3-2-蛋白质的化学修饰和分子生物学改造
蛋白质工程重点
一、名词解释1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。
2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。
3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。
4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。
5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。
6、晶胞(Unit cell)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。
7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。
8、化学势（位）移（）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。
9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。
理学蛋白质分子设计
• 先讲理论 • 后面举几个例子
蛋白质分子设计策略
• 理性设计策略
– 前提:充分了解结构与功能的关系
• 随机突变+功能筛选
– 前提:不了解结构与功能的关系
• 理性设计+随机突变+功能筛选
– 前提:不完全了解结构与功能的关系
分子设计的种类
小改：少数残基的替换，突变或修饰 中改：分子拼接，肽段或结构域的替换 大改：从头设计，全新蛋白质的设计
具体方法：
利用R55受体的结构 模建R75受体的结构
根据淋巴毒素与R55 的作用情况，模拟肿 瘤坏死因子与R55受 体的相互作用情况。
根据肿瘤坏死因子与 R55受体的相互作用 情况，模拟肿瘤坏死 因子与R75受体的相 互作用情况。
Gln67与R55作用不明显，但与R75的Asp有静电作用， 将它突变为结构相似但带电相反的Glu会降低TNF与 R75的作用，但不会改变与R55的作用。
0 0.02 0.2 2 20 200
Protein (ng)
mTSA BSA SEA
融合蛋白与A431细胞结合的剂量曲线
mTSA与A431细胞结合的特异性试验 A.Positive control EGF; B. pmTSA ; C. mTSA binding blocked by EGF; D. Blank control :PBS
基于结构的药物设计
确定靶蛋白的结合口袋，以结合口袋的结构环境设 计药物； 未知受体结构时，根据具有相同或相似生物学活性 的已知化合物的结构叠合，反推受体结合口袋的可能 结构环境，根据推测的受体结合口袋进行新型药物设 计。
蛋白质分子的模拟肽设计
骨架残基设计，肽库筛选 以结构为模板的分子设计。
蛋白质工程--3蛋白质的修饰和表达
2 蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定化主要是酶分子的固定
吸附法、交联法、包埋法、共价结合法 A）交联法 B）共价结合法 ➢载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度 和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团
➢反应必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中 进行
➢所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其他功能基团的 副反应尽可能少
3. 羧基的化学修饰 通过碳二亚胺法、混合酸酐法与蛋白质分子上的氨基形成
酰胺键
二硫键的化学修饰
二硫键的还原：必须使用超剂量的巯基乙 醇，同时用过羧甲基化处理
判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二 硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还 原双向SDS-PAGE电泳技术
2 蛋白质的位点专一性修饰
专一性： 试剂对被修饰基团的专一性 对蛋白质分子中被修饰部位的专一性
第三章 蛋白质的修饰和表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达
第一节 蛋白质的化学修饰
凡通过活性基团的引入或去除，而是蛋白质一级 结构发生改变的过程
影响因素： 1) 蛋白质功能基的反应活性 基团之间的氢键和静电作用 基团之间的空间阻力 2) 修饰剂的反应活性
1) 蛋白质修饰的交联方法和试剂
常用的方法通常有重氮化法、戊二醛法、过碘酸盐氧化 法、混合酸酐法及碳二亚胺法
A) 重氮化法: 重氮盐与蛋白质分子中的酪氨酸残基上的 邻位，即得到以偶氮键相连的结合物
B) 戊二醛法:戊二醛的两个醛基可以分别与两个相同或不 同分子上的伯氨基酸形成Schiff碱，将2分子以五碳链的 桥连接起来
1. 巯基的化学修饰
1）碘乙酸和碘乙酰胺 2）N-乙基马来酰亚胺：反应伴随光吸收的变化
content_03 蛋白质的修饰和表达
大肠杆菌表达体系的应用
当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱 氨酸或分子内的二硫键少于3～4个，以及不需要 翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多 可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。
1．表达载体的一般特点
(1) (2) (3) (4) (5) (6) 复制起始点 选择性基因 强的、可诱导的启动子 强的转录终止序列 核糖体结合位点 合适的多克隆位点
