密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光染色
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课程名称：细胞生物学实验 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称：密度梯度法分离提纯叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 七、实验结果与分析（必填） 二、实验内容和原理（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得
一、实验目的 学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。 二、实验原理 1、一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及
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悬浮介质的粘度有关； 2、用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细 胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可 粗略地分离叶绿体。 三、实验用品 1. 材料：新鲜菠菜叶 2. 器材：光学显微镜、荧光显微镜、台式高速冷冻离心机，研钵、剪刀、托盘、玻皿 等 3. 试剂： （1）匀浆介质（0.25 mol/L 蔗糖、0.05 mol/L Tris-HCI 缓冲液，pH7.4） （2） 50%蔗糖溶液， （3）15%蔗糖溶液 四、实验步骤 1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、主脉后，称取 2~3g，剪碎置研钵中。 2. 加入 10ml 匀浆介质于研钵中，研磨成糜状。 3. 用双层纱布过滤捣碎液到烧杯中。 4. 将滤液倒于离心管内，500rpm 离心 10min，轻轻吸取上清液。 5. 先将 50%蔗糖溶液 0.4ml 加入离心管， 再取 15%蔗糖溶液 0.4ml 小心沿管壁缓缓注入， 不能搅动 50%蔗糖液面，使两种溶液界面可见，制成密度梯度。 6. 加入 0.4ml 上清液，严格平衡离心管后，用水平转头 8000r/min 离心，20min。 7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。另
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取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观察。 （角转取中间靠壁的叶绿体） 五、讨论、心得 本实验中最大的难点是蔗糖溶液梯度的制备。若要制得清晰，平整的界面，需要将离 心管置于稳定的水平界面上；最重要的是，向下层溶液中加入上层溶液时，需要极小心、 熟练地控制滴加的力度，并使枪头贴着 EP 管壁，进而让液滴缓慢的流下。 另外，分离完整的叶绿体也存在以下困难：1、植物细胞被坚韧的纤维质细胞壁包围。 破碎细胞时既要足以打破细胞壁，同时又要保持叶绿体的完整。研磨后，成糜状，防止叶 绿体被过度研磨而破坏。 叶绿体中由淀粉积累而成的致密颗粒会在离心过程中使叶绿体 2、 破碎。3、匀浆过程中，液泡中贮藏的有毒物质会释放出来，破坏叶绿体。因此，匀浆应在 低温下、快速进行。 六、思考题 1、分离的叶绿体是否纯净？试分析原因。 答：不纯净。 一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬 浮介质的粘度有关。因此，在捣碎细胞之后，各细胞成分混合开来，其中包括了沉降系数 小于或接近于叶绿体的成分。采用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，不仅 原来的一部分叶绿体在破碎细胞时被破坏，完整或不完整的的叶绿体以及比它沉降系数小 的细胞组分也混合在了梯度交接处；而沉降系数较大的细胞组分沉到了离心管底部。分离 采用的两密度梯度离心，只能粗分或富集叶绿体。 2、匀浆介质选用 0.25mol/L 的蔗糖溶液：是因为这是植物细胞的等渗溶液，对叶绿体 的结构完整性无破坏作用。应维持匀浆介质的离子浓度、pH 值和渗透压与目标物质环境基 本相同。
一、实验目的 学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。 二、实验原理 1、一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及
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悬浮介质的粘度有关； 2、用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细 胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可 粗略地分离叶绿体。 三、实验用品 1. 材料：新鲜菠菜叶 2. 器材：光学显微镜、荧光显微镜、台式高速冷冻离心机，研钵、剪刀、托盘、玻皿 等 3. 试剂： （1）匀浆介质（0.25 mol/L 蔗糖、0.05 mol/L Tris-HCI 缓冲液，pH7.4） （2） 50%蔗糖溶液， （3）15%蔗糖溶液 四、实验步骤 1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、主脉后，称取 2~3g，剪碎置研钵中。 2. 加入 10ml 匀浆介质于研钵中，研磨成糜状。 3. 用双层纱布过滤捣碎液到烧杯中。 4. 将滤液倒于离心管内，500rpm 离心 10min，轻轻吸取上清液。 5. 先将 50%蔗糖溶液 0.4ml 加入离心管， 再取 15%蔗糖溶液 0.4ml 小心沿管壁缓缓注入， 不能搅动 50%蔗糖液面，使两种溶液界面可见，制成密度梯度。 6. 加入 0.4ml 上清液，严格平衡离心管后，用水平转头 8000r/min 离心，20min。 7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。另
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取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观察。 （角转取中间靠壁的叶绿体） 五、讨论、心得 本实验中最大的难点是蔗糖溶液梯度的制备。若要制得清晰，平整的界面，需要将离 心管置于稳定的水平界面上；最重要的是，向下层溶液中加入上层溶液时，需要极小心、 熟练地控制滴加的力度，并使枪头贴着 EP 管壁，进而让液滴缓慢的流下。 另外，分离完整的叶绿体也存在以下困难：1、植物细胞被坚韧的纤维质细胞壁包围。 破碎细胞时既要足以打破细胞壁，同时又要保持叶绿体的完整。研磨后，成糜状，防止叶 绿体被过度研磨而破坏。 叶绿体中由淀粉积累而成的致密颗粒会在离心过程中使叶绿体 2、 破碎。3、匀浆过程中，液泡中贮藏的有毒物质会释放出来，破坏叶绿体。因此，匀浆应在 低温下、快速进行。 六、思考题 1、分离的叶绿体是否纯净？试分析原因。 答：不纯净。 一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬 浮介质的粘度有关。因此，在捣碎细胞之后，各细胞成分混合开来，其中包括了沉降系数 小于或接近于叶绿体的成分。采用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，不仅 原来的一部分叶绿体在破碎细胞时被破坏，完整或不完整的的叶绿体以及比它沉降系数小 的细胞组分也混合在了梯度交接处；而沉降系数较大的细胞组分沉到了离心管底部。分离 采用的两密度梯度离心，只能粗分或富集叶绿体。 2、匀浆介质选用 0.25mol/L 的蔗糖溶液：是因为这是植物细胞的等渗溶液，对叶绿体 的结构完整性无破坏作用。应维持匀浆介质的离子浓度、pH 值和渗透压与目标物质环境基 本相同。