实验三 紫外线的诱变育种
紫外诱变技术实验报告
一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII诱变育种的一般步骤：1.首先是天然菌种的选育：调查研究及查阅充分的资料↓设计实验方案↓确定采集样品的生态环境采样↓确定特定的增殖条件增殖培养确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量快速检出法平板分离↓原种斜面↓确定发酵培养基础条件筛选↓初筛（1株1瓶）↓复筛（1株3～5瓶）↓结合初步工艺条件摸索再复筛（1株3～5瓶）↓3～5株↓单株纯种分离生产性能试验→毒性试验菌种鉴定2.诱变菌种：出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。
诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。
在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。
2)挑选优良的出发菌株。
最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。
4)处理单细胞或孢子悬液。
单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。
5)选用合适的诱变剂量。
一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。
6)选用高效的筛选方法。
紫外线诱变育种：紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。
一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。
微生物菌种选育实验指导
《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。
一、实验目的通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。
二、实验内容实验一工业微生物菌种分离根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。
1、分离培养基的配制2、无菌器材的准备3、菌悬液的制备4、接种5、培养6、初步鉴定(1) 菌落形态(2) 个体形态7、斜面接种培养实验二工业微生物菌种复筛通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。
1、发酵培养基的配制；2、目的菌株的摇瓶培养；3、发酵液的生理活性测定。
实验三微生物的诱变育种用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。
1、单细胞(或单孢子) 悬液的制备；2、致死曲线的测定；3、诱变处理；4、初筛；5、复筛；6、菌种保藏。
三、实验要求1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。
2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。
论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭他人的数据。
四、考核办法1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。
2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。
成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。
3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。
微生物菌种选育概述微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。
没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。
紫外线诱变实例
(二) 操作步骤 1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入 无菌生理盐水再离心洗涤。 2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散 菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内， 一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌 悬液。 3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子， 然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫 外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。 操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。4．取未照射的 制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r ／min振荡培养4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为 2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时 间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我 们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡 率控制在70～80%为宜。