第三章 蛋白质的修饰和表达
第三章 蛋白质的修饰和表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径
一、功能基团的特异性修饰 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰
一、功能基团的特异性修饰
在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和 的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基 和羧基特别容易产生有用的取代。 因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止 一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况 下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧 基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在 化学上很难将肽链的α-氨基或α-羧基基团与侧链上的氨基 或羧基相区别。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法
① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变
2．区域性定向突变
基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也 可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段 取代法(DNA fragment replacement)。 这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性 内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序 列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。
蛋白质工程资料)
第一节蛋白质工程的物质基础概念：蛋白质工程(Protein Engineering)是以蛋白质的结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
（一）蛋白质的来源（5min）微生物：生长周期短，容易实现遗传操作，可以产生胞外酶。
植物：生长周期长，季节性强。
动物：医学方面的蛋白质。
（二）蛋白质的结构（5min）一级结构，二级结构，超二级结构，结构域，三级结构，四级结构（三）蛋白质的功能（10min）蛋白质的生物学功能：①具有生物催化功能；②具有调节功能；③具有运输功能；④具有运动功能；⑤可作为机体的结构成分；⑥具有防御和保护功能；⑦可作为生物体发育和生长的营养物质。
（四）蛋白质的结构与功能的关系（5min）蛋白质的生物功能与结构紧密相关第二节蛋白质工程的原理（一）蛋白质工程的理论依据（5min）基因指导蛋白质的合成（二）蛋白质工程设计原理（5min）蛋白质分子设计：基因水平，蛋白质水平蛋白质分子设计的三种类型：小改，中改，大改第三节蛋白质工程的程序和操作方法（一）蛋白质工程的程序（10min）筛选纯化目的蛋白，研究其特性；制备晶体，氨基酸测序，X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等研究，获得蛋白质结构与功能相关数据；结合生物信息学的方法对蛋白质的改造进行分析；由氨基酸序列及其化学结构预测蛋白质的空间结构，确定蛋白质结构与功能的关系，进而从中找出可以修饰的位点和可能的途径；根据氨基酸序列设计核酸引物或探针，并从cDNA文库或基因文库中获取编码该蛋白的基因序列；在基因改造方案设计的基础上，对编码蛋白的基因序列进行改造，并在不同的表达系统中表达；分离纯化表达产物，并对表达产物的结构和功能进行检测。
（二）蛋白质工程的操作方法（5min)理论基础：生物化学和结构生物学；蛋白质结构模拟预测平台：计算机辅助设计软件；提高设计的效率和正确性：分子生物学和基因工程技术，生物信息学。
第四版医学细胞生物学知识分类归纳
第一部分：功能、作用、意义1、胆固醇在膜中的作用：胆固醇的甾环与磷脂分子近头部烃链相互作用，增加膜的稳定性。
降低溶水性物质的通透性。
胆固醇的碳氢链可以弯曲，防止低温时膜的流动性突然降低。
2、质膜功能：.（1）维持相对稳定的内环境。
（2）物质交换和能量交换（3）是细胞与相邻细胞及细胞外基质的连接中介3、NA+-K+ATP酶介导主动运输的效应：直接效果维持胞内低Na+，高K+的特殊离子环境间接效果(1)调节细胞体积(2)促进物质吸收(3)维持重要酶活动必需的高K+环境(4)产生跨膜电位4、内质网的功能：（一）粗面内质网：蛋白质合成、加工修饰、转运；（1）、核糖体附着支架（2）、信号肽介导分泌性蛋白合成（重点）（3）、蛋白质糖基化（4）、蛋白质胞内运输（二）滑面内质网：（1)脂质、类固醇激素的合成(2)糖原的分解、(3)解毒作用、(4)Ca2＋储存场所(5)胃酸、胆汁合成与分泌5、高尔基体的功能：（1）蛋白质的化学修饰（2）蛋白质的加工改造（3）蛋白质的分拣运输（4）生物膜的成分更新6、溶酶体的功能：（1）清除衰老的细胞器，稳定细胞的内环境（2）消化病原菌，实现机体的防御、（3）消化多余的大分子，提供细胞营养、（4）参与个体的发生与发育（5）参与激素的生成（6）参与受精作用7、微管的功能：（1）支持、维持细胞的形态（2）参与中心粒、纤毛和鞭毛的形成（3）参与细胞内物质运输（4）维持细胞器的定位和分布（5）参与染色体的运动，调节细胞分裂（6）参与细胞内的信号传导8、微丝的功能：（1）构成细胞的支架并维持细胞的形态（2）参与细胞运动（3）参与细胞分裂（4）参与肌肉收缩（5）参与细胞内物质运输（6）参与细胞内信号传递9、中间纤维的功能：（1）在细胞内形成一个完整的网状骨架系统（2）为细胞提供机械强度支持 （3）参与细胞连接（4）参与细胞内信息传递及物质运输（5）维持细胞核膜稳定（6）参与细胞分化10、核膜的功能：（1）是核质之间的屏障，内外核膜的脂质双分子层可阻挡极性分子的通过，使细胞核物质维持一个相对稳定的微环境（2）具有物质交换的功能（3）具有物质代谢过程所需要的酶（4）作为基因的表达环节11、核孔复合体功能：介导细胞核与细胞质之间的物质运输 机械强度支持12、核纤层的功能：（1）在细胞核中起支架作用（2）与核膜的重建及染色质凝集关系密切（3）参与了细胞核构建与DNA复制13、核仁功能：rRNA基因转录和加工的场所、组装核糖体的亚单位。
