2011.ʌ责任编辑:陈丽华ɔ091北华大学学报(自然科学版)第21卷。
常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用
常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用钱明明;许海燕;宗晴;阴甜甜;杨文彬;宋召军;黄金林;焦新安【摘要】目的建立GⅠ、GⅡ型诺如病毒的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法,并对两种方法进行应用.方法优化筛选出最佳PCR反应体系与反应条件,并从灵敏性、特异性、临床样品检测等方面对建立的方法进行比较与评价.结果该两种方法特异性强,与札幌病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应,同一体系内GⅠ、GⅡ型诺如病毒相互之间没有干扰;常规RT-PCR最低检测限为103 copies/μL,荧光定量RT-PCR最低检测限为102 copies/μL;对180份临床粪便样品进行检测,常规RT-PCR则检测率为5.56％(10/180),符合率达97.22％,荧光定量RT-PCR检测率为8.33％(15/180),符合率达100％;对15份阳性样品测序分析,证实均为诺如病毒.结论建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可用于诺如病毒的快速检测,荧光定量RT-PCR更为灵敏.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2015(031)007【总页数】6页(P602-606,611)【关键词】常规RT-PCR;荧光定量RT-PCR;GⅠ、GⅡ型诺如病毒【作者】钱明明;许海燕;宗晴;阴甜甜;杨文彬;宋召军;黄金林;焦新安【作者单位】扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;南通市疾病预防控制中心,南通 226000;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009【正文语种】中文【中图分类】R450诺如病毒(Norovirus，NVs)属于杯状病毒科诺如病毒属，是引起非细菌性急性胃肠炎的主要病原体，世界50%以上的胃肠炎暴发均由它引起[1]。
RT-PCR_原理介绍
Real-time PCR(RT-PCR) 原理介绍实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估
荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估夏体娇;金敏;陈照立;王景峰;谌志强;邱志刚;李君文【期刊名称】《解放军预防医学杂志》【年(卷),期】2013(31)3【摘要】目的建立灵敏、特异的诺如病毒基因Ⅱ型的荧光定量RT-PCR方法,用于临床腹泻粪便样本病毒的定量检测。
方法构建质粒DNA,并转录合成RNA作为标准品,建立和优化诺如病毒基因Ⅱ型荧光定量RT-PCR方法和反应体系,评价该方法的灵敏度、特异性、重复性,并进行临床粪便样本的检测。
结果此方法最低可以检出102拷贝数/μl,能特异地检出诺如病毒基因Ⅱ型,与诺如病毒基因Ⅰ型无交叉反应,与柯萨奇病毒B组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、星状病毒、甲肝病毒、埃可病毒和轮状病毒无交叉反应。
针对标准品,2次批内试验的荧光信号循阈值(Ct值)变异系数(CV)分别为1.60%、0.70%,2次批间试验的变异系数(CV)分别为0.40%、0.40%,均在5%以下。
结论本研究建立的实时定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型的方法,其灵敏度、特异性和重复性良好,可用于该病毒的快速检测。
【总页数】4页(P200-203)【关键词】诺如病毒;基因Ⅱ型;逆转录PCR;实时荧光定量RT-PCR【作者】夏体娇;金敏;陈照立;王景峰;谌志强;邱志刚;李君文【作者单位】军事医学科学院卫生学环境医学研究所【正文语种】中文【中图分类】R735.2【相关文献】1.常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用 [J], 钱明明;许海燕;宗晴;阴甜甜;杨文彬;宋召军;黄金林;焦新安2.多重荧光 RT-PCR同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒方法的建立 [J], 纪蕾;韩建康;吴晓芳;徐德顺;邱妤怡;陈莉萍;沈月华;查赟峰3.浅论荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测G Ⅰ、G Ⅱ型诺如病毒比较研究 [J], 蒋邱逃;孙华杰4.结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 袁文;王静;赵维波;张钰;郭鹏举;黄韧5.常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的研究和应用[J], 郭艳飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一步法多重荧光定量RT-PCR检测人杯状病毒的建立及应用