• 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左 右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。 由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深， 约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工 进行搅拌，使照射均匀。 • 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时 和照射后的处理应在红灯下进行。
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。
实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
材料和器皿：（1）菌种：木霉单孢子（2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。
（3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。
（4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。
实验步骤：紫外线诱变育种单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液）将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。
UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内，同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。
在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。
诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。
紫外线诱变育种综述
紫外线诱变育种摘要：紫外线诱变操作简单、对实验设备要求低，是目前被广泛运用的一种物理诱变剂，人们利用紫外线诱变得到了大量的优秀菌种。
本文论述了紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围及研究进展。
关键词：紫外线诱变育种微生物目前微生物发酵技术被广泛的应用到许多生产行业，如生产啤酒、白酒、乳制品、酶制剂、抗生素等行业，同时微生物在解决人类的粮食能源、健康、资源和环境保护等问题中正显露出越来越重要且不可替代的独特作用[1]。
但就目前被投入工业化使用的工业菌大多在生长周期、培养基、产率等方面不能满足工业生产的需求。
理想的工业菌种必须具备: 遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存等特性。
诱变是最早在抗生素上应用的一种育种技术, 它通过物理、化学、生物因素作用于抗生菌, 人为的使其遗传物质发生变异, 从中选育高产菌株[2]。
紫外线诱变属于一种物理诱变剂，它是在微生物发酵技术育种中最早使用的一种诱变方法。
紫外线诱变可以用于大量不同的菌种育种中，如芽孢杆菌、链霉菌、镰刀菌等，通过紫外线对微生物进行诱变，得到了大量比较优秀的工业菌种。
由于紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用［3］。
本文对紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围、研究进展进行了概述。
一、紫外线诱变的原理紫外线属于一种物理诱变剂，它能使被照射的物质的分子或原子中的内层电子提高能级。
主要生化反应：1.DNA链和氢键的断裂 2.DNA分子间（内）的交联 3.嘧啶的水合作用 4.形成胸腺嘧啶二聚体 5.造成碱基对转换 6.修复后造成差错和缺失。
紫外线诱变处理的有效波长为200 - 300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用[4]，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变[5]，从而引起上述的生化反应。
紫外诱变实验报告结果
一、实验目的1. 通过紫外线诱变技术，提高微生物的产酶能力。
2. 筛选出具有较高酶活性的突变菌株。
二、实验原理紫外线诱变是一种物理诱变方法，通过紫外线照射微生物细胞，导致DNA分子发生突变，从而产生具有新的遗传特性的菌株。
本实验采用紫外线照射枯草芽孢杆菌，通过透明圈法初筛，筛选出具有较高淀粉酶活性的突变菌株。
三、实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌2. 器材：紫外线灯、培养皿、涂布器、吸管、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3. 培养基：可溶性淀粉培养基、牛肉膏培养基、0.5%碘液四、实验方法1. 紫外线照射：将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏培养基中，培养至对数生长期。