医学分子生物学 蛋白质的修饰与降解
利用电泳、免疫共沉淀、色谱、生物质 谱、生物信息学等方法，对修饰蛋白质及 修饰位点进行鉴定。
第二节
蛋白质的降解
蛋白质的降解途径
• 泛素-蛋白酶体通路：需能，高效、特异的 蛋白质降解过程，控制着动植物体内绝大 多数蛋白质的降解。
• 自噬-溶酶体：不需能量。主要降解细胞外 和细胞膜蛋白质
泛素-蛋白酶体系统
溶酶体
蛋白质的修饰
概念：是指蛋白质翻译后进行共价修饰加工的过程， 通过一个或几个氨基酸残基加上修饰基团而改变 蛋白质的性质。
目的：调节蛋白质的活性，使蛋白质结构更为复杂， 功能更完善。
蛋白质的修饰
• 磷酸化修饰 • 脂基化修饰 • 甲基化修饰 • 乙酰化修饰 • 类泛素化修饰 • 巴豆酰化修饰
一、磷酸化修饰
泛素化过程的关键酶
• 泛素激活酶E1：细胞只表达一种E1，将泛素转 移到泛素结合酶E2上；
• 泛素偶连酶E2：约50种，E2与许多E3作用； • 泛素连接酶E3：约1000种，直接或间接与底物
蛋白结合，促进泛素从E2的硫酯键转移到底物 蛋白上，作为被UPS识别和降解的靶向信号。
泛素化反应
1. 泛素的活化：以ATP为能量，将泛素C-端的羧基 连接到泛素活化酶E1的巯基上，形成一个泛素和 泛素活化酶E1之间的硫酯键。
• 大多数蛋白质通过26S蛋白酶体以ATP和泛素依赖 方式降解；11S-20S-11S,11S-20S-19S，PA20020S-19S以不依赖ATP和泛素的方式降解一些调节 蛋白、氧化蛋白及衰老蛋白。
泛素的结构与组成
• 泛素含有76个氨基酸残基, 广泛存在于真核生物， • 泛素的氨基酸序列极其保 守。 •泛 素 共 价 结 合 于 底 物 蛋 白 的赖氨酸残基上，将底物蛋 白进行泛素化标记而被UPS 特异识别并迅速降解。
蛋白质工程重点
一、名词解释1、蛋白质工程(Protein Engineering)——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。
2、结构模体（supersecondary structure,motif）-—介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构，指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体,并充当三级结构的构件(block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。
3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区,它是相对独立的紧密球状实体。
4、蛋白质的折叠(protein folding）—-从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。
5、分子伴侣（molecular chaperone)-—一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。
6、晶胞（Unit cel l）-—空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体)，是晶体结构的最小单位.7、核磁共振现象(nuclear magnetic resonance ，NMR)--指核磁矩不为零的核,在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting），共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency，RF)的物理过程.8、化学势（位）移( )—-在有机化合物中,各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置)共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移,这种现象称为化学位移。
9、耦合常数（J)——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离.用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz.10、蛋白质组（proteome）--一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。
蛋白质分子生物学复习重点
蛋白质分子生物学复习重点一.什么是蛋白质的化学修饰？影响蛋白质化学修饰反应性的因素有哪些？答:从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为蛋白质的化学修饰。
影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。
蛋白质功能基反应性的影响因素:1.微区的极性，2.氢键效应，3.静电效应，4.空间障碍(位阻效应)；此外，其它因素也能改变蛋白质功能基反应性，如电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度等。