一步法多重荧光定量RT-PCR检测人杯状病毒的建立及应用王原;崔大伟;胡正军;陈功祥【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2014(32)9【摘要】目的建立检测人杯状病毒(human calieivirus,HuCVs,主要包括SV、NoV-G Ⅰ和NoV-GⅡ)的一步法多重荧光定量RT-PCR (rRT-PCR)法.方法用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针,通过合成的对应病毒基因的质粒来评价该方法的灵敏度、特异性和重复性,检测临床标本并对阳性结果进行基因测序验证.结果建立的rRT-PCR法检测SV、NoV-G Ⅰ和NoV-GⅡ的灵敏度均达到103 copies/mL,特异性为100％,且变异系数(CV)均≤1.275％.HuCVs检出率为21.43％(75/350),其中SV、NoV-G Ⅰ和NoV-GⅡ分别为14.67％(11/75)、21.33％ (16/75)和64.00％(48/75).随机选择检测阳性结果进行测序,结果均与该法检测结果一致.结论建立的rRT-PCR法可同时检测并区分SV、NoV-G Ⅰ和NoV-GⅡ病毒,可用于HuCVs引起的急性腹泻散发和暴发疫情的监测.【总页数】5页(P647-651)【作者】王原;崔大伟;胡正军;陈功祥【作者单位】浙江大学医学院,杭州310058;浙江中医药大学附属第一医院检验科,杭州310016;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江中医药大学附属第一医院检验科,杭州310016;浙江大学医学院,杭州310058;浙江大学医学院附属第二医院检验科,杭州310009【正文语种】中文【中图分类】R446.5【相关文献】1.一步法TaqMan(R)探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用 [J], 路斌;袁秀芳;徐丽华;李军星;郭勇;王一成2.PEDV和TGEV双重TaqMan荧光定量一步法RT-PCR检测方法的建立及应用[J], 侯月娥;伍建敏;李中圣3.H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 刘好朋;胡京京;唐续;裴仉福;李冰;李琳;陈瑞爱;贺东生4.鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测方法的建立 [J], 王建昌;王金凤;袁万哲;刘立兵5.新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 [J], 云涛; 华炯钢; 叶伟成; 倪征; 陈柳; 张存因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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Ｓ（共４５个循
Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；２×
环）；在６０℃收集荧光信号。 １．８荧光定量一步ＲＴ－ＰＣＲ法灵敏度实验 将已 知拷贝数的标准品进行１０倍梯度稀释（１０８—１０１拷 贝／ｕ１），对它们进行荧光定量一步ＲＴ．ＰＣＲ法检测， 以检测其检出范围和最低检测限。 １．９荧光定量一步ＲＴ—ＰＣＲ法特异性实验 利用
Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
技术有限公司；体外转录试剂盒ＭＥＧＡ 和转录物纯化试剂盒ＭＥＧＡ
ｃｌｅａｒ
Ｋｉｔ购自ＡＢＩ公
司；限制性内切酶及相应Ｂｕｆｆｅｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司； 荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒Ｑｕａｎｔｉ 仪为ＡＢＩ公司产品。
１．３
Ｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ
ｕｓｅｄ
ｔｏ
ａｓｓｅｓｓ
ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ １０。～１０８ｅｏｐｉｅｓ／灿１．
Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ Ｎｏ
ＣＲＯＳＳ
ｍｅｔｈｏｄ ｒｅａｃｈｅｄ １．０×１０２ ｃｏｐｉｅｓ／斗１．ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ
ｗａｓ
ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ
ＲＮＡ标准品，在同一周内选
序列为基础，人工合成１２７ ｂｐ的核苷酸序列作为荧 光定量一步ＲＴ－ＰＣＲ的标准品（表１），由北京 Ｔｓｉｎｇｋｅ公司完成。此序列与ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩＶ参考株 同源性接近９９％。 将合成的核苷酸序列克隆人ＰＧＥＭ．Ｔｅａｓｙ载体 中，位于载体１７启动子之后。将此重组体转化进 入Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ感受态细胞扩增，然后用质粒提取 试剂盒（Ｈｉｇｈ－Ｓｐｅｅｄ
ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ
ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＧＩＶ ＮｏＶｓ ｏｆ
ｗｅｒｅ
ｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｗａｓ
ｍｅｔｈｏｄ
ｅｖａｌｕａｔｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ
ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
ＲＴ—ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ
ＲＴ－ＰＣＲ
０．２５
Ｉｘｌ；Ｑｕａｎｔｉ
Ｔｅｃｔ
ｔｘｌ；
Ｍｏｎ４Ｆ（１０ ｉｘｍｏｌ／Ｌ）、Ｍｏｎ４Ｒ（１０ ｌ＿ｚｍｏｌ／Ｌ）各１斗ｌ；
探针Ｒｉｎ９４（１０斗ｌ／Ｌ）０．５斗ｌ；ＲＮＡｓｅ・ＦＲＥＥ水７．２５
Ｎｕｃｌｅｉｃ 斗ｌ；Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡ ２．５
核酸提取试剂盒Ｖｉｒａｌ
Ｉｘｌ。反应条件为：５００Ｃ
ＮｏＶｓ（ＧＩ．ＧＩＩ），ｅｎｔｅｒｉｃ
ｒｅｐｅａｔｅｄ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ
ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｎｔｒａ—ａｓｓａｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ・ａｓｓａｙ
ｏｔｈｅｒｓ
ｗａｓ
ｆｏｕｎｄ，
ｖａｒｉａｔｉｏｎ
ｓｈｏｗｉｎｇ ｈｉｇｈ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｂｙ Ｃｔ ｖａｌｕｅ
Ｚｈａｏｊｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａ巧ｕｎｄ＠１ ２６．ｃｏｍ
Ｔｏ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ
ｗｅｒｅ
ｏｎｅ
ｓｔｅｐ ｏｆ
ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
・２０８
主堡塞堕塑！堕压遁垂堂盘查垫！！至！旦箜！！鲞篓！塑璺！！！！塑！兰翌璺！ｉ！！！竺！！垒四！！！！！：！！！：！！！盟！：！
技术方法．
ＧＩＶ诺如病毒荧光定量一步ＲＴ—ＰＣＲ方法
的建立
敖元云
虞结梅
周冬梅靳淼
李莉莉
段招军
１０００５２北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所腹泻室 通信作者：段招军，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｊｕｎｄ＠１２６．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９２７９．２０１６．０２．０２４
【摘要】
目的建立灵敏、特异的ＧＩＶ诺如病毒的荧光定量检测方法。方法合成针对ＧＩＶ诺
如病毒的特异性引物以及Ｔａｑｍａｎ探针，优化反应体系及条件，根据我国新发人ＧＩＶ诺如病毒序列 （ＧｅｎＢａｎｋ序列号：ＫＣ８９４７３１）构建荧光定量检测的ＲＮＡ标准品，对其灵敏度、特异性、重复性进行评 估，以传统逆转录－聚合酶链反应（Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｒｅ
ｆｏｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅ彬ｎｇ １０００５２，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｄｕａｎ
ｗａｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅ
ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ
（ＣＶ）ａｂｏｕｔ
１．３１％ａｎｄ ３．６８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ
ｑｕａｎｔｉｔｙ
ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｈｉｇｈ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ
ａｃｃｕｒａｔｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
ＮｏＶｓ
ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＩＶ ＮｏＶｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｐｒｏｂｅ
ＧＩＶ
ａｎａｌｙｓｅｄ ａｎｄ
ｗａｓ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｈｉｓ
ｔｏ
ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｏｕｒ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ＲＮＡ ｓｔａｎｄａｒｄ
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＧＩＶ ＮｏＶｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
诺如病毒（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ，ＮｏＶ）是单股正链、无包膜 的ＲＮＡ病毒，属于杯状病毒科诺如病毒属，是引起 全世界所有人群非细菌性霄肠炎的主要病原体之 一…。根据诺如病毒衣壳区的核苷酸序列，将ＮｏＶ 分为５个基因组（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ，Ｇ），ＧＩ．ＧＶ，感染人的包 括ＧＩ、ＧＩＩ和ＧＩＶ，而ＧＩＩＩ和ＧＶ分别感染牛和鼠。 ＧＩＶ进一步分为两个基因型，感染人的ＧＩＶ．１型和
ＮｏＶｓ
选
ＲＮＡ标准品，
进行荧光定量一步ＲＴ－ＰＣＲ法检测，利用同一批体 系对每个稀释度同时进行５次平行检测，作为批内 重复试验，计算各稀释度ｃｆ值的平均值和变异系 数，以评价反应体系的稳定性。并选取１０ ７～１０５拷 贝／斗ｌ范围的ＧＩＶ
ＮｏＶ
ＩＩ从便悬液中提取核酸，方法见说明书。 １．６标准品制备 以本实验室ＧＩＶ毒株ＫＣ８９４７３１
ｃｌｅａｒ
～１０２拷贝／“１范围内有极好的线性关系（图１Ａ）。 以ＲＮＡ拷贝数为横坐标，ｃ￡值为纵坐标绘制标准 曲线，得到ＧＩＶ ＮｏＶ的标准曲线方程为：Ｃｔ＝３７．２９ —３．４４７×ｌｏｇ（Ｘ），ｒ＝０．９９８，扩增效率为９５．０２５％
（图１ Ｂ）。
录产物纯化试剂盒（ＭＥＧＡ
Ｋｉｔ）方法进行纯
化。在２６０ ｎｍ处，用分光光度仪对其定量，使用无 核酸酶水稀释至１０…拷贝／斗ｌ，以作为荧光定量检测 的标准品，保存于一７０℃。
２．１
Ｋｉｔ）提取质粒。用
ＰＶＵＩＩ单酶双切后，电泳并切割６００ ｂｐ片段左右的 凝胶带，按照凝胶回收试剂盒（ＱＩＡｑｕｉｃｋ
Ｅｘｔｒａｒｉｐｔ
证序列正确性。用体外转录试剂盒（ＭＥＧＡ
Ｔ７
标准曲线的建立ＧＩＶ ＮｏＶ的检测结果在１０８
Ｋｉｔ）对纯化线性质粒进行体外转录，然后按照转
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ・ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ—ＰＣＲ）的方法作
为参考评价。结果该方法检测的灵敏度可以达到１．０×１０２拷贝／Ｉｚｌ，检测范围为１０２～１０８拷贝／
ｔｒｌ；与ＧＩ、ＧＩＩ诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒等无交叉反应；批内和批间重复性实验的循 环阈值（Ｃｔ）变异系数（ＣＶ）分Ｙ，ｔｌｄ，于１．３１％和３．６８％；在阳性粪便标本的对比检测中发现，该方法与 普通ＲＴ．ＰＣＲ相比具有灵敏度高、能够定量的优势。结论本研究建立的检测ＧＩＶ诺如病毒的荧光 定量一步ＲＴ—ＰＣＲ法，可应用于Ｇ１Ｖ诺如病毒的检测。 【主题词】 诺如病毒；ＧＩＶ；荧光定量
Ｋｉｔ购自Ｑｉａｇｅｎ公司。仪器ＡＢｌ７５００荧光定量ＰＣＲ 分析软件Ｐｒｉｍｅｒ
建立起的荧光定量一步ＲＴ—ＰＣＲ法，对ＧＩＶ、ＧＩ和
ＧＩＩ
ＮｏＶｓ的ＲＮＡ标准品，以及轮状病毒、肠道腺病
Ｐｒｅｍｉｅｒ５、ＤＮＡ ＭＡＮ６．０、
毒、星状病毒等腹泻相关病毒核酸进行检测，验证其 特异性。 １．１０荧光定量一步ＲＴ－ＰＣＲ法重复性实验 取１０ ７～１０５拷贝／ｉＬｌ范围的ＧＩＶ
感染动物的ＧＩＶ．２型【２１。ＧＩ和ＧＩＩ是诺如病毒引 起胃肠炎暴发最常见的两个遗传组＂…，而ＧＩＶ引 起暴发的报道却是很少见，我国目前未见有关ＧＩＶ ＮｏＶｓ报道。本实验室利用４５４高通量测序技术首 次在我国河北省卢龙县发现人ＧＩＶ．１ ＮｏＶ毒株＂。， 以此临床样本为基础，建立了灵敏、快速、特异性的 ＧＩＶ诺如病毒荧光定量ＰＣＲ检测方法。