新版GMP与快速微生物检测鉴定技术

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高鹃 新版GMP 与快速微生物检测鉴定技术新版GMP 与

快速微生物检测鉴定技术

3.快速鉴定技术

4.法规与药典要求

第一部分引言无菌药品生产要求的大幅度提高

新版GMP 无菌药品附录

以上各级别空气悬浮粒子的标准规定如下表：

洁净度级别

悬浮粒子最大允许数静态

≥0.5μm

≥5.0μm A 级(1)

352020B 级352029C 级3520002900D 级

3520000

29000

洁净级别

浮游菌cfu/m 3

沉降菌（φ90mm ）cfu /4小时

表面微生物

接触cfu /碟（φ55m m ）

5指手套cfu /手套A 级<1<1<1<1B 级10555C 级1005025

－

D 级

200

100

50－

洁净区微生物监测的动态标准

工业工程技术要求隔离装置隔离器Rabs RTP 公用工程

水系统空调系统氮气压缩

空气真空传送系统动态环境监测系统粒子监测沉降菌浮游菌

动态环境监测带来的新课题 １、大量数据的管理和分析 ２、面对细菌培养阳性结果发生争执 是生产管理方面的问题？ 是QC 的OOS ？３、细菌培养阳性结果的后续处理明确what where who how

革兰氏染色无法判定

无菌药品生产要求的大幅度提高

未污染

？

无菌药品生产要求的大幅度提高

无菌药品附录：

产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖

于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）。

微生物检测技术的飞跃发展

快速检测技术（不需进行培养PAT ）快速鉴定技术（属种株）为无菌药品生产和质量管理提供了先进技术手段及时发现污染，追溯污染源 案例：

爱吃桔子的员工

一直难以去除的革兰氏阳性短棒状菌燃烧麦秸杆与无菌药品生产车间

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第二部分

快速检测技术

电阻抗检测•通过监测电导率或电极表面电荷数量，判定微生

物生长情况培养过程中的快速检测技术培养过程中的快速检测技术

二氧化碳监测

•测定密闭容器中微生物液体培养时产生的二氧化碳含量，判定微生物生长情况

生物发光检测技

•测定发光量

–判断是否存在微生物–找出发光量与实际细胞数的相关性培养过程中的快速检测技术

不需培养的快速检测技术

通过对细胞染色和/或标记进行微生物检测

和定量，不需细胞培养

流式细胞仪

•被标记的细胞逐一通过流体腔时，细胞经激光束照射，发出荧光和光散射信号，依此计算细胞数•利用荧光染料和特异微生物探针，如抗体、rRNA 、肽核酸（PNA ），实现计数和目标有机物的同时检测不需培养的快速检测技术 流式细胞仪•系统的标记和检测过程能在15分钟内完成•样品量很少，不超过1 mL 分钟内完成活细胞的标在数小时内利用抗体和核酸探针完成特定不需培养的快速检测技术

环境动态监测•当空气样品中的粒子通过系统时，粒子计数器将检测并定量记录粒径范围0.5-20µm 的粒子数•紫外激光器横切粒子束，含NADH 和核黄素的微生物会产生荧光，实现微生物的动态监测•能去除太小/太大粒子发荧光的假阳性结果，如烟雾/花粉快速鉴定技术

快速鉴定技术 梅里埃API 系统 API 鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有

1000种生化反应，目前已可鉴定超过750种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，人工或通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。

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•BioMérieux VITEK2 （Pincus, 2005一个光学系统的不同波长可见光监测每个井的变化，以检测微生物生长的浊度或代谢产物的颜色•结果用“+/-”响应表示，与内部数据库或相关图书馆提供的特殊平台和微生物鉴定数据库比对

快速鉴定技术快速鉴定技术 Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA ）•利用免疫反应，检测特定细胞成分，如抗体或抗原

通过分析脂肪酸含量进行微生物鉴别

微生物培养提取的脂肪酸通过气相色谱进行分离，其色谱峰可与内部数据库比对

快速鉴定技术

质谱

Matrix-assisted Laser Desorption

Ionization, Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS)

快速鉴定技术

Waters MicrobeLynx

TM System •将原代培养细胞与具有紫外吸收的基质在不锈钢

靶标盘中共晶，干燥后，将该盘放入质谱仪的氮激光器下•基质吸收激光器能量，高分子从微生物表面解吸下来，离子化，进行质谱分析，产生的质谱图与

内部数据库比对，进行微生物鉴别

快速鉴定技术

芯片+质谱

Surface Enhanced Laser Desorption Ionization, Time of Flight Mass Spectrometry (SELDI-TOF-MS)

快速鉴定技术核酸技术RMM 领域普遍采用基因扩增技术聚合酶链反应（PCR ）

转录介导扩增技术（TMA /或菌株

快速鉴定技术核酸技术 Transcription-Mediated Amplification

（TMA ）

•采用单链RNA ，通过T7 RNA 聚合酶，每个周

期可产生数千个RNA 扩增子，即在15-30分钟

内可完成10亿次复制

•一个PCR 周期只能进行

2次DNA 复制序列在属和种水平上高度保守序列的间隔区和侧翼区）的非保守片段可用于辨别特定种的菌株快速鉴定技术核酸技术

Millipore 和Gen-Probe 正在合作研发的MilliPROBE 系统，用molecular torches 作为

扩增检测探针，通过磁珠捕获目标物

•bioMérieux 正在研发的Nucleic Acid Sequence Based Amplification （NASBA ）技术，用molecular beacons 作为目标物的检测器

法规与药典要求

法规和药典

FDA 于2004年9月发布无菌工艺指南鼓励采用新的微生物检测方法和系统