蛋白质功能基的超反应性：超反应性是指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。
影响因素：1.改变蛋白质功能基的pK a值；2.蛋白质功能基具有较大的亲核性；3.通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的取向；4.试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性；5.试剂的结合。
修饰剂反应性的决定因素:1.选择性吸附，2.静电相互作用，3.位阻因素，4.催化因素，5.局部环境的极性。
二.蛋白质有哪些侧链可被化学修饰？答：蛋白质侧链的修饰主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的，其重要作用是用于探测活性部位的结构。
在20种常见AA残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。
1.巯基的化学修饰：常用的修饰剂有：烷基化试剂特别是碘乙酸和碘乙酰胺是很重要的-SH 修饰剂；N-乙基马来酰亚胺的修饰反应具较强的专一性，与SH形成对酸稳定的衍生物；有机汞试剂是最早使用的-SH修饰剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸；-SH的氧化也是一种专一性很高的化学修饰手段，H2O2一般用于氧化-SH形成-S-S-或在较大量时形成磺酸，也可以生成次磺酸；5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB), 又称Ellman试剂，目前已成为最常用的巯基修饰剂。
2.氨基的化学修饰：氨基的修饰可分为三类：引入正电荷的修饰；电荷消失的修饰；引入负电荷的修饰。
蛋白质工程详细介绍蛋白质工程的方法和应用
蛋白质工程详细介绍蛋白质工程的方法和应用蛋白质工程详细介绍蛋白质工程是一种利用分子生物学和蛋白质化学的方法，对蛋白质进行定向的修饰和改造，以获得理想的蛋白质产物。
它的发展为生物药物研发和产业化提供了重要的技术支持，也为基因工程、农业生物技术等领域的发展带来了巨大的机遇。
本文将详细介绍蛋白质工程的方法和应用。
一、蛋白质工程的方法蛋白质工程的方法包括：1. 重组蛋白质表达系统：通过将目标蛋白质基因导入到适当的宿主细胞中，利用细胞的代谢途径合成目标蛋白质。
2. DNA重组技术：改变目标蛋白质的基因序列，以改变其结构和功能。
3. 非天然氨基酸插入：在蛋白质序列中插入非天然的氨基酸，改变蛋白质的性质。
4. 点突变：通过改变蛋白质特定氨基酸的编码，改变蛋白质的结构和功能。
5. 蛋白质折叠机理研究：通过研究蛋白质的二级、三级结构以及其折叠机理，为蛋白质工程提供理论基础。
二、蛋白质工程的应用蛋白质工程在许多领域有着广泛的应用，下面将介绍其中几个主要方面。
1. 生物药物蛋白质工程为生物药物的研发和产业化提供了关键技术。
通过工程改造，可以改善生物药物的稳定性、生物活性和药效持续时间等性质，提高其疗效和安全性。
蛋白质工程还可以生产重组蛋白、抗体和疫苗等生物药物，为疾病治疗提供新的手段。
2. 农业生物技术蛋白质工程在农业生物技术领域的应用主要包括转基因植物和转基因动物的产生。
通过引入外源基因，可以使植物和动物表达陌生蛋白，以改善农业产量、品质和抗逆性等特性。
蛋白质工程还可以改善植物和动物的饲料价值，提高畜禽养殖的效益。
3. 工业酶蛋白质工程在酶工业生产中有着重要的应用。
通过工程修饰，可以提高酶的催化效率、热稳定性和耐受性，从而降低生产成本，提高工业酶的使用效果。
蛋白质工程还可以创造新的工业酶，满足不同生产过程中对酶的需求。
4. 蛋白质结构与功能研究蛋白质工程在研究蛋白质结构和功能方面起到至关重要的作用。
通过蛋白质工程技术，可以合成具有特定功能的人工蛋白，深入研究蛋白质的结构与功能之间的关系。
蛋白质工程发展历史
蛋白质工程发展历史
蛋白质是生物体中非常重要的大分子有机化合物，在生物体内扮演着重要的结构和功
能角色，包括代谢调节、信号传递、酶催化等。
为解决一些蛋白质不足或缺陷相关问题，
人们开始研究和开发蛋白质工程技术。
本文将介绍蛋白质工程的发展历史。
20世纪50年代初，科学家已经开始研究利用化学手段进行蛋白质修饰。
当时，最先
成功地利用化学方法改变蛋白质的性质的是脂肪酸化修饰。
随着分子生物学和基因工程技
术的快速发展，蛋白质工程得以迅速发展。
20世纪70年代初期，Sanger发明了脱氧核糖核酸（DNA）测序技术，从而奠定了修改蛋白质序列的基础。
1974年，首次有人利用基因技术制备人类胰岛素，打响了蛋白质工程的第一枪。
20世纪80年代，利用蛋白质表达系统制备外源性蛋白质成为可能。
1982年，著名科
学家Kary Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，可以在较短的时间内扩增基因，为蛋白质工程的研究提供了更多的手段。
20世纪90年代，蛋白质结构研究取得了令人瞩目的成果，Nobel化学奖授予了在蛋白质工程方面做出杰出贡献的三位科学家。
同时，克隆技术和蛋白质化学修饰技术不断提高，蛋白质工程研究进一步深入。
此外，新技术和新材料的不断涌现，比如蛋白质芯片技术、
毒蛋白质脱毒技术等。
21世纪发展至今，随着生物技术、高通量技术的快速发展，蛋白质工程技术也越来越成熟。
蛋白质改造、修饰和设计的技术仍然处于快速发展状态。
蛋白质分子设计
蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。
虽然经过漫长岁月的进化，自然界已经筛选出了数量众多、种类各异的蛋白质，但天然蛋白质只是在自然条件下才能起到最佳功能，在人造条件下往往就不行，例如工业生产中常见的高温高压条件。
因而需要对蛋白质进行改造，使其能够在特定条件下起到特定的功能。
