实验三 紫外线的诱变育种

实验三紫外线的诱变育种（学时：4）

一、目的要求

通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。

二、基本原理

紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。

三、菌种与仪器

菌种：枯草芽孢杆菌；

仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机

四、操作步骤

1.菌悬液的制备

A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。

B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。

C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。

3.紫外线处理

A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。

B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。

C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。

4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。

5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。

6.培养

将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

8.观察诱变效应

将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。

五、实验结果（将实验结果填入下表）

六、思考题

1.用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？

2.经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？