第五章_分子生物学研究方法(朱玉贤版)

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亚克隆的概念
• 是对已经获得的目的DNA片段进行 重新克隆，其目的在于对目的DNA进行 进一步分析，或者进行重组改造等。
基因克隆
是指应用酶学的方法，在体外将目 的基因与载体DNA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子（重组体），继而通 过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目 的基因的转化子细胞，再进行扩增、提 取获得大量相同的DNA分子拷贝。
• 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术， 于1972年获得第一个重组DNA分子，1973年Cohen第一例成 功的克隆实验：完成第一例细菌基因克隆。 • 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了 DNA序列测定技术。 • 1977 年完成了全长5387bp的噬菌体φ 174基因组测定。 • 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人 脑激素和人胰岛素。Genentech公司 人胰岛素 世界 上第一种基因工程蛋白药物 • 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 • 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠； A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
一、基因工程概述
1.概念 基因工程：是指将外源基因经过剪切加工， 再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA中， 就得到重组DNA，再将重组DNA转移到一个寄 主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分 裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所 携带的新特性。
2.基因工程的基本程序及技术特点：
①基本程序： 分—切—接—转—筛
3． 细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获 了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征 发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的 菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株 则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验 菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2 处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作 用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤： 1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上， 这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、 菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标 记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。 所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
(5).
PCR的主要步骤小结
每一双链DNA模板，经过一轮变性 （解链）、退火、延伸 3个步骤的热循环 后就成了两个双链DNA分子。如此反复 进行，每一次循环所得到的双链DNA （PCR产物）均能成为下一次循环的模 板，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩 增，经过25～30个循环后，理论上可使 DNA模板扩增到109倍以上，实际上一般 可达106～107倍。
Fra Baidu bibliotek
DNA测序的全过程(实际)
5． 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个 特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过 程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋 白质工程的重要手段。 如： 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒 式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。
7. PCR技术（基因的体外扩增法）
• (1).概念
PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种 在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。
特别注意：
经过n轮PCR扩增循环,理论上可以得到2n 个新生的DNA分子。
( 2). 一个PCR体系的基本组成
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6． 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.
a.凝胶滞缓 实验(Gel retardation assay)， 又称DNA迁 移率变化试 验(DNA mobility shift assay-EMSA)。
b． DNase I 印迹试验（DNase I foot printing） • 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关 键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断 裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。 • 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合， 那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作 用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋 白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出 现了一个空白的区域,形象地称为足迹。
(3). PCR(聚合酶链式反应)基本原理
(4) . PCR的主要步骤
• ①.高温变性 在高温（93-95℃）下，待扩增的双链DNA模 板受热变性成为两条单链DNA模板。 • ②.低温退火 在低温（37～60℃）情况下，两条人工合成的 寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部 分双链。 • ③.适温延伸 在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以 引物3’ -OH端为合成的起点，以脱氧核苷三磷酸 （dNTPs）为原料，按5’→3’方向延伸,合成单链 DNA模板的互补链。
DNA聚合酶Ⅰ
反转录酶 多核苷酸激酶
探针标记、 从3′-OH端补平双链ＤＮＡ中 的缺口
以RNA链为模板，进行cDNA合成 5′－ＯＨ磷酸化、探针标记
4． DNA序列分析 a. Sanger的双脱氧链终止法 Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱 氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如 下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确 的DNA互补链； DNA聚合酶常用Klenow大片段， 无5'→3'外切酶活性。 ②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其 延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA， 引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA 聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种 ddNTP。
• 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物— 重组人胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体 48,502bp全序列测定。 • 1983 获得第一例转基因植物。 • 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 • 1985 出现第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国转基因鱼 • 1988 J. D. Watson出任“人类基因组计划” 首席科学家。 • 1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠-―Oncomouse‖。 • 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染 色体全序列测定(315kb)
双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图
b． DNA序列分析自 动化(分析反应\读 片过程 )
用四甲基若丹明 (Tetramethylrhoda mine)作为荧光剂 标记DNA引物，带 有这种引物的DNA 片段能在激光诱导 下发出荧光。按照 标准的双脱氧终止 法或化学终止法进 行测序反应，跑 DNA凝胶后,用计 算机检测。
DNA测序 • 分子杂交
4.基因克隆
4.1概念
克隆的概念
⑪在多细胞的高等生物个体水平上，是指由具有 相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的 群体。 ⑫在细胞水平上，是指由同一个祖细胞分裂而来 的一群遗传上同一的子细胞群体。 ⑬在分子生物学上，是指将外源DNA插入具有复 制能力的载体DNA中，使之永久保存和复制的过 程。
• 1993 -1994 第一批基因工程西红柿在美国上 市。 • 1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列 测定。 • 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 • 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责 测定人类基因组全部序列的1% • 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 • 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
生物技术工程
• 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞 工程
重组DNA技术发展史上的重大 事件
• 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 • 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 • 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实噬菌体的遗传物质 是DNA。 • 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺 旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 • 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 • 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制 模型。 • 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证 明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 • 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表 达。
4.2基因克隆示意图
载 体 DNA (限 制 性 内 切 酶 切 开 )
＋
目的基因
＋
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表达
二.基因工程的要素及实施
（一）、工具酶
1.常用的工具酶的功能：
酶类名称
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
识别并在特定位点切割DNA
通过生成3′, 5′-磷酸二酯键,把两个或多个 DNA片段连接成一个DNA分子
基 因 工 程 的 基 本 程 序
• ②技术特点： 1. 可在体外根据需要进行人工的、 有目的的基因重组、表达、测序、诱变、 修复； 2. 方法简便、快速、准确、特异， 能保证研究与开发的需要。
3.基因工程的主要技术
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DNA、RNA的分离纯化 凝胶电泳技术 PCR技术 DNA合成技术 DNA重组 微生物的培养、保存 酶切 鉴定
第五章. 分子生物学研究方法
第一节 基因操作的主要技术 原理
1． 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide) • 将某种分子放到特定的电场中，它就会以 一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场 作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场 强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正 比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、 极性、介质的粘度系数等）。 • 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是 离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚 阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放 到电场中，它就会由负极→正极移动。
基因工程中常见的名词: ①遗传工程--genetic engineering， ②基因操作--gone manipulation， ③基因克隆--gone cloning ④重组DNA技术--recombinant DNA technology ⑤分子克隆--molecular cloning。
第二节 基因工程
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在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭 （EB）--ethidium bromide染色，此时，核 酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到 约50ng DNA所形成的条带。 • DNA的脉冲电场电泳技术 :PFGEPulse-field gel electrophoresis
2． 核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶 电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交 之前，通过毛细管作用或电导作用按其在 凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到 滤膜上的。 常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素 滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM） 和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）