蛋白质的分子设计又可按照改造部位的多寡分为三类：第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装；第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质（de novo design）。
有关全新蛋白质设计的内容请参见文献，本文不赘述。
常见的蛋白质工程改造包括提高蛋白的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系研究等。
由于对蛋白质结构-功能关系的了解不够深入，成功的实例还不很多，因此更需要在蛋白质分子设计的方法学上开展深入研究。
蛋白质的分子设计可分为两个层次，一种是在已知立体结构基础上所进行的直接将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计工作，另一种是在未知立体结构的情形下借助于一级结构的序列信息及生物化学性质所进行的分子设计工作。
此处只探讨第一类分子设计，因为在利用三级结构信息的同时也运用了一级结构序列及有关生化信息，第一类的分子设计工作实际上已包含了第二类工作，而后者实际上是在不得已的情形下所进行的努力。
蛋白质分子设计的过程简单说来就是首先建立所研究对象的结构模型，在此基础上进行结构-功能关系研究，然后提出设计方案，通过实验验证后进一步修正设计，往往需要几次循环才能达到目的。
一般的分子设计工作可以按以下五个步骤进行：（1）建立所研究蛋白质的结构模型，可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。
（2）找出对所要求的性质有重要影响的位置。
同一家族中的蛋白质的序列对比、分析往往是一种有效的途径。
第八讲蛋白质的化学修饰与克隆一
图示—亲和标记
基团专一性 部位专一性
光亲和标记 光亲和试剂
四、蛋白质的PEG修饰
活性不变，但蛋白的理化特性、 稳定性和反应性改变
聚乙二醇修饰（20世纪70年代兴起）
结构
性质
作用——为何修饰？
PEG
环氧乙烷聚合而 成的、两端各有 一个-OH的线性 大分子。
MW: 5百到2万 mPEG:一端甲基
酚羟基3位和5位发生亲电取代，如碘 化、硝化等反应
针对某一侧链 很少具有绝对专一性的试剂
① 羧基的化学修饰 ——烷化、酯化、卤代
碳二亚胺法
R、R’：烷基；HX：卤素、一级或二级胺；
硼氟化三 甲烊盐法
酯化反应
② 氨基的化学修饰 ——酰化和烷化
PITC法
乙酸酐（酰化）
2,4,6-三硝基苯磺酸 二硝基氟苯 碘乙酸 还原烷基化
修饰剂反应性 的决定因素
静电相互作用 位阻因素 催化因素
局部环境的极性
二、蛋白质侧链基团的修饰反应
1、修饰的要求和目的
蛋白质侧链修饰——选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子 侧链上的特定功能基团进行化学反应。
要求——理想情况下，修饰试剂选择性地与特定的残基结合， 很少或几乎不改变分子的构象。
4、蛋白修饰意义（为什么？）
物化性质的改善和生物学特性，（酶—加酶洗衣粉、耐有机溶剂） 解析和理解蛋白质结构和功能的关系，（酶活性中心） 创造新的蛋白质分子。（修饰——新蛋白质分子）
5、蛋白修饰的应用——举例说明
探测蛋白质必需基团的性质和数目 用于蛋白质纯度鉴定——N端分析 用于蛋白质一级结构的测定——Edman降解——自动氨基酸测序 利用亲和标记——探测活性部位局部构象变化 利用交联反应，交联受体或激素——亲和层析 改造蛋白质的性质——PEG修饰
专业基础课-《分子生物学》课程教学大纲(普通班)
《分子生物学》课程教学大纲适用对象：本科药学专业中文班（学分： 3 学时：54 ）一、课程的性质和任务：分子生物学是研究生物基因表达规律、探索生命奥密的一门基础理论科学，也是研究基因的结构和功能的科学，也是高等院校生物学专业必修课程之一，面向生物技术专业和生物科学专业。
本课程应在无机及分析化学、有机化学、生物化学等课程之后开设，同时又是动物生理学、植物生理学、遗传学、细胞生物学、微生物学等课程的专业基础课。
分子生物学是生物学科发展最快的学科，在推动二十一世纪生物技术产业的崛起、推动国民经济持续高速发展等方面均有重要的作用。
通过对本课程的学习，使学生掌握分子生物学的发展史及研究内容；DNA的结构和功能；基因组的特点及其研究方法；DNA的复制和损伤的修复；RNA的生物合成和剪接加工；蛋白质的生物合成；分子生物学的基本研究方法和技术手段；原核生物和真核生物基因表达的调控的等内容。
理论教学36学时，实验教学18学时。
通过本课程学习，使学生掌握分子生物学的基本原理和实验技能，具备从事与分子生物学相关学科的科研工作的初步能力，并为后续课程的学习打好坚实的基础。
二、教学内容和要求（含每章教学目的、基本教学内容和教学要求）：第一章绪论【教学基本要求】掌握分子生物学的概念和研究范畴，熟悉分子生物学的发展历史。
【教学具体内容】一、分子生物学的概念二、分子生物学研究的内容基因与基因组的结构与功能；DNA的生物合成、修复和重组；RNA的生物合成和转录产物的加工；蛋白质的生物合成；基因表达的调控；穿插介绍相关的研究技术。
三、分子生物学的发展和展望人类对DNA和遗传信息传递的认识阶段；重组DNA技术的建立、发展和应用；结构基因学和功能基因学的发展现状和发展趋势。
第二章染色体与DNA【教学基本要求】掌握DNA的一二三级结构、性质和功能；熟悉原核生物和真核生物基因组的特点，掌握DNA复制过程及DNA变性复性等概念及影响因素。
【教学具体内容】第一节染色体和DNA的结构一、DNA的一级结构：是指4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了DNA分子的化学构成。
蛋白质的修饰和表达
定向进化的应用
目标酶
所需功能
方法
结果
实施菌种
卡那霉素核苷基 转移酶
枯草杆菌蛋白酶
β-内酰胺酶 对硝基苯酯酶
胸苷激酶 β-半乳糖苷酶 砷酸脱毒途径
热稳定性
作用于有机溶 剂
作用于新底物
