胶质芽孢杆菌HM8841紫外线诱变育种研究

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J OU RNAL OF MICROB IOLO GY Jan. 2006 Vol. 26 No. 1 微生物学杂志 2006 年 1 月第 26 卷第 1 期
胶质芽孢杆菌 HM8841 紫外线诱变育种研究
肖湘政1 , 张志红2 , 秦艳梅1
(1. 河北省微生物研究所 ,河北 保定 071051 ;2. 华南农业大学 资源与环境学院 ,广东 广州 510642)
近年来 , 随着无公害食品的发展和人们环保 意识的增强 , 生物肥料的使用越来越受到社会的 普遍关注 。据不完全统计 , 目前全国生物肥料生 产单位已超过 500 家 ,年产量达 400 万 t 以上 ,为 提高我国农产品质量 、 弥补化学肥料不足以及改 良土壤做出了重要贡献 。生物肥料的品种主要包 括固氮菌类肥料 、 根瘤菌肥料 、 解磷微生物肥料 、 硅酸盐细菌肥料 、 光合细菌肥料 、 复合微生物肥 料、 抗生菌类肥料等 , 其中硅酸盐细菌肥料 ( 生物 钾肥) 是推广和应用面积较大的生物肥料品种之 一 [ 1 ] ,它是利用硅酸盐细菌 ,主要是胶质芽孢杆菌 ( B acill us m ucil agi nos us ) , 经特定培养基 , 通过先 进的工业发酵工艺而研制生产的 。许多研究结果 证明硅酸盐细菌能够分解磷灰石和含钾矿物 , 可 以使难溶态的磷 、 钾转化为有效态磷 、 钾[ 2～4 ] 。同 时在纯培养中还发现硅酸盐细菌可以产生多种氨 基酸 、 肽类化合物 , 以及生长素 、 赤霉素等生理活 性物质 ,对棉花枯萎病 、 烟草灰霉病 、 小麦赤霉病 等植物病原菌有明显抑制作用 , 在一定程度上可 以减轻某些植物病害特别是一些土传病害的发
UV Mutational Breeding of B acill us mucil agi nos us HM8841
XIAO Xiang2zheng1 , ZHAN G Zhi2hong2 , Q IN Yan2mei1
( 1 . I nst . of Microbiol . of Hebei Prov . B aodi ng 071051 ; 2 . Faculty of Res. & Envi ron. S Chi na A gric. U niv . Guangz hou 510642)
36 h 时间点各菌株的菌体数量和芽孢形成情况 ;
省微生物研究所提供 。 1. 1. 2 培养基 ① 培养基 A : 蔗糖 1 g ,MgSO4 ・ 7 H2 O 0. 2 g , K2 HPO4 0. 5 g , CaSO4 0. 1 g , NaCl
0. 2 g ,酵母膏 0. 1 g ,琼脂 18 g ,水 1 L ,p H 7. 0 ～7. 2 ; ②培养基 B : K2 HPO4 1. 0 g , ( N H4 ) 2 SO4 0. 2 g , MgSO4 ・ 7 H2 O 0. 2 g , CaCO3 1. 0 g , 琼脂 18 g ,水 1 L , p H 7. 0 ～ 7. 2 ; ③培养基 C : 蔗糖 1. 0 g ,Na2 HPO4 2. 0 g ,CaCO3 0. 1 g , FeCl3 0. 005 g ,玻璃粉 ( 或钾长石 ) 1. 0 g , 琼脂 18 g , 水 1 L , p H 7. 0 ～ 7. 2 ; ④培养基 D : 蔗糖 2 g , MgSO4 ・ 7 H2 O 2 g , FeCl3 0. 1 g , CaCO3 2 g , 水 1 L , p H 7. 5 ; ⑤ 培养基 E : 蔗糖 5 g ,MgSO4 ・ 7 H2 O 0. 3 g ,NaCl 0. 3 g ,CaCO3 1. 5 g ,酵母膏 0. 6 g , FeCl3 0. 1g ,淀粉 2 g , K2 HPO4 0. 5 g ,水 1 L ,p H 7. 5 。 1. 2 方法 1. 2. 1 胶质芽孢杆菌 HM8841 菌悬液制备 取
Abstract B acill us m ucilagi nosus strain HM8841 was used as starting strain. Through UV induction and t he test2 ing of mutant strain , t hree superior strains seed suitable for productive fermentation were bred. As compared wit h t he starting strain , t he mutants had t he advantages of shortening t he fermentation period , improving t he fermenta2 tion level , and increasing its resistance etc. Keywords B acill us m ucilagi nosus HM8841 ; UV radiation mutagenesis ; mutant
作者简介 : 肖湘政 男 ,硕士研究生 。主要从事生物肥料等农用微生物制剂的研究工作 。
1 期 肖湘政等 : 胶质芽孢杆菌 HM8841 紫外线诱变育种研究
