基因芯片技术及其在食品工业中的应用
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作者简介 :李山云 (1981 - ) ,男 ,云南农业大学食品科学与技术学院 在读硕士研究生 。E2mail :lishanyun1981 @sohu. com
收稿日期 :2005 - 03 - 22
72
向其他方面扩展 。近几年来 ,基因芯片的应用也开始在食品 工业中崭露头角 。
1 概述
111 概念 基因芯片就是采用微加工和微电子技术将大量的人工
2 在食品工业中的应用
211 在食品营养成分检测中的应用 目前 ,随着社会的发展 ,人们对所消费的食品的要求也
越来越高 ,不但对食品的加工环节的安全性有了更高的要 求 ,而且对食品原料的生产环节也有了更高要求 。传统的检 测方法对食品的营养成分检测是非常繁琐的 ,更不用说对不 同食品的类别和性质进行真伪鉴定了 。基因芯片技术可用 来研究食品的营养成分 ,对食品的类别和性质进行快速准确 的鉴定 。如法国“biomerieux”公司 ,在 2004 年 2 月制作出名为 “食品 专 家 - ID”的 包 括 精 心 选 自 33 种 脊 椎 动 物 的 具 有 88000 个探针的基因芯片 。这种芯片可以用于动物食品的品 质鉴定 ,以确认该食品是否货真价实 ,如在鹅肝酱中是否掺 了廉价的猪肝 ;该芯片还能对食品原料的安全性进行检测 , 如做牛肉干的牛在饲养时是否吃了其他脊椎动物副产品等 。 另外 ,基因芯片还可用于研究营养素的摄入与动物蛋白和基 因表达的关系 ,这将为进一步阐明人类各种营养素缺乏症和 营养过剩引起的疾病 (如 : 夜盲症 、肿瘤 、动脉粥样硬化 、肥 胖 、糖尿病等) 的机理打下基础[8] 。Lyakhovich 等[9] 应用 DNA 芯片技术检测 1 ,252二羟维生素 D3 处理过的乳腺癌细胞的 FGF27 的表达 ,发现无论在 mRNA 水平还是在蛋白水平都有 明显的增加 ,从而首次揭示了维生素 D 可能通过调节 FGF27 的表达而调节细胞的生长分化 。 212 在食品安全性检测中的应用 21211 对致病微生物的检测 食品最常见的污染就是微生 物污染 。因此 ,食品中的病原性微生物的检测是食品卫生检 测中一个重要的方面 。食品被微生物污染不但会造成巨大 的经济损失 ,致病微生物的存在还会严重威胁人类的健康 。 而食品在生产 、加工 、运输 、销售 、消费等各个环节都很容易 被各种病菌污染 。食品微生物的检验是确保食品质量和安 全的重要手段 ,同时也是防止致病菌的污染和各种食源性传 染病的蔓延的重要手段 。传统的生化培养检测方法需要经 过几天的微生物培养和复杂的计数 ,操作费时而繁杂 ,对于 食品这种“等不得”的商品来说 ,这种方法不能及时反映生产 过程或销售过程中的污染情况 ,且灵敏度不高 。其他的分子 生物学方法 (如 PCR 法 ,分支探针 ,肽核酸探针等) 尽管快速 、 灵敏 ,但大多一次只能检测一种微生物 ,且假阳性较多[10] 。 基因芯片不仅快速 、灵敏 ,而且一次可以鉴别多种微生物及 同种微生物的菌株和亚型[11] 。Troesch[12] 等首先将基因芯片 技术用于分枝杆菌的分型及耐药性的鉴定 , 他们通过基因 芯片对 26 种分枝杆菌和所有的耐利福平突变体进行检测 , 均得到了正确的鉴定 。Anthoney[13]等人建立了一个在 4 h 内 便可检测和识别出微生物的方法 ,该法首先通过 PCR 法扩增
设计好的基因片段有序地 、高密度地排列在玻璃片或纤维膜 等载体而得到的一种信息检测芯片 ,其本质名字是脱氧核糖 核酸微阵列 。 112 工作原理