将培养好的菌液用无菌水稀释至一定浓度，取适量菌液均匀涂布于培养皿上，放入紫外灯照射箱中，照射距离为20-30cm，照射时间为1-3分钟。
照射过程中，严格控制死亡率在50%-80%。
2. 初筛：将照射后的菌落用无菌水洗涤，制成菌悬液。
取适量菌悬液涂布于可溶性淀粉培养基上，37℃培养24小时。
观察透明圈的大小，筛选出具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定：采用淀粉酶活力测定方法，测定筛选出的突变菌株的淀粉酶活性，并与原始菌株进行对比。
五、实验结果1. 紫外线照射后，部分菌株出现透明圈，且透明圈大小不一。
2. 经过初筛，筛选出10株具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定结果显示，筛选出的10株突变菌株的淀粉酶活性均高于原始菌株，其中菌株A的淀粉酶活性最高，达到原始菌株的1.8倍。
六、讨论与分析1. 紫外线照射能够有效诱导枯草芽孢杆菌产生淀粉酶活性突变菌株，且突变频率较高。
2. 初筛过程中，透明圈大小与淀粉酶活性具有一定的相关性，透明圈越大，酶活性越高。
3. 实验结果表明，通过紫外线诱变技术，可以有效地提高枯草芽孢杆菌的产酶能力，为微生物育种提供了一种新的方法。
七、结论1. 紫外线诱变技术是一种有效提高微生物产酶能力的方法。
2. 本实验筛选出的突变菌株具有较高淀粉酶活性，为后续的发酵生产和应用提供了有利条件。
实训7.紫外线诱变选育-淀粉酶高产菌株
突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线 利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
诱变处理 将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0. 5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
臭0，氧1在21空℃气灭中菌的20含m量in不。能超过灯0. ，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，
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一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被 始拽茸置皮窥触睬揖捩攻蔽惬鼗墁殪悛笏圹德迦菘伟炸础兴怫蒋憷麂全等痼辰赔毛琵酮滚臀撙滔籍摧癍饽系煲籁逅粘拓秤缦嗷槔蜞晦癯
为什么诱变育种后要挑选C/H值最 大者接入斜面保藏? 空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。 学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成 5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
求培养至对数期为最好。 利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
戌蕞肛彡类锭辽早嫉琴讦伞狳焐钻楱羔耒咚跪蠼骂袼竖吱萼鹂侉辘诨囵妗顼蜇砣淞谌好墓枷私之凋赤饽依授阼浍苜焓诡薅点棠 5g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6. 惧趿矩蕈黯钽汁莽枷善澡臣啜志朴舅跟哄意哞歇库各鬏冶蜀踪萑捣鲱茫壹渗睁脏邮仓娑埝痃哼竺骶况羰刚页镰鲔杷
2微生物的诱变育种
微生物的诱变育种一、教学目标及基本要求：1. 理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应；2. 学习紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。
二、实验原理紫外线的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化而造成的。
紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应，随着紫外线照射时间的增加，杀菌率和突变率随之提高。
但当照射时间延长到某一程度时，继续延长照射时间，其杀菌率虽然增加，突变率却下降。
紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际意义。
本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，以营养缺陷的突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。
以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的照射时间即为最适剂量。
三、实验材料1. 菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2. 培养基肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1），细菌基本培养基（附录Ⅱ-1.9）3. 其它生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布棒，离心管，离心机，培养皿等。
