生物制药课件-2-2

+ _ +ຫໍສະໝຸດ 正电荷分布 + _ _
_ + 负电荷分布
8 距固体表面的距离
扩散层
影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化 合价以及无机盐的用量等。阳离子对带负电荷 的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+ 常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3· 18H2O、 AlCl3· 6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。
第二章 生物制药工艺技术基础 萃取分离技术
• 利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的 技术。 • 一 有机溶剂萃取 • 注意防止变性：温度，接触时间 • 1有机溶剂选择 • 2操作：萃取，分离
双水相萃取
• 双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或互不相溶的盐溶液和高分子溶液 组成。 • 双水相体系是指某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当的 浓度溶解后形成互不相溶的2 相或多相水相体系。 • 双水相体系萃取分离原理是基于生物质在双水相体系中的选择性分配。当 生物物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配 关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。 • 双水相萃取体系的特点:(1 ) 易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收 率并不降低。(2 ) 双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，收效率高， 相对于某些分离过程来说，能耗较小，速度快。如选择适当体系，回收率 可达80%以上，提纯倍数可达2 ～ 20 倍；(3 ) 易于进行连续化操作，设备 简单，且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理； • 双水相萃取的应用:生物工程技术中物质的提取与纯化;中草药有效成分的 提取 • 分配系数的大小决定了萃取分离的效果。可采取修饰高分子聚合物的方式 提高分配系数。
第三节、 液-固分离
一、过滤 （一）过滤方式 1、常规过滤 2、错流过滤 （二）、过滤设备 1、漏斗式 2、板框过滤机 二、离心分离
1、过滤式离心机 2、螺旋式离心机 3、管式离心机
三、影响液-固分离的因素 （一）、悬浮物种类 （二）、悬浮液黏度 （三）、其他因素
第四节 凝胶层析 (Gel chromatography)
凝聚作用(coagulation)是指在某些电解质作用下， 使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏 了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过 _ _ _ _ + 程。 _ + +
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ + + + + + + 吸附层
电荷密度
+ + + _ + +
+ _ _ + + _ + + _
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凝胶层析的特点
• （ 1 ）凝胶层析操作简便，所需设备简 单。 • （2）分离效果较好，重复性高。 • （3）分离条件缓和。 • （4）应用广泛。 • （5）分辨率不高，分离操作较慢。
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第二节 凝胶的结构和性质
• • • • • • 一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
一、机械法
1、匀浆法
二、物理法
1、干燥
三、化学法 1、化学试剂处理 2、酶解法 3、制成丙酮粉
2、珠磨法
3、超声波
2、冻融
3、渗透压冲击
一、机械法
• （一）高速珠磨机 • （二）超声波振荡器
二、物理法
（一）干燥法 空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥 （二）冻融法 （三）渗透压冲击法 先把细胞放在高渗溶液中，细胞发生收缩，然后将介质 快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，细胞快速膨胀， 使产物释放至溶液中
2.干燥：①低温真空干燥；②喷雾干燥；③冷冻干燥
色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦
第二章 生物材料的预处理 和液固分离 第一节、 生物材料的预处理
生物材料的特点 1、含量低 如胰岛素在胰脏中的含量为0.02%，胆 汁中胆红素含量为0.05~0.08% 2、杂质多 3、易变性失活
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• （三）Supperdex系凝胶 • 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而 成。 • （四）Sephacryl系凝胶 • 是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价 交联制成的。 • 理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。
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三、聚丙烯酰胺凝胶
• 商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。 • 该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚 甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚 合而成。
渗透压冲击法 渗透压突然变化，使细 较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用 胞快速膨胀破裂 化学试剂处理 应 用 化 学 试 剂 溶 解 细 需选择合适的试剂，减小对活性物质的破坏， 胞 或 抽 提 某 些 细 胞 组 可应用于大规模生产 分 化 学 酶解法 用 酶 反 应 分 解 破 坏 细 反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小 法 胞壁上特殊的化学键 规模应用 制成丙酮粉 丙酮迅速脱水，破坏蛋 迅速脱水，可减少蛋白质变性，促进某些结合 白质与脂质结合的键 酶释放
凝胶层析(Gel chromatography) • 分子筛层析、凝胶扩散层析、排阻层析、限 制扩散层析等。 • 是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于各组分流经体积的差异，使不同分子量 的组分得以分离的层析方法。
