表达载体的构建方法及步骤
载体构建基本步骤
载体构建基本步骤
载体构建基本步骤
1.选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增
2.对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%）,若检测结果正确，测
序结果之后进行胶回收目的片段
3.通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体（PMD-18T）
4.转化DH5α，根据载体抗性涂板37度过夜培养
5.挑取阳性克隆进行PCR验证，PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并
提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序
6.测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段
7.对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段
8.将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化DH5
α，涂板37度过夜
9.挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕。
毕赤酵母表达蛋白步骤
毕赤酵母表达蛋白步骤一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白质的表达和生物技术研究中。
其优势包括高表达水平、易于培养和操作、能够正确折叠复杂蛋白等。
本文将介绍毕赤酵母表达蛋白的步骤。
二、构建表达载体毕赤酵母表达系统的关键是表达载体的构建。
首先，需要选择适合的表达载体，常用的有pPIC6、pPICZα等。
然后，在载体上选择合适的启动子和信号序列，以确保蛋白质能够被正确表达和分泌。
同时，还需要在表达载体上加入选择标记，如His标签、FLAG标签等，以便后续的蛋白质纯化和检测。
三、转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化入毕赤酵母中，使其成为表达宿主。
转化方法包括电击转化、化学转化等。
其中，电击转化是常用的方法，通过电击脉冲使毕赤酵母细胞膜发生破裂，使表达载体进入细胞内。
转化后，将细胞培养在选择性培养基上，筛选出带有表达载体的毕赤酵母克隆。
四、表达蛋白经过转化筛选后，得到含有目标蛋白表达载体的毕赤酵母克隆。
接下来，需要将克隆进行培养，在适当的条件下诱导蛋白的表达。
常用的诱导剂包括甲醇、巯基乙醇等，通过加入适量的诱导剂，可以使目标蛋白得到高效表达。
五、蛋白纯化在蛋白表达后，需要进行蛋白纯化，以获得纯度较高的目标蛋白。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
在选择纯化方法时，需要根据目标蛋白的性质和需求进行合理选择。
同时，可以利用加入的选择标记，如His标签，通过亲和层析纯化进行快速高效的纯化。
六、蛋白鉴定和功能分析蛋白纯化后，需要进行蛋白的鉴定和功能分析。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blot等，可以确定蛋白的分子量和纯度。
功能分析则可以通过生物学实验来进行，如酶活测定、结合实验等，以验证目标蛋白的功能。
七、应用和展望毕赤酵母表达系统在生物技术和蛋白质研究领域有着广泛的应用。
通过该系统，可以高效表达各种蛋白，包括抗体、酶和重组蛋白等。
载体构建介绍说明
02
载体构建的方法和技术
基因克隆技术
基因克隆技术是载体构建的基础， 通过该技术可以将目的基因从原 始DNA中提取出来，并进行复
制和扩增。
该技术包括限制性核酸内切酶、 DNA连接酶等关键酶的作用， 以及质粒、噬菌体等克隆载体的
应用。
基因克隆技术能够将目的基因高 效地转移到受体细胞中，为后续 的基因表达和功能研究奠定基础。
酶切与连接技术
酶切技术是指利用限制性核酸内切酶对DNA进行切割，得到具有特定黏性末端的片 段。
连接技术则是将两个或多个DNA片段通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成完整 的基因表达载体。
酶切与连接技术是载体构建过程中必不可少的步骤，能够将目的基因与载体进行重 组，从而构建出能够表达目的基因的表达载体。
疫苗研发
载体构建也可用于疫苗研发，通过将 病原体的抗原基因导入细胞或组织， 诱导机体产生免疫反应，从而达到预 防和治疗疾病的目的。
基因编辑领域
CRISPR-Cas系统
载体构建在基因编辑领域中常用于CRISPR-Cas系统的构建和优化，通过将sgRNA和Cas9蛋白导入细胞，实现基 因敲除、敲入和定点突变的精准编辑。
基因治疗应用
载体构建在基因治疗中广泛应用于遗传性疾病、肿瘤、感染性疾 病等的治疗，通过将正常基因导入病变细胞，纠正或补偿缺陷基 因，达到治疗目的。
生物制药领域
药物研发
载体构建在生物制药领域中用于药物 研发，通过将药物基因或调节基因导 入细胞或组织，调控药物的表达和分 泌，提高药物的疗效和降低副作用。
目的基因重组表达载体的构建及在原核上的表达实验报告
目的基因重组表达载体的构建及在原核上的表达实验报告目的基因重组表达载体的构建及在原核上的表达实验报告引言•介绍目的基因重组表达载体的意义和作用•阐述本实验的研究目的和重要性材料和方法1.实验所需材料清单2.载体构建方法的详细步骤3.基因重组方法的详细步骤4.原核表达实验的操作细节5.实验数据的收集和处理方法结果与讨论载体构建•描述目的基因的克隆过程和结果•分析目的基因在载体中的定位和正确性基因重组•阐述基因重组的具体过程和结果•讨论基因重组是否成功，并进行分析和验证原核表达实验•详细描述原核表达实验的步骤和操作细节•提供实验数据的结果和分析•讨论目的基因在原核中的表达情况并与预期进行比较结论•总结实验的目的、方法和结果•分析实验结果的意义和影响•提出未来进一步研究的建议致谢•感谢实验室的支持和帮助•感谢实验过程中的合作伙伴的贡献•感谢本研究所使用的仪器和设备的供应商参考文献•引用实验中使用到的相关文献和资料注意：以上内容仅供参考，具体报告的内容可以根据实验设计和实验数据进行调整和补充。