有机溶剂中的 底物特异性和
活性 第五特异性 基
因理疗 底物特异性
砷酸抗性
定位诱变+选择 易错PCR+选择
DNA改组+选择 易错PCR+重组
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反响条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件
• 2、pH值得变化：决定了具有潜在反响能力 的基团所处的可反响和不可反响的离子状 态。
• 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，
但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
•
• 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个 人造〔或化学修饰〕的多肽相缔合
Amps
Tetr
Tetr
Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，到达有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
5’ 3’
5’
3’ 3’
• 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反响可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。
• α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
蛋白质工程技术在生物医学领域中的应用
蛋白质工程技术在生物医学领域中的应用蛋白质工程技术是一个综合性学科，其中涉及了生物学、化学、生物化学、微生物学、分子生物学、遗传学等多个学科。
在现代医学领域，蛋白质工程技术得到了广泛的应用。
本文将介绍蛋白质工程技术在生物医学领域中的应用及其意义。
一、蛋白质工程技术是什么？蛋白质工程技术是指利用分子生物学、生物化学和化学等多学科手段对蛋白质进行改造，以实现特定功能和性质的调节。
主要包括四个方面：蛋白质纯化技术、高效表达技术、野生型蛋白质突变优化技术、蛋白质异构化分析技术。
通过蛋白质工程技术，科学家们可以对蛋白质的构造和功能进行改造，不仅有助于揭示蛋白质的基本工作原理，而且能够使其具备针对性的生物活性和生物学功能。
因此，蛋白质工程技术被广泛应用于医学、化学、农业、环境等多个领域。
二、蛋白质工程技术在生物医学领域中的应用1. 制药行业在制药行业中，蛋白质工程技术被广泛应用于新药的研发。
蛋白质药物是制药业的一个新兴领域，其主要作用是通过特异性的蛋白质-蛋白质和蛋白质-小分子相互作用，精准地治疗疾病。
目前，蛋白质药物已经成为临床上很多疾病的重要药物，并被证明具有高效、低毒性和良好的安全性。
蛋白质工程技术可以使得蛋白质药物具有更优的药物特性，如生物合成、结构稳定性、收缩时间等。
例如，利用蛋白质工程技术，可以改变蛋白质的结构、合成结构稳定性和药物的半衰期，从而使药物在体内的表现更好、更长，并且可以降低药物的不良反应。
此外，蛋白质工程技术还可以通过修饰蛋白质表面Leu，Phe、Tyr、Met、Ser、Thr等位点，提高药物的识别特异性、抗原性和亲和性，从而提高药效和治疗效果。
2. 诊断工具在医疗领域，蛋白质工程技术也能为临床诊断提供强有力的支持。
比如，将注射用标记物与特定的蛋白质分子结合，可以在生物体内实现对癌症和病原体的诊断，同时使得药物进入组织成像更加的准确和高效。
目前，有一种叫做ELISA（酶联免疫吸附测定法）的诊断方法，利用蛋白质工程技术将恶性肿瘤标志物和其他蛋白质纳米粒子结合，可以快速和准确地检测特定的血液总蛋白质通过标识癌症的存在。
化学修饰技术在生物学研究中的应用
化学修饰技术在生物学研究中的应用近年来，化学修饰技术在生物学研究中越来越受到关注。
这种技术通过改变分子的化学性质，实现对生物分子的特定修饰，从而探究生命科学中复杂的生物分子之间的关系，以及分子在生理和病理过程中的作用。
本文将重点介绍化学修饰技术在生物学研究中的应用。
一、化学修饰技术的种类当前，常用的化学修饰技术主要包括蛋白质修饰、核酸修饰和糖基化修饰等。
蛋白质修饰主要包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等，这些修饰可以调控蛋白质的生物活性和稳定性。
核酸修饰主要包括转录后修饰、一碳代谢等，这些修改可以调控DNA和RNA的结构和功能。
糖基化修饰涉及到复杂的糖骨架，可以起到保护、刺激和信号传递等作用。
二、化学修饰技术在生物分子研究中的应用1.蛋白质修饰蛋白质磷酸化是生物学研究中常用的化学修饰技术之一。
磷酸化的靶点蛋白质可以被各种激酶和磷酸酶修饰，从而调控它们的结构和功能。
例如，在神经元中，磷酸化会调控离子通道的电生理性质，影响神经元的兴奋状态。
磷酸化还能调控DNA复制、细胞分裂和分化等过程，因此，在分子生物学和生物医学研究中广泛应用。
2.核酸修饰核酸修饰是指对DNA和RNA的特定修饰，可以调控其结构、功能和稳定性。
比如，mRNA上的转录后修饰可以影响RNA剪接、翻译效率和RNA降解速率，从而调控基因表达。
此外，核酸修饰还可以用于特定细胞类型和组织的基因特异性表达、分子诊断等。
3.糖基化修饰糖基化修饰是指糖骨架上的各种化学修饰，包括糖醛酸、硫酸基等。
这些修饰可以调控细胞表面分子的结构和功能，从而影响它们的细胞间相互作用、信号传递和免疫反应等。
例如，糖基化修饰可以使病原体感染人体细胞，也可以调节生长因子受体的活性，从而影响细胞增殖和分化。
三、化学修饰技术的优势化学修饰技术优势在于它们能够通过改变生物分子的结构和活性，解决生命科学研究中的一些技术难题。
例如，在研究细胞信号转导时，有时需要人工合成蛋白质磷酸化产物来探究磷酸化酶和底物的相互作用。