基因芯片的工作原理是利用碱基配对的原理来检测样 品的基因 。将待测样品的 DNA 或 RNA 通过 PCR 或 RT2PCR 扩增 、体外转录等技术掺入标记分子后 ,与位于芯片上的已 知碱基顺序的 DNA 探针杂交 ,再通过扫描系统 (如激光共焦 扫描成像检测系统) 检测探针分子杂交信号强度 ,然后以计 算机技术对信号进行综合分析后 ,即可获得样品中大量基因 序列及表达信息 ,以对之做出定性及定量的研究 。 113 主要类型 11311 原位合成型 指根据预先设计的点阵序列在每个位 点通过照相平板印刷技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成 技术 直 接 聚 合 得 到 DNA 芯 片 。最 先 开 发 这 一 技 术 的 是 Affymetrix 公司 ,Affymetrix 公司采用这种技术生产的基因芯片 能够在一片 1 cm 多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸 探针 。该方法有两类 :光引导原位聚合技术与原位喷印合成 技术 。光引导原位聚合技术的原理是在合成碱基单体的 5’ 羟基末端连上一个光敏保护基 。合成的第一步是首先使支 持物羟基化 ,并用光敏保护基团将其保护起来 ,选取适当的 蔽光膜使需要聚合的部位透光 ,其它部位不透光 ,利用光照 射使羟基端解保护 ,然后将一个 5’端保护的核苷酸单体连接 上去 ,这个过程反复进行直至合成完毕 。因为合成所用的单 体分子一端按传统固相合成方法活化 ,另一端受光敏保护基 的保护 ,所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基 团 。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的
LI Shan2yun LIN Qi LI Wei2qiang
(云南农业大学食品科学与技术学院 ,云南 昆明 650201)
( College of Food Science and Technology , Yunnan Agricultural University , Kunming , Yunnan 650201 , China)
基因芯片技术是 90 年代中期发展起来的一项新生物技 术 ,它是融合了生命科学 、化学 、微电子技术 、计算机科学 、统 计学和生命信息学等多种学科的最新 技 术 。1991 年 美 国 Affymetrix 公司成功地研制出第一块寡核苷酸基因芯片后 [1] , 又在 1996 年制作出世界上首批可以在药物筛选和实验室试 验应用的 DNA 芯片 ,并制作出芯片系统 ,使得基因芯片广阔 的应用前景开始被人们所认识[2] 。随后美国的 Nanogen 公 司 、Syntexi 公 司 、Incyte 公 司 及 日 本 、欧 洲 各 国 都 积 极 开 展 DNA 芯片研究工作 ;摩托罗拉 、惠普 、IBM 等跨国公司也相继 投以巨资开展芯片研究 。我国从 1998 基因芯片研究被中科 院列为“九五”特别支持项目以来 ,国内许多高校和科研单位 也积极开展了此项研究 ,目前在 DNA 芯片设计 、基片修饰 、 探针固定 、样品标记 、杂交和检测等方面的技术都有较大的 进展 ,在微阵列芯片和基于 MEBS 的芯片方面有大的突破 , 已研制出乙肝病毒多态性检测芯片 、多种恶性肿瘤病毒基因 芯片等有一定实用意义的基因芯片 。目前 ,在世界各国的积 极推动下 ,在基因芯片的应用领域也开始从最初的医学领域
专论与综述
2来自百度文库05 年第 4 期
阵列 ,在合成循环中探针数目呈指数增长 。芯片原位喷印合 成技术的原理与喷墨打印类似 ,所用技术也是常规的固相合 成方法 ,不过芯片喷印头和墨盒有多个 ,墨盒中装的不是碳 粉而是四种碱基合成的试剂 。喷印头可在整个芯片上移动 并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印 在芯片上特定位置[3] 。 11312 “点膜”型 先合成好探针 、cDNA 或基因组 DNA ,然 后将其用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度 涂布于硝酸纤维膜 、尼龙膜或玻片上 。支持物应事先进行特 定处理 ,例如包被带正电荷的氨基硅烷 ,以便能够牢固地结 合寡核苷酸分子 。该方法比原位合成法简单 ,芯片上探针不 受探针分子大小种类的限制 ,能够灵活机动地根据使用者的 要求制作出符合目的的芯片 ,因此是目前大多数中小型公司 所采用的方法[3 ,4] 。 11313 集成电路型 将杂交技术与微电子技术结合于一体 有目的地通过电子装置检测或控制 DNA 等生物大分子的作 用过程而合成的芯片 。