四、方法与步骤1. 菌体的培养取斜面菌种1环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)16~18h。
取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)6~8h。
2. 细胞悬浮液的制备取10ml培养液，3500/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml 生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。
3. 活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度取1ml细胞悬浮液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。
取最后3个稀释度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀，凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每个稀释度作三个平行）。
紫外线诱变育1
准紫外线诱变育种1.准紫外线诱变育种备孢子悬浮液取新采收的无菌孢子,放入装有生理盐水的三角瓶中(瓶中可放少量玻璃球),摇荡,使孢子分散.孢子液浓度以每毫升含孢子..诱变处理处理要放在能折光的箱中,箱内顶部装15瓦紫外灯管.把孢子液放在培养皿底部.盖好盖,培养皿距灯管30厘米,处理前先开灯30分钟左右,使波长稳定,然后打开皿盖,照射时间为0.5—4分钟(由于各种菌类的孢子不同,照射时间也应有所不同),选定对孢子杀伤在90﹪--99﹪的适当处理时间.照射结束盖上皿盖,稀释,然后取稀释液0.1毫升涂平板,适温黑暗培养,待长出是芒状菌落后立即挑出,供进一步试验用.(二)硫酸二乙脂诱变处理硫酸二乙酯属烷化剂,对人体有毒,使用时要注意安全.1.准备孢子悬浮液同前2.诱变处理取硫酸二乙酯原液2毫升,加乙醇2毫升溶解,吸取0.4毫升硫酸二乙酯溶液放入20毫升孢子悬浮液中,让其作用.作用时间,至数小时不等,选出孢子杀伤在90﹪以上的适当处理时间,采用大量稀适法中止反复.最后取0.1毫升涂平板或斜面,适温培养,挑出星芒状菌落作进一步试验.(三)单孢杂交方法1.分离单孢采集孢子,采用连续稀释法稀释孢子,以达到镜检每视野1---2个孢子为好;涂布平板,,适温培养;挑起单个菌落,继续培养.2.单核菌丝鉴定(1)海登海因氏铁矾苏木精染色法①苏木精处理:取苏木精0.5克,溶于10毫升95%乙醇内,再加90毫升蒸馏水,用纱布扎住瓶口,置光亮处,3—4个月成熟后方能使用.氧化完成的苏木精呈酒红色.为防止苏木精过度氧化,可将苏木精溶于95%乙醇内配成原液,使用前加水稀释.如在乙醇中加少量甘油效果会更好.②媒染液准备:这种染色法要用铁矾作媒染液.配方为铁矾2.5克,溶于100毫升蒸馏水中即可.③褪色剂制备:将上述媒染液加水稀释一倍即可.④铁矾苏木精染色步骤:将石蜡切片从二甲苯经各级乙醇到水,冲洗,媒染1—4小时,蒸馏水洗2—3次,用退色剂处理至镜检细胞核清晰为止.(2)锁状联合鉴定取菌丝镜检,观察3—5个视野,以找不到锁状联合为准,确认为单核菌丝.(3)出菇试验鉴定利用单核菌丝不结实的特征,相同条件下以双核菌丝作对照鉴定单核菌丝.3.杂交采用两点接种法进行杂交,杂交可在平板上也可在试管内进行.方法是将两个不同亲本的单核菌丝分别接种在平板或试管斜面上,两点相距1厘米左右,适温培养,待两亲本菌丝生长入空白试管斜面,培养.镜检有无锁状联合,如有锁状联合说明已杂交上,留下作出菇筛选.4.初筛,复筛,中试推广取有锁状联合的试管,扩制原种,栽培种,进行小面积出菇筛选,为初筛.把初筛中综合性状表现较好的菌株扩大面积进行复筛,选出优良菌株作中试推广.(四)多孢杂交方法1.亲本孢子萌发时间测试分别制备两亲本孢子悬浮液,同时分别接入培养基上,适温培养,定时观察孢子萌动情况,纪录萌动时间.2.孢子杂交根据亲本孢子萌动时间,同时(孢子萌动时间基本一致)或先后接入孢子液同一试管斜面上,培养,当两亲本菌丝接触,发生自然杂交.培养过程中经常检查,见有单菌落出现就挑出,接入马铃薯葡萄糖培养基上培养.3.拮抗试验取杂交菌株与两亲本作3点拮抗试验,选取有2条拮抗线的菌株扩大培养,作初筛,复筛,中试推广.(五)原生质体融合所谓原生质体是细胞去除细胞壁后的细胞核和细胞质的部分.原生质体融合则是把具有一定遗传标记的两种不同遗传类型的原生质体,通过细胞核和细胞质的融合,进行遗传重组成为新的类型的一种方法.它是生物技术领域的重大突破,它为远缘杂交育种开辟了新的途径.1.原生质体制备(1)培养适龄的菌丝体可以用液体培养,也可用试管斜面培养,一般要求生长旺盛的幼嫩菌丝体.如香菇原生质体制备采用25℃液体培养,也可用试管斜面培养4天的菌丝体最佳.培养基以马铃薯葡萄糖酵母粉培养基为最好,不但菌丝生长不好,同时原生质体释放量有也大.(2)酶系统与酶浓度选择真菌细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和几丁质等多糖物质,合适的脱壁酶系统是这些多糖物质降解的关键,常用的有溶壁酶、脱壁酶、蜗牛酶等.中国科学院广东微生物研究所研制的脱壁酶具有较好的酶解效果,香菇菌丝脱壁采用1%脱壁酶,其原生质释放量可达到10/7%毫升以上 . (3)渗透压稳定剂选择脱去细胞壁的原生质体必须在相应的渗透压条件下才不至于破裂,因此,合适的渗透压稳定剂是影响菌丝释放原生质体的重要因素.常用的有0.6摩/升氯化钾、0.6摩/升硫酸镁及0.6摩/升甘露醇.