线粒体的超活染色与观察

【实验目的】

掌握动物细胞活体染色的原理和相关的技术。

【实验原理】

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。

詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

【实验用品】

1、材料：

小白鼠肝脏、睾丸

2、试剂：

Ringer溶液：NaCl 0.85g + KCl 0.25g + CaCl2 0.03g + 蒸馏水100ml；

1%、1/5000詹纳斯绿B溶液：称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，30-40℃加热，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即为1/5000工作液装入棕色瓶中备用。

3、器材：

显微镜、解剖盘、剪刀、吸管、载玻片、盖玻片、擦镜纸

【实验步骤】

1、用断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝组织，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3，

放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污。

2、在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加1/5000詹纳斯绿B溶液，再将肝组织块移入染液中，注意不

可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20～30min)。

3、吸去染液，用眼科剪将组织块着色部分剪下重置小烧杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀充分

剪碎制悬液。

4、取上述细胞悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察。

5、 将小鼠的睾丸连带附睾一起分离取下，放置于小烧杯中并用剪刀充分剪碎至匀浆状，滴加1/5000

詹纳斯绿B 溶液进行染色，重复第4步观察并比较肝细胞线粒体与精子线粒体鞘。

【实验结果】

在高倍镜下观察到了小鼠肝细胞，肝细胞质中的线粒体被染成蓝绿色。每个细胞中都有一些被染成蓝绿色的球状结构，为线粒体。另外，在观察小鼠附睾中的精子细胞可见长形的线粒体鞘也被染成蓝绿色。如图所示：

图1 高倍镜下肝细胞线粒体超活染色图（10×40）

线粒体

肝细胞

精子线粒体鞘

图2 高倍镜下精子线粒体鞘超活染色图（10×40）

【观察结果分析】

1、实验制得的装片在显微镜下不容易找到线粒体被染色的肝细胞，原因是染色不够彻底。染色过程

中未注意不断添加染色剂。

2、观察时发现肝细胞周围有许多小细胞，即红细胞，原因是在使用Ringer液浸泡组织块时，没有使

血完全渗出；而精子周围有许多圆形细胞，即睾丸中的精原细胞或精母细胞。

【分析与讨论】

1、在取肝脏时要注意大小，大概为指甲盖的1/3左右为宜，且不宜太厚，防止里面的线粒体不宜被

染色，影响实验结果的观察。

2、在染色过程中要注意不可把肝脏小块全部浸没在染色液下，这样会使肝脏小块进行有氧呼吸，则

詹纳斯绿B无法被细胞色素氧化酶充分氧化，导致实验失败。

3、染色过程中要注意滴加染液，防止染色液挥发干，使肝脏小块充分染色。

4、观察时要注意区分肝细胞和红细胞，肝细胞体积相对于红细胞来说较大。

5、制片之前要将组织块尽量剪碎分散，以保证较好的观察效果。

6、在观察小鼠精子线粒体鞘时操作要迅速，捣碎充分，才能有机会看到精子的游动过程。