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人工重组白细胞介素-2（rhIL-2）利用PEG5000修饰后， 使其由疏水性变成亲水性，体内半衰期显著延长，在HIV 感染患者可每周一次给药。 腺苷脱氢酶（ADA）经PEG修饰后该酶可在血液中存留 1~2周，抗原反应降低，而未修饰的ADA进入血液后数分 钟内即被肝脏清除。 ADAGEN用于缺失ADA（腺苷脱氢 酶 ）而引起的严重联合免疫缺陷病（SCID） r-水蛭素 消除半衰期仅为50~100分钟，但制成的2：1的 聚乙二醇重组水蛭素结合物（PEG-hirudin）单剂iv后 T1/2a为1~3 h，T1/2 B延长至12小时，有希望成为1日1次 给药的长效抗凝抗栓药物。
PEG修饰小分子有机药物
近年来,采用PEG修饰技术的小分子药物主要有: 紫杉醇、喜树碱、阿霉素、阿糖胞昔、鬼臼毒素 等。 小分子药物进行PEG修饰后,能够显著改善难溶药 物的水溶性,如PEG紫杉醇; 改善药动学参数,如PEG - 阿霉素、PEG阿糖胞昔。
蛋白药物的聚乙二醇修饰途径
氨基修饰 羧基修饰 巯基修饰 其它：
剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯 合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中 除去。此时，酶往往成为无活性状态。
c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，
酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过 金属离子置换后的酶。
共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过 共价键连接于蛋白质分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或 消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶 在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶 活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到 原有酶活力的5.1倍
常见基团的化学修饰反应：巯基
常见基团的化学修饰反应：氨基
非质子化的赖氨酸的ε epsilon-氨基是蛋白 质分子中亲核反应活性很高的基团。 利用三硝基苯磺酸（TNBS）等进行氨基的 烷基化是一种重要的赖氨酸修饰方法。 利用氰酸盐使氨基甲氨酰化是另一种重要 的赖氨酸修饰方法。
大分子修饰(共价)的过程
修饰剂的选择：采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙 二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、 环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据蛋白 质的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。 修饰剂的活化：修饰剂在使用之前一般需要经过活化，然后 才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。
第三章
蛋白质结构改造
主要内容
第一节 蛋白质分子设计 第二节 蛋白质的化学修饰 第三节 蛋白质的分子生物学改造
第二节 蛋白质的化学修饰
1、定义 2、蛋白质化学修饰的基本要求和条件
3、蛋白质化学修饰的主要方法
1 什么是蛋白质的化学修饰？
通过各种方法使蛋白质分子的结构发生某些 改变，从而改变蛋白质的某些特性和功能的 技术过程称为蛋白质的化学修饰。
活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、 亚基数等。
蛋白质分子修饰的条件
修饰反应尽可能在蛋白质/酶稳定条件下进行，并尽 量不破坏蛋白质/酶活性功能的必需基团，使修饰率 高，同时酶的活力回收高。
（1）pH与离子强度
pH决定了蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它 们的解离状态不同，反应性能也不同。 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一 性的修饰反应。
Amgen公司开发SD/01就是用PEG修饰的粒细胞集 落刺激因子G-CSF，是G-CSF的长效型。而G-CSF 的99年销售额是12.2亿美元，2000年是12.6亿美元。
肽类化合物PEG修饰
PEG修饰脂质体
已批准PEG修饰的阿霉素脂质体(
PLD)用于治 疗Kaposi’s肉瘤和早期的卵巢癌。 PLD改变了脂质体的药代动力学和药效学性质, T1 /2从不超过7h延长至45h,药物到达肿瘤前有 极少的药物泄漏进入体循环。
若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有
的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或 者增加酶的稳定性。
金属离子置换修饰的过程
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，
获得具有一定纯度的酶液。
b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合
在体外将蛋白质分子通过人工的方法与一些化学 基团（物质），特别是具有生物相容性的物质， 进行共价连接，从而改变蛋白质的结构和性质。
蛋白质修饰后的性质变化:
医药领域,工业酶领域
热稳定性：热稳定性可能获得较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除蛋白质药物的