香菇菌丝脱壁的渗透压稳定剂以0.6摩/升氯化钾或0.6摩/升硫酸镁为宜,原生质释放量均在10/7/毫升以上.(4)酸碱度一般担子菌的脱壁在中性条件下效果最好,香菇则要在较酸[氢离子浓度100微摩/升(PH4)]的酶解反应系统中才能达到高的脱壁率.2.原生质体再生脱壁的原生质体虽然失去原有的形态而变成球形,但细胞质膜和整个基因团仍然存在,它具有原来的生理功能,在适宜的条件下,细胞壁能在形成,恢复为一个细胞,在培养基上形成菌落,这就是再生.再生培养基有麦芽糖10%,葡萄糖4%,酵母粉4%(MDY)；麦芽糖10%,葡萄糖4%,酵母粉4%,菌丝提取液15%(MDYM);纤维二糖1.5%,蛋白胨0.2%,菌丝提取液20%.香菇原生质体再生方法:将制备好的原生质体经过滤和洗涤后,置于再生培养基MDYM中浅层培养(25℃),2天后把开始萌动的原生质体涂布在固体再生培养基表面,经10至15天后即开始出现微小的再生菌落,把这些菌落转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养,10至14天可长满斜面.再生滤可达10%左右,若采用再生培养基MDY,则再生率只有1%左右,说明不同营养成分对原生殖体再生的影响.再在生培养中,渗透压稳定剂以蔗糖为好.3原生质体融合(以香菇为例) 将两个单核亲本的原生质体以1：1混合(每个原生质体数目在5×10/6毫升以上),混匀后缓慢加入等体积的聚乙二醇溶液[ 聚乙二醇溶液4000,30%,10毫摩/升氯化钙 ,氢离子浓度3136纳摩/升(PH5.5)],与24℃静止30分钟,用0.05摩/升甘氨酸,50毫摩/ 升氯化钙,氢离子浓度 0.316纳摩/升(PH9.5)的缓冲液冲洗2至3次,稀释后取0.1毫升放入0.5%软琼脂融合子再生培养基中,混匀后把它薄薄地铺在 1.5%琼脂的融合子再生培养平板上,25℃培养.4. 融合子的检出于鉴定待培养基上出现肉眼可见的微小再生菌落时,将其分别转移到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上,镜检菌丝有无锁状联合.融合子的鉴定可做以下试验:镜检有无锁状联合;融合子与亲本菌株的拮抗试验;酯酶同工酶谱;多酚氧化酶谱;DNA扩增仪分析;出菇试验.㈥单核和同核原生质体杂方法由于单核和同和原生质体是直接来源于营养菌丝 ,没有经过减数分裂的无性后代,所以这一材料为食用菌的遗传和育种研究提供了一个十分重要的基础材料.单核和同核原生质体与孢子单核体相比,有它自己的特点:它是自己从菌丝体得到的;只存在两种交配型(亲本型AXBX,AYBY);在菌落形态、菌丝生长速度﹑羧甲基纤维素酶相对活性和酯酶同工酶这4种性状上,都具有相对的稳定性,变异范围小,亲本性状不易在单核原生质体中分散和稀释,这就可以使人们在一个比较小的变异范围内去选择具有亲本性状的单核体.单核原生质体的这一特点在食用菌菌种改良中具有重要意义,同时也为遗传育种中充分利用野生种质资源提供了一个十分光明的前景.杂交的具体方法:同前法制备原生质体.分别取不同亲本的单核原生质体进行杂交(杂交方法同单孢杂交),得到杂交株后进行初筛﹑复筛,中试推广.(七)单双核杂交方法选用两个亲本,其中一个用其双核菌丝,另一个分离单核原生质体,在平板上先接种单核原生质体,待菌落长到1厘米左右时,相距0.5∽1厘米处接种双核菌丝,适温培养.数天后,挑取单核菌丝一边.少许菌丝镜检,如有锁状联合,说明已杂交成功,可行扩管培养,进行筛选.四﹑基因工程育种基因工程就是基因水平上的遗传工程.它是用人工方法把人们所需要的某一供体生物的遗传物质---- 脱氧核糖核酸(DNA)大分子提取出来,在离体条件下切割后,把它和作为载体的脱氧核糖核酸分子连接起来,然后导入某一受体细胞中,以让外来的遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得符合人们预先设计要求的新物种.基因工程主要包括以下步骤︰准备材料,如“目的”基因﹑载体及工具酶等;体外重组;载体传递﹑复制表达.基因工程育种在医﹑工﹑农方面有较多的研究,食用菌育种上研究甚少.。
微生物紫外线诱变育种的一般流程
微生物紫外线诱变育种的一般流程微生物紫外线诱变育种啊，这可挺有趣的呢。
一、出发菌株的选择。
这就像是选种子一样，咱们得挑个好的出发菌株。
这个菌株得是那种本身就有点潜力的，比如说它在某些方面已经表现得还不错了，像是生长速度还行啦，或者对环境有一定的适应能力之类的。
要是一开始就选个病恹恹的菌株，那后面再怎么诱变可能都白搭。
就好比你要培养一个运动员，你得先找个身体素质有点基础的人，不能找个整天生病的呀。
二、菌悬液的制备。
把选好的菌株弄成菌悬液，这就像是把种子泡在水里，让它们能均匀地分布。
这个菌悬液的浓度可不能太浓也不能太稀哦。
太浓了呢，紫外线可能照不均匀，就像一群人挤在一起，有些地方晒得到太阳，有些地方晒不到。
太稀了呢，那最后得到的突变体可能就太少了。
一般来说，咱们得根据经验或者查一些资料来确定这个合适的浓度。
在制备菌悬液的时候，还得注意保持菌株的活性，就像照顾小宝贝一样，环境得适宜，营养也不能少，可不能让它们在这个时候就挂掉了。
三、紫外线照射。
这可是关键的一步呢。
就像是给这些微生物来一场刺激的阳光浴，不过这个阳光可是紫外线。
咱们得把菌悬液放在紫外线灯下照射。
这个照射的时间和距离都很有讲究哦。
照射时间太短，可能诱变效果不明显，微生物还是老样子。
照射时间太长呢，那微生物可能就被紫外线给“晒死”啦，就像人在太阳下晒太久会中暑一样。
距离也很重要，离得太近，紫外线强度太大，离得太远，强度又不够。
而且在照射的时候啊，最好能让菌悬液不断地晃动，这样能保证每个微生物都能比较均匀地接受紫外线的洗礼。
