紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案

紫外线诱变育种高产纤维素菌

实验方案

诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.

实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。

实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。

材料和器皿：

（1）菌种：木霉单孢子

（2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。

（3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。

（4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。

实验步骤：

紫外线诱变育种

单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。

稀释对照菌液（未照射菌液）

将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。

UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内，

同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器

．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。以未诱变菌液培养后的菌落数为基准计算

不同诱变时间的致死率，选择致死率较高的诱变菌液继续检测其产纤维素酶的能力。致死率(％)=（对照皿的菌落总数-诱变处理后的菌落总数）／对照皿的菌落总数×100

筛选培养基的选择

．．．．．．．．:．挑取孢子接种到PDA 斜面培养基上活化，28℃

培养72h。通过点样法分别接种于平板筛选培养基1和培养基2 上，28℃培养72h。观察不同培养基上纤维素酶生产菌的透明圈大小，以确定合适的选择培养基，为进一步筛选做准备.

最佳筛选培养基的确定（对比）

经观察，如果发现平板筛选培养基1 中透明圈较小，平板筛选培养基2（改良培养基）中菌落周围透明圈较明显，因此选择平

板筛选培养基2 作为平板筛选培养基。

复筛：<纤维素酶生产菌菌种复筛> 将纤维素酶生产菌接种于固体曲培养基进行固态发酵，置30℃恒温箱中培养，在12h 以前堆积培养，12h 后摊平，待表面长满菌丝，结成块状时“扣瓶”，继续培养,待长满菌丝即可。干曲的制备及含水率的测定参考[7]。测定纤维素酶活力（内切纤维素酶活，滤纸酶活力），筛选高产纤维素酶生产菌.

稳定性试验：对紫外诱变得到的纤维素酶活力相对较高的突变株进行传代遗传稳定性实验, 经一定次数的传代后测定纤维素酶活力.

将所得到的高产纤维素酶菌用于实际生产过程中，与其它产纤维素霉菌对比产酶效率。

注意事项

（1）：用作诱变处理的菌液应尽量使其分散成单细胞，使每个细胞能均匀地接触诱变剂，以避免长出不纯的单菌落。

（2）：照射后的操作都必须在暗室内红光下进行。