Nanogen 公司开发了多位点电控阵列 并含独立可寻址检测区域的微电子基因芯片 ,其基质全部是 硅 、锗等基础的半导体材料 ,在其上构建 25～400 个微铂电极 位点 ,各个位点可由计算机独立或组合控制 。 114 主要特点 11411 自动化程度高 现在 ,随着基因工程技术的发展和各 学科的交叉渗透 ,基因芯片技术中从基因探针的构建到目的 基因的检出都在很大程度上实现了自动化 。如应用 PCR 仪 快速获得探针 ;用自动杂交系统将放入其中的基因芯片与荧 光标记产物按碱基配对的原则进行固相杂交 ;用激光共聚焦 扫描仪对芯片上的荧光信号进行扫描 ;最后用计算机系统对 每一探针上的荧光信号作比较和检测 ,并显示出有关的信息 等[5] 。 11412 序列数量大 ,检测效率高 由于芯片制造技术的发 展 ,在同一块芯片上已经能放置几千到几十万个基因探针 , 如上海博道基因技术有限公司首次在国内建立以玻璃为载 体 ,以双荧光检测为特点的 BioDoor Chip 技术 ,在国际上首次 将 4000 条新基因共计 8000 个点制作成以玻璃为载体的基因 表达谱芯片 ,并已研制成功多种遗传病产前诊断芯片 ,使用 一块芯片就可检测多种疾病 ,检测效率大大提高 。 11413 成本相对低 尽管基因芯片的制造技术含量很高 , 且一块基因芯片的开发所需人力物力投入也很高 ,但由于各 种工程技术的发展 ,使得基因芯片研究开发的自动化程度不 断提高 ,而一些相关的材料和试剂价格降低 ,再加上其信息 存储量很大 ,可一次进行多种检测 。因此 ,相对多次单一性 检测来说其成本较低 。 11414 应用范围广 由于基因芯片的上述优点 ,基因芯片 在发展了短短十几年就在多个领域得到广泛应用 。如 (1) 在人类基因组测序中 :1996 年 Chee 等[5] 采用固定有 136 528 个寡核苷酸探针的硅片对长度为 1616 kb 的人线粒体基因组 进行测 序 , 测 序 精 确 度 为 99 % ; (2) 找 寻 新 基 因 : 1996 年 Schena 等[6] 用包含 1056 个 cDNA 的芯片与热休克作用和佛
波脂处理的 T 细胞的 cDNA 杂交 ,发现了 4 个新基因 。(3) 在疾病诊断中 : Elek 等[7]利用正常前列腺和前列腺癌中得到 的 cDNA 探针与含有 588 个已知基因的芯片杂交 ,发现至少 19 个基因在正常组织和肿瘤组织中有表达差异 ,从而为该疾 病提供了新的分子生物学诊断依据 。
摘要 :对基因芯片的概念 、原理及其主要类型作了介绍 ,对基 因芯片的主要特点作了概述 ,详述了基因芯片技术在食品营 养成分检测 、食品微生物检测 、转基因食品检测 、病毒检测中 的应用及其在食品工业中的发展前景 。 关键词 :基因芯片 ;食品工业 ;转基因食品 ;微生物
Abstract :Gene chip technique was a kind of new technique in life science area which was developed since 1990′s. In this article ,conception ,principle and maintypes of gene chip were introduced firstly. Secondly ,main characters of gene chip was summarized. Finally ,the application of gene chip in food nu2 trient components ,microorganism and transgenic food detecting as well as virus detecting ,together with the prospect of Gene chip technique in food industry were discussed. Keywords :Gene chip ;Food industry ;Transgenic food ;Microorganism
第 22 卷第 4 期 2005年7月
FOOD &MACHINERY 食品与机械
Vol . 22 ,No . 4 July , 2 0 0 5
基因芯片技术及其在食品工业中的应用