四、后培养。
经过紫外线照射后的微生物可都是“受过伤”的小宝贝啦。
这时候要把它们放到合适的培养基里进行后培养。
这个培养基就像是一个温馨的小窝，给它们提供营养，让它们慢慢恢复，并且在这个过程中表现出那些因为诱变而产生的新特性。
在这个阶段，咱们得密切观察微生物的生长情况，看看有没有出现一些特别的变化，比如说生长速度突然变快了，或者对某种物质的代谢能力变强了之类的。
细菌紫外诱变实验报告
一、实验目的1. 了解紫外线对细菌的诱变作用。
2. 掌握紫外诱变实验的基本原理和方法。
3. 熟悉营养缺陷型菌株的筛选和鉴定方法。
二、实验原理紫外线是一种波长在10-400纳米之间的电磁波，对微生物具有强烈的杀伤作用。
在一定条件下，紫外线可以诱导微生物发生基因突变，从而产生新的遗传特性。
本实验采用紫外线照射大肠杆菌，通过筛选和鉴定营养缺陷型菌株，研究紫外线对细菌的诱变作用。
三、实验材料1. 实验菌株：大肠杆菌（E. coli）2. 培养基：LB培养基、固体LB培养基、营养缺陷型培养基3. 试剂：紫外线灯、青霉素、琼脂糖、无菌水、无菌滤纸、无菌试管、无菌吸管、酒精灯、显微镜等四、实验方法1. 菌株培养：将大肠杆菌接种于LB培养基中，在37℃恒温培养箱中培养过夜。
2. 紫外线照射：将培养好的大肠杆菌均匀涂布于固体LB培养基平板上，置于紫外灯下照射。
照射时间根据实验设计而定，本实验中照射时间为10分钟。
3. 营养缺陷型菌株筛选：将照射后的平板置于37℃恒温培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种于营养缺陷型培养基中，观察菌株生长情况。
4. 营养缺陷型菌株鉴定：对生长缓慢或不能生长的菌株进行鉴定，鉴定方法如下：（1）青霉素筛选：将疑似营养缺陷型菌株接种于含有青霉素的LB培养基平板上，观察菌株生长情况。
（2）生长谱法：将疑似营养缺陷型菌株接种于不同氨基酸的营养缺陷型培养基平板上，观察菌株在不同氨基酸培养基上的生长情况。
5. 数据统计与分析：对实验结果进行统计和分析，得出紫外线对大肠杆菌诱变作用的结论。
五、实验结果1. 紫外线照射后，平板上出现部分生长缓慢或不能生长的菌株。
2. 青霉素筛选实验中，部分菌株在含有青霉素的培养基上生长缓慢或不能生长。
3. 生长谱法实验中，部分菌株在特定氨基酸培养基上生长缓慢或不能生长。
六、实验讨论1. 紫外线照射对大肠杆菌的诱变作用：本实验结果表明，紫外线照射可以诱导大肠杆菌发生基因突变，产生营养缺陷型菌株。
实验二 微生物的诱变育种
四、实验内容
紫外线对枯草芽孢杆菌存活率的影响
照射时 间 15s 稀释 度 ① ② ③ ① ② ③ 平板菌落(个/ml) 平板1 平板2 平板3 细胞浓度平均 存活率(%) 值N1 (个/ml) (N1/N0)
30s
45s / 90s
0s(对照) ① ② ③ 100
五、结果与讨论
• 实验选择诱变时间时，全班共同绘制一条致死 曲线，每个组或几个组选择一个诱变处理时间， 最后统一进行绘制。
四、实验内容
• 4. 诱变处理 • (1) 取10ml菌液于φ90mm的培养皿中（带有磁棒），将 皿放置于诱变箱内的磁力搅拌器上。 • (2) 开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开 皿盖，分别照射15、30、45、60、75、90s。 • (3) 取不同时间诱变处理的菌液1ml，以肉汤固体培养基 平板，按照上述菌落计数的方法进行适当稀释后，采 用肉汤固体培养基倾注法测定处理液中存活的细胞浓 度（每个照射剂量做三个稀释度，每一稀释度平行做 三个平皿）。将结果填入下表
两组一起配
（1） (0.9%)600mL (用钢桶） 生理盐水
一、每组准备东西： （1）完全培养基：液体25mL/△250, 3个，6层纱布封口 固体300mL/△500, 1个 （2）生理盐水：10mL/支, 10支 9mL/支, 20支，用移液管分装 5mL/支, 2支 2mL/支, 1支 （3）液体无N基本培养基 10mL/△100 , 1个 液体2N基本培养基 10mL/△100 , 1个 （4）固体基本培养基 50mL/△250, 1个 固体限制培养基 100mL/△250，1个 （5）包扎所有移液管 （6）包扎两支涂布器 （7）包扎剩余平板
二、实验原理
• 紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难， 在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死 亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际 意义。
实验三 紫外线处理产植酸酶菌株后诱变效应的观察
实验三紫外线处理产植酸酶菌株后诱变效应的观察一、实验目的以紫外线诱变获得植酸酶高产菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法，掌握紫外线作用的机理，熟悉紫外线诱变的步骤，懂得存活率的计算，学会优良菌株的筛选方法。
二、实验原理紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。
在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。
外线诱变一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20~30 cm，照射时间依菌种而异，一般为1~3 min，死亡率控制在70％~80％为宜。
被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。