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应用效果不稳定等 。目前虽然国内应用胶质芽孢 杆菌作为生产菌株和研究对象的单位很多 , 也有 关于菌株改良方面的报道 , 但多数是在实验室条 件下的研究 ,而对相关出发菌株的生产和应用情 况报道较少 [ 9 ,10 ] , 在工业发酵生产水平上综合考 虑芽孢数量 、 质量 、 解钾功能特性的报道更少 , 并 且胶质芽孢杆菌 HM8841 应用时间长 , 相关的基 础研究和应用效果比较多 。本文通过紫外线诱变 处理方法 ,利用不同的选择性培养基 ,欲筛选出较 出发菌株性能更好 、 发酵水平更高的生产菌株 。
பைடு நூலகம்
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微 生 物 学 杂 志 26 卷 表2 不同突变株发酵性能测定
Table 2 The test of fermentation performance of different mutant strains
果较为理想 ,在 A 、 B、 C 三种培养基上的致死率分 别为 99. 77 % 、 99. 49 %和 99. 99 % 。如时间再延 长 ,菌体则全部死亡 , 而诱变时间太短 , 诱变效果 不理想 ,达不到选种要求 。因此从存活菌株中挑 选单菌落转接到试管培养基上进行下一步试验 。
30 ℃ 恒温培养 48 h 。 1. 2. 3 初筛 从 3 种培养基上挑取诱变时间为 25 min 、 边缘整齐具有典型特征的大菌落 ,共挑选 8 个单菌落 , 编号为 M1 、 M2 、 M3 、 M4 、 M5 、 M6 、 M7 、 M8 ,分别接入试管斜面 , 待其生长完全后转
1 材料与方法
培养至对数生长期的胶质芽孢杆菌 HM8841 菌 体 ,血球板计数 ,用无菌水调整菌体浓度为 107 ～ 108 cf u/ mL ,备用 。 1. 2. 2 紫外线 ( UV ) 诱变处理 打开紫外灯 ( 功 率 15 W , 波长为 2 540 ! ) 预热 20 min , 取 7 mL 菌悬液放在无菌的培养皿 ( 直径为 5 cm) 中 ,将培 养皿置于距紫外线光源 30 cm ( 垂直距离) 的磁力 搅拌器上 ,照射 1 min 后打开培养皿 ,同时打开磁 力搅拌器进行搅拌 , 即时计算时间 。照射时间分 别设置为 10 、 15 、 20 、 25 、 30 min 。照射完成后 , 分 别在红光灯下稀释菌悬液 ,根据照射时间的不同 , 稀释不同倍数 , 并设置重复 。10 min 和 15 min
1. 1 材料 1. 1. 1 供试菌种 胶质芽孢杆菌 HM8841 ,河北
入三角瓶中培养 , 培养基为 D ,30 ℃、 210 r/ min 条件下摇床培养 , 分别在 12 、 24 、 36 、 40 h 取样镜 检 ,观察营养体生长和芽孢形成情况 , 当有 95 % 的菌体形成芽孢 ,停止培养并进行血球板计数 。 1. 2. 4 复筛 ① 对含钾矿物溶解能力的测定 : 经 过紫外线诱变 ,得到多个突变株 ,根据筛选要求选 择性地挑取具有优良发酵水平的菌落接入斜面并 同时活化 ,摇瓶培养 40 h ( 培养基为 C , 摇瓶中含 1 %的钾长石粉 ) , 取发酵液离心 ,8 000 r/ min 离 心 10 min ,然后取上清液 , 用火焰光度法测定速 效钾含量 ,比较不同突变株的解钾能力 ,筛选高效 解钾菌株 ; ② 芽孢存活率测定 : 各取 200 mL 发酵 液 ,在 60 ℃ 恒温水浴条件下保持 20 min ,确保杀 死营养体细胞 , 制成 100 %的芽孢悬液 。芽孢悬 液在沸腾的水中处理 10 min ,将高温处理前后的 芽孢悬液稀释涂布在适宜培养基上 ,30 ℃ 恒温培 养 2～3 d ,计算菌落数 ,测定芽孢存活率 ; 观察菌 落和菌体形态 ,并同出发菌株比较 ; ③ 生产模拟试 验 : 选择出发菌株与 3 株突变株在生产用培养基 E 上进行发酵周期对比试验 , 比较 20 、 24 、 28 、 32 、
收稿日期 :2005 - 06 - 13
生 。近年来随着 P GPR 观点的引入 , 对硅酸盐细 菌肥料的应用效果和作用机理的研究将会更加深 入 [ 5～7 ] 。 有效活菌含量是评价生物肥料产品质量的主 要指标 ,菌数的高低直接影响到产品效果的发挥 , 同时生产菌种质量 ,包括代谢产物存活情况 ,也是 影响生物肥料产品肥效的重要方面[ 1 ,8 ] 。因此硅 酸盐细菌肥料中胶质芽孢杆菌的芽孢数量和质量 以及菌种的功能特性对产品具有非常重要的意 义 。长期研究和生产应用证明 , 菌种质量的高低 直接影响到发酵水平和生产效率 ,菌体生长快 、 芽 孢形成早且稳定性好的菌种能大大缩短发酵周 期 ,降低生产成本 。胶质芽孢杆菌 HM8841 是河 北省微生物研究所生产硅酸盐细菌肥料所用菌 种 ,该菌株自玉米根际土壤分离 ,从 20 世纪 80 年 代中后期开发生产的硅酸盐菌剂 , 在缺钾土壤和 喜钾作物上取得了显著的应用效果 , 得到了社会 的认可 。但近年来在生产和应用中发现 , 该菌种 存在逐步退化现象 : 发酵周期明显延长 ,对环境适 应性减弱 ; 芽孢含量低 ,存活性差 ,容易死亡 ; 田间