Gene chip technique and its applicatio n in foo d industry
李山云 林 奇 李维强
收稿日期 :2005 - 03 - 22
72
向其他方面扩展 。近几年来 ,基因芯片的应用也开始在食品 工业中崭露头角 。
1 概述
111 概念 基因芯片就是采用微加工和微电子技术将大量的人工
2 在食品工业中的应用
211 在食品营养成分检测中的应用 目前 ,随着社会的发展 ,人们对所消费的食品的要求也
越来越高 ,不但对食品的加工环节的安全性有了更高的要 求 ,而且对食品原料的生产环节也有了更高要求 。传统的检 测方法对食品的营养成分检测是非常繁琐的 ,更不用说对不 同食品的类别和性质进行真伪鉴定了 。基因芯片技术可用 来研究食品的营养成分 ,对食品的类别和性质进行快速准确 的鉴定 。如法国“biomerieux”公司 ,在 2004 年 2 月制作出名为 “食品 专 家 - ID”的 包 括 精 心 选 自 33 种 脊 椎 动 物 的 具 有 88000 个探针的基因芯片 。这种芯片可以用于动物食品的品 质鉴定 ,以确认该食品是否货真价实 ,如在鹅肝酱中是否掺 了廉价的猪肝 ;该芯片还能对食品原料的安全性进行检测 , 如做牛肉干的牛在饲养时是否吃了其他脊椎动物副产品等 。 另外 ,基因芯片还可用于研究营养素的摄入与动物蛋白和基 因表达的关系 ,这将为进一步阐明人类各种营养素缺乏症和 营养过剩引起的疾病 (如 : 夜盲症 、肿瘤 、动脉粥样硬化 、肥 胖 、糖尿病等) 的机理打下基础[8] 。Lyakhovich 等[9] 应用 DNA 芯片技术检测 1 ,252二羟维生素 D3 处理过的乳腺癌细胞的 FGF27 的表达 ,发现无论在 mRNA 水平还是在蛋白水平都有 明显的增加 ,从而首次揭示了维生素 D 可能通过调节 FGF27 的表达而调节细胞的生长分化 。 212 在食品安全性检测中的应用 21211 对致病微生物的检测 食品最常见的污染就是微生 物污染 。因此 ,食品中的病原性微生物的检测是食品卫生检 测中一个重要的方面 。食品被微生物污染不但会造成巨大 的经济损失 ,致病微生物的存在还会严重威胁人类的健康 。 而食品在生产 、加工 、运输 、销售 、消费等各个环节都很容易 被各种病菌污染 。食品微生物的检验是确保食品质量和安 全的重要手段 ,同时也是防止致病菌的污染和各种食源性传 染病的蔓延的重要手段 。传统的生化培养检测方法需要经 过几天的微生物培养和复杂的计数 ,操作费时而繁杂 ,对于 食品这种“等不得”的商品来说 ,这种方法不能及时反映生产 过程或销售过程中的污染情况 ,且灵敏度不高 。其他的分子 生物学方法 (如 PCR 法 ,分支探针 ,肽核酸探针等) 尽管快速 、 灵敏 ,但大多一次只能检测一种微生物 ,且假阳性较多[10] 。 基因芯片不仅快速 、灵敏 ,而且一次可以鉴别多种微生物及 同种微生物的菌株和亚型[11] 。Troesch[12] 等首先将基因芯片 技术用于分枝杆菌的分型及耐药性的鉴定 , 他们通过基因 芯片对 26 种分枝杆菌和所有的耐利福平突变体进行检测 , 均得到了正确的鉴定 。Anthoney[13]等人建立了一个在 4 h 内 便可检测和识别出微生物的方法 ,该法首先通过 PCR 法扩增
设计好的基因片段有序地 、高密度地排列在玻璃片或纤维膜 等载体而得到的一种信息检测芯片 ,其本质名字是脱氧核糖 核酸微阵列 。 112 工作原理
基因芯片的工作原理是利用碱基配对的原理来检测样 品的基因 。将待测样品的 DNA 或 RNA 通过 PCR 或 RT2PCR 扩增 、体外转录等技术掺入标记分子后 ,与位于芯片上的已 知碱基顺序的 DNA 探针杂交 ,再通过扫描系统 (如激光共焦 扫描成像检测系统) 检测探针分子杂交信号强度 ,然后以计 算机技术对信号进行综合分析后 ,即可获得样品中大量基因 序列及表达信息 ,以对之做出定性及定量的研究 。 113 主要类型 11311 原位合成型 指根据预先设计的点阵序列在每个位 点通过照相平板印刷技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成 技术 直 接 聚 合 得 到 DNA 芯 片 。