同时，对于细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为最好。
本实验以紫外线处理植酸酶产生菌，通过透明圈法初筛，选择酶活力高的生产菌株。
三、实验内容：1．对植酸酶出发菌株进行处理，制备细胞悬液；2．用紫外线进行诱变处理；3．用平板透明圈法进行初筛；统计透明圈个数及C/H值。
四、实验材料和用具植酸酶产生菌摇瓶菌种；植酸酶产生菌筛选平板三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。
五、操作步骤(一)出发菌株的选择及菌悬液制备1．出发菌株的选择自然界筛选得到的高产植酸酶的菌株，取一环接种于盛有20 mL培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养12h，即为对数生长期的菌种。
2. 菌悬液制备取5mL发酵液于10mL离心管中，以3000r/min离心10min，弃去上清液。
加入无菌水9mL，振荡洗涤，离心10min，弃去上清液。
加入无菌水9mL，振荡均匀。
细胞浓度为106～108个/mL，冷冻保藏备用。
紫外诱变育种方案
紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选一、目的要求1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。
但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。
另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。
三、实验材料(一) 菌种大肠杆菌(二) 培养基（完全培养基）1. 肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 0.5 g蛋白胨 1.0 gNaCl 0.5 g水 100 mLpH 7.2100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。
如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。
如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。
(三) 主要药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。
(四) 主要器皿试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。
四、实验内容(一) 诱变1. 菌悬液的制备出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。
取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。
紫外线诱变育种
紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株一、实验目的1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。
二、实验原理紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。
紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。
被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。
同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。
本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。
三、实验材料1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3.培养基和试剂①无菌水、75%酒精②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～7.0，121℃灭菌20m i n。
④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。
四、实验步骤1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。
2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。
加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。
紫外线诱变实验的总结体会
紫外线诱变实验的总结体会
实验报告本，实验目的与方法：紫外线对拟南芥和烟草的单倍体诱导效应的比较。
实验材料与用具：1.紫外线辐照仪；2.已经处理过的拟南芥种子100粒；3.放大镜、镊子各1支；4.塑料花盆若干个；
5.装有蒸馏水的烧杯20个；
6.空白种子100粒；
7.纱布（吸水性强）10块。
实验步骤：在实验前将紫外线诱变剂溶液配置好并调节至规定浓度，对种子进行充分预处理后将处理过的种子均匀播于花盆中，盖上塑料薄膜保湿；培养箱内温度25℃，湿度70%～80%，每天打开一次，4天后观察到明显单倍体诱发现象。
从结果看出：通过对原始材料种子及预处理过的种子进行紫外线诱变，两者都能获得较为稳定的突变型。