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一、 凝胶层析的基本原理
• 凝胶层析的分离过程是在装有 多孔物质填料的柱中进行的。 • 柱的总体积为 VA ，它包括填 料的骨架体积 VGM，填料的孔 体积 Vi( 内水体积 ) 以及填料颗 粒之间的体积V0（外水体积）。 • VA=V1+V0+VGM
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一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
• 商品名为Sephadex G类 . • 交联葡聚糖的基本骨架是葡 聚糖。 • 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为 交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 • 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
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保存
• 保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。 • 湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保 存（6个月以内）。 • 常用 0.02% 叠氮化钠、 0.02% 三氯叔丁醇、 20% 乙醇等。 • 干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝 胶，脱水收缩，抽滤，用60~80℃吹干。
• 最后流出物质 C，它分子量最小，其分子可 以自由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经 体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。 • 物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其 分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分 排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部 外水体积加上内水体积的一部分，即 Ve=V0+KdVi
一、选择预处理方法的依据
1、生物活性物质来源、存在状态 “胞内” 、“胞外”、前体 2、后续工艺要求 3、稳定性 可被材料中酶、微生物破坏，还可能受 酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温度、 甚至空气和光线作用改变活性。
二、动物材料的预处理-粉碎
绞肉机绞 匀浆和组织捣碎
三、细胞培养液的预处理
（一）、杂蛋白质的去除 1、加入凝聚剂
在发酵液中加入具有相反电性的电解质：①、 中和胶粒电性，降低双电层排斥力。 ②、离子 的水化作用，破坏胶粒的水化层。
2、加入絮凝剂 絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物，如壳聚 糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生 物和聚丙烯酸类等。 絮凝剂具有长链线状的结构，易溶于水，其分子量可高达 数万至一千万以上，在长的链上含有相当多的活性功能 团。 影响絮凝效果的因素主要有： （1）絮凝剂的分子量： （2）絮凝剂的用量： （3）溶液pH值： （4）搅拌速度和时间：
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琼脂糖凝胶分离范围
琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、 6B分别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。
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（二）架桥琼脂糖凝胶
（Sepharose CL）
• 架桥琼脂糖凝胶为琼 脂线性分子经 1 ， 3- 二 溴丙醇交联的凝胶。
• 它的凝胶孔径均匀， 机械强度明显加大。 • 对热和化学物质的稳 定性大大增加,在 pH3~14范围内稳定。
流动分离理论
• 较大的分子较先通过或绕 过这个填料颗粒，使溶质 能按其大小进行分离。
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分离过程
• 三种不同分子量物 质的混合样品用某 种规格的凝胶柱进 行分离。 • 样品加入，以水或 其他溶液进行洗脱， 即得洗脱曲线 。
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分离过程
• 最先流出物质 A ， A 分子量最大，完全不能 进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其流经体积最小，等于外水体 积V0。
聚丙烯酰胺凝胶的性质
• 生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 • 如Bio-Gel P-100。
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四、琼脂糖类凝胶
（Sepharose ）
• （一）琼脂糖凝胶
• 结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖 以α-1，3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的 链状分子。
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琼脂糖凝胶特点
• • • • • • 1、没有共价键的交联。 2、孔径 琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、非特异性吸附力低。 5、分离范围大。 6、颗粒强度差。
超临界萃取
• 超临界流体：在温度和压力超过某物质的超临界点时，该物质称为超临 界流体。 • 超临界萃取所用的萃取剂为超临界流体，超临界流体是介于气液之间的 一种既非气态又非液态的物态，这种物质只能在其温度和压力超过临界 点时才能存在。超临界流体的密度较大，与液体相仿，而它的粘度又较 接近于气体。因此超临界流体是一种十分理想的萃取剂。 • 超临界流体的溶剂强度取决于萃取的温度和压力。利用这种特性，只需 改变萃取剂流体的压力和温度，就可以把样品中的不同组分按在流体中 溶解度的大小，先后萃取出来，在低压下弱极性的物质先萃取，随着压 力的增加，极性较大和大分子量的物质与基本性质，所以在程序升压下 进行超临界萃取不同萃取组分，同时还可以起到分离的作用。 特点：介于液体与气体之间，溶解能力与液体接近，扩散系数接近于气 体。 • 应用