最 先 开 发 这 一 技 术 的 是 Affymetrix 公司 ,Affymetrix 公司采用这种技术生产的基因芯片 能够在一片 1 cm 多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸 探针 。该方法有两类 :光引导原位聚合技术与原位喷印合成 技术 。光引导原位聚合技术的原理是在合成碱基单体的 5’ 羟基末端连上一个光敏保护基 。合成的第一步是首先使支 持物羟基化 ,并用光敏保护基团将其保护起来 ,选取适当的 蔽光膜使需要聚合的部位透光 ,其它部位不透光 ,利用光照 射使羟基端解保护 ,然后将一个 5’端保护的核苷酸单体连接 上去 ,这个过程反复进行直至合成完毕 。因为合成所用的单 体分子一端按传统固相合成方法活化 ,另一端受光敏保护基 的保护 ,所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基 团 。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的
LI Shan2yun LIN Qi LI Wei2qiang
(云南农业大学食品科学与技术学院 ,云南 昆明 650201)
( College of Food Science and Technology , Yunnan Agricultural University , Kunming , Yunnan 650201 , China)
基因芯片技术是 90 年代中期发展起来的一项新生物技 术 ,它是融合了生命科学 、化学 、微电子技术 、计算机科学 、统 计学和生命信息学等多种学科的最新 技 术 。1991 年 美 国 Affymetrix 公司成功地研制出第一块寡核苷酸基因芯片后 [1] , 又在 1996 年制作出世界上首批可以在药物筛选和实验室试 验应用的 DNA 芯片 ,并制作出芯片系统 ,使得基因芯片广阔 的应用前景开始被人们所认识[2] 。随后美国的 Nanogen 公 司 、Syntexi 公 司 、Incyte 公 司 及 日 本 、欧 洲 各 国 都 积 极 开 展 DNA 芯片研究工作 ;摩托罗拉 、惠普 、IBM 等跨国公司也相继 投以巨资开展芯片研究 。我国从 1998 基因芯片研究被中科 院列为“九五”特别支持项目以来 ,国内许多高校和科研单位 也积极开展了此项研究 ,目前在 DNA 芯片设计 、基片修饰 、 探针固定 、样品标记 、杂交和检测等方面的技术都有较大的 进展 ,在微阵列芯片和基于 MEBS 的芯片方面有大的突破 , 已研制出乙肝病毒多态性检测芯片 、多种恶性肿瘤病毒基因 芯片等有一定实用意义的基因芯片 。目前 ,在世界各国的积 极推动下 ,在基因芯片的应用领域也开始从最初的医学领域
专论与综述
2来自百度文库05 年第 4 期
阵列 ,在合成循环中探针数目呈指数增长 。芯片原位喷印合 成技术的原理与喷墨打印类似 ,所用技术也是常规的固相合 成方法 ,不过芯片喷印头和墨盒有多个 ,墨盒中装的不是碳 粉而是四种碱基合成的试剂 。喷印头可在整个芯片上移动 并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印 在芯片上特定位置[3] 。 11312 “点膜”型 先合成好探针 、cDNA 或基因组 DNA ,然 后将其用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度 涂布于硝酸纤维膜 、尼龙膜或玻片上 。支持物应事先进行特 定处理 ,例如包被带正电荷的氨基硅烷 ,以便能够牢固地结 合寡核苷酸分子 。该方法比原位合成法简单 ,芯片上探针不 受探针分子大小种类的限制 ,能够灵活机动地根据使用者的 要求制作出符合目的的芯片 ,因此是目前大多数中小型公司 所采用的方法[3 ,4] 。 11313 集成电路型 将杂交技术与微电子技术结合于一体 有目的地通过电子装置检测或控制 DNA 等生物大分子的作 用过程而合成的芯片 。Nanogen 公司开发了多位点电控阵列 并含独立可寻址检测区域的微电子基因芯片 ,其基质全部是 硅 、锗等基础的半导体材料 ,在其上构建 25～400 个微铂电极 位点 ,各个位点可由计算机独立或组合控制 。 