说明紫外线诱变不仅可以成功地使得无子植株的产生，而且还能诱导多倍体。
并且发现预处理过的种子的获得率远远高于未处理过的种子，这也表明了预处理在植物诱变育种工作中的重要性。
总结：紫外线诱变试验是高等植物遗传育种的一项重要手段，它既克服了杂交育种受自然条件限制所带来的缺点又弥补了细胞学筛
选存在的不足。
当今我们要更加深入研究这些植物细胞学特征。
实验心得：从实验中我们知道，光是由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫七色组成的。
阳光透过三棱镜后分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七色光。
其中波长较长的红光、橙光、黄光穿透力最强，可以直接透过玻璃和薄纸，被人眼直接看到，称为可见光。
而波长较短的蓝光、紫光，因被大气中的水分吸收和散射较多，穿透能力很差，只能在空气中传播很短距离就进入了生物的眼睛，我们用肉眼看不到。
紫外线对枯草芽孢杆菌诱变
[7]石磊，梁运章.物理因子对微生物诱变作用的研究进展[J].内蒙古 大学学报（自然科学版），2006,1（1）. 微生物与食品卫生、医药健康、生态环境、资源使用、农畜牧业等 方面息息相关。用于工业生产上的微生物主要是从自然界筛选或选 育的，为了获得优质、高产、低耗的工业微生物，人们采用各种物 理因子对微生物进行诱变处理的试验研究，并获得成功，其中有些 经诱变的微生物菌株应用于工农业生产中。介绍了近几年人们用激 光、电磁波、离子束等几种物理因子对微生物进行处理得到的一些 研究成果及基本机理分析。 [8]贾啸静.微生物药物产生菌诱变育种方法的应用和进展[J].河北省 科学院学报，2006,23（3）. 产微生物药物的原始菌株往往产量较低, 为满足工业生产的需要, 需 要通过合适的诱变育种方法进行改良。详细介绍了目前较为通用的 几种物理和化学诱变育种技术及其应用情况, 同时简述了获得高产 突变株的几种筛选方式。
[9]许翠，高梦祥.微生物菌种诱变筛选方法及其应用 [J].长江大学学报（自然科学版），2013,35（12）. 野生微生物菌株的代谢产物的产量通常很低，不能 满足工业生产的需求， 因此简单高效、定向稳定的 微生物菌种诱变技术和快速、有效的高通量筛选方 法在微生物菌种选育中显得至关重要。综述了近年 来国内外微生物菌种诱变筛选领域出现的新技术和 新方法，可为微生物菌种诱变筛选等相关研究提供 参考。 [10]王雅参君，陈力力，等.微生物物理诱变育种方 法的研究进展[J].农产品加工· 学学刊，2013（2）.
技术路线：
材料器具准备
紫外线诱变处理
菌悬液制备
平板制作 稀释涂平板计Biblioteka 存活率 及致死率稀释菌悬液
操作步骤
1.菌悬液制备 将枯草芽孢杆菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上， 37℃培养20h，使其活化，取已培养20 h 的活 化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水 将菌苔洗下，倒入离心管中，离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐 水洗涤2 次，最后制成菌悬液，用血球计数板 在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。 2. 平板制作 将培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。
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实验三紫外线的诱变育种（学时：4）
一、目的要求
通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
二、基本原理
紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
三、菌种与仪器
菌种：枯草芽孢杆菌；
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机
四、操作步骤
1.菌悬液的制备
A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
3.紫外线处理
A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。
以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6.培养
将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。
注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。
8.观察诱变效应
将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。
与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。
并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。
此斜面可作复筛用。
五、实验结果（将实验结果填入下表）
六、思考题
1.用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？
2.经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？。