抗原性上效果比较明显。
如控制pH实现mPEG选择性修饰蛋白质中的组
氨酸侧链的咪唑基团； 用谷氨酰胺转氨酶将mPEG - NH2转移到蛋白 质的谷氨酸侧链上,实现对谷氨酰胺的选择性修 饰
(3) 蛋白质侧链基团的化学修饰
采用化学方法使蛋白的侧链基团 发生改变，从而改变蛋白/酶分 子的特性和功能的修饰方法。 蛋白的侧链基团是指组成蛋白质 的氨基酸残基上的功能团。主要 包括氨基、羧基、巯基、胍基、 酚基等。这些基团对酶蛋白空间 结构的形成和稳定有重要作用。 侧链基团一旦改变将引起酶蛋白究。
修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的蛋 白溶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下 反应一段时间。 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰 度的蛋白质分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰蛋 白质。
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水 溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并 可消除蛋白质的抗原性，使其末端活化后可以与 蛋白质产生交联，因而，它被广泛用于蛋白质的 修饰。
组织型纤溶酶原激活物 尿激酶 链激酶 葡激酶 弹性蛋白酶 蝮蛇抗栓酶 超氧化物歧化酶 L-天冬酰胺酶 无基质牛血红蛋白 牛血清白蛋白 白细胞介素-2 肿瘤坏死因子- 抗肿瘤抗体 β-葡糖苷酸酶抗体等 通过与PEG形成结合物后其药动学和药效学性质均大大 改善。
Schering-Plough公司的PEG-Intron，于2001年1月22日 由FDA批准上市。这种重组干扰素α-2b与一个12,000 dalton PEG分子连接，使其抗病毒活性和消除半衰期之间 达到最佳平衡。
各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定
的抵抗能力，从而提高其稳定性。
半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于蛋白质药物分
子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了 在体内的半衰期。
最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种
变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理 环境，在临床应用上有较大意义。
药物PEG修饰的研究及应用进展
PEG修饰蛋白药物
自1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物被 FDA 批准上市后,近几年上市的产品有PEG - 干扰素、PEG - 生长抑素等。 目前,尚有几十种的PEG修饰的蛋白药物处 于研究或临床试验阶段。
Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修
饰后，Km值变大。
2 蛋白质化学修饰的基本要求和条件
对蛋白质分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应 条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。
（1）蛋白质的稳定性
热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。
（2）蛋白质/酶活性中心的状况
α -淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，
过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子 （Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)
若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。
如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分 恢复。
催化活性/非催化活性基团的修饰
对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对 特殊底物的束缚能力。 经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp 对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现 氨基酸的取代。
常见基团的化学修饰反应：巯基
金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。
(2) 蛋白质的大分子修饰
非共价修饰
使用能与蛋白质非共价地相互作用而又能有效地保护酶 的一些添加物，如聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷等，它们既 能通过氢键固定在蛋白质分子表面，也能通过氢键有效 地与外部水相连，从而保护蛋白质的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能 通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时， 其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力， 其稳定性也就增加了。