114 主要特点 11411 自动化程度高 现在 ,随着基因工程技术的发展和各 学科的交叉渗透 ,基因芯片技术中从基因探针的构建到目的 基因的检出都在很大程度上实现了自动化 。如应用 PCR 仪 快速获得探针 ;用自动杂交系统将放入其中的基因芯片与荧 光标记产物按碱基配对的原则进行固相杂交 ;用激光共聚焦 扫描仪对芯片上的荧光信号进行扫描 ;最后用计算机系统对 每一探针上的荧光信号作比较和检测 ,并显示出有关的信息 等[5] 。 11412 序列数量大 ,检测效率高 由于芯片制造技术的发 展 ,在同一块芯片上已经能放置几千到几十万个基因探针 , 如上海博道基因技术有限公司首次在国内建立以玻璃为载 体 ,以双荧光检测为特点的 BioDoor Chip 技术 ,在国际上首次 将 4000 条新基因共计 8000 个点制作成以玻璃为载体的基因 表达谱芯片 ,并已研制成功多种遗传病产前诊断芯片 ,使用 一块芯片就可检测多种疾病 ,检测效率大大提高 。 11413 成本相对低 尽管基因芯片的制造技术含量很高 , 且一块基因芯片的开发所需人力物力投入也很高 ,但由于各 种工程技术的发展 ,使得基因芯片研究开发的自动化程度不 断提高 ,而一些相关的材料和试剂价格降低 ,再加上其信息 存储量很大 ,可一次进行多种检测 。因此 ,相对多次单一性 检测来说其成本较低 。 11414 应用范围广 由于基因芯片的上述优点 ,基因芯片 在发展了短短十几年就在多个领域得到广泛应用 。如 (1) 在人类基因组测序中 :1996 年 Chee 等[5] 采用固定有 136 528 个寡核苷酸探针的硅片对长度为 1616 kb 的人线粒体基因组 进行测 序 , 测 序 精 确 度 为 99 % ; (2) 找 寻 新 基 因 : 1996 年 Schena 等[6] 用包含 1056 个 cDNA 的芯片与热休克作用和佛
波脂处理的 T 细胞的 cDNA 杂交 ,发现了 4 个新基因 。(3) 在疾病诊断中 : Elek 等[7]利用正常前列腺和前列腺癌中得到 的 cDNA 探针与含有 588 个已知基因的芯片杂交 ,发现至少 19 个基因在正常组织和肿瘤组织中有表达差异 ,从而为该疾 病提供了新的分子生物学诊断依据 。
摘要 :对基因芯片的概念 、原理及其主要类型作了介绍 ,对基 因芯片的主要特点作了概述 ,详述了基因芯片技术在食品营 养成分检测 、食品微生物检测 、转基因食品检测 、病毒检测中 的应用及其在食品工业中的发展前景 。 关键词 :基因芯片 ;食品工业 ;转基因食品 ;微生物
Abstract :Gene chip technique was a kind of new technique in life science area which was developed since 1990′s. In this article ,conception ,principle and maintypes of gene chip were introduced firstly. Secondly ,main characters of gene chip was summarized. Finally ,the application of gene chip in food nu2 trient components ,microorganism and transgenic food detecting as well as virus detecting ,together with the prospect of Gene chip technique in food industry were discussed. Keywords :Gene chip ;Food industry ;Transgenic food ;Microorganism
第 22 卷第 4 期 2005年7月
FOOD &MACHINERY 食品与机械
Vol . 22 ,No . 4 July , 2 0 0 5
基因芯片技术及其在食品工业中的应用
Gene chip technique and its applicatio n in foo d industry
李山云 林 奇 李维强