目的基因重组表达载体的构建及在原核上的表达实验报告引言•采用目的基因重组表达载体的方法可以将特定基因导入到细胞中，并在表达载体的指导下进行高效表达，从而实现研究目的。
•本实验旨在构建一种能够在原核中高效表达目的基因的表达载体，并在原核表达系统中进行实验验证。
材料和方法1.实验所需材料清单：•目的基因序列•原核表达载体•适当的限制酶•购买的DNA分析和纯化试剂盒等2.载体构建方法的详细步骤：•参考文献方法进行载体构建•分别提取目的基因和载体的DNA•利用限制酶切将目的基因插入载体中•进行连接酶切和连接反应•进行DNA纯化和质检3.基因重组方法的详细步骤：•将重组产物转化到感受态细胞中•进行细胞筛选和鉴定•提取目的基因重组载体并进行测序验证4.原核表达实验的操作细节：•利用适当的方法将目的基因重组载体导入感受态细胞中•在适当培养基中培养并加入相关诱导剂•收集样本并进行目的基因的表达检测5.实验数据的收集和处理方法：•记录实验过程中的观察结果•进行数据统计和分析•制作图表和图示以展示实验结果结果与讨论载体构建•成功构建出目的基因重组载体，经测序验证其准确性和完整性。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。
7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。
本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。
质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。
在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。
2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。
在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。
3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。
常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。
PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。
在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。
常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。
连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。
2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。
3.连接酶在37℃下反应数小时。
4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。
转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。
转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。
常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
抗体表达细胞株构建
抗体表达细胞株构建抗体是一种免疫球蛋白，能够识别并与体内的抗原结合，从而发挥免疫防御功能。
在现代生物医学研究中，抗体经常被用于检测、诊断和治疗。
抗体表达细胞株是一种常见的方法，能够大量生产具有特定免疫活性的抗体。
1. 构建抗体表达载体构建抗体表达细胞株的第一步是构建含有抗体基因的表达载体。
一般来说，这个过程需要以下步骤：（1）选择适当的表达载体：不同表达载体有不同的优点和缺点，因此需要考虑实验的目的和条件选择适当的表达载体。
例如，pCDNA3.1(+)是一种常用的哺乳动物细胞表达载体，适用于大多数哺乳动物细胞；pET28a(+)是一种常用的大肠杆菌表达载体，适用于大肠杆菌的高效表达。
（2）克隆抗体基因：将用于克隆的抗体基因从源细胞中提取出来，并进行PCR扩增，得到需要的DNA序列。
（3）插入抗体基因：将PCR扩增的抗体基因插入到已选择的表达载体中，通常需要使用酶切或化学方法。
2. 转染抗体表达细胞株转染是将DNA序列引入目标宿主细胞中的一种方法。
一般来说，这个过程需要以下步骤：（1）选择适当的细胞株：根据实验需要选择适当的细胞株，不同细胞株的转染条件有所不同。
（2）制备适当的转染试剂：转染试剂通常用于改变细胞膜的物理和化学性质，以便使DNA进入细胞内。
（3）进行转染：将转染试剂和表达载体混合后，将混合物滴加到细胞培养物中，使DNA进入细胞内。
然后将细胞培养在适当的条件下，在经过一定时间的生长后，检测抗体的表达水平。
3. 优化抗体表达要得到高效的抗体表达，需要对涉及到表达的各个环节进行优化。
（1）优化抗体基因：抗体基因结构的不同会影响抗体的表达，因此可以对抗体基因进行改造，如调整启动子、添加稳定性序列等。
（2）优化细胞株：根据目标抗体性质和实验条件选择合适的细胞株，并对细胞株的生长条件、培养基成分等进行优化。
（3）优化转染条件：选择适当的转染试剂，调整转染的时间、温度、pH等条件，以提高抗体的表达量。
表达质粒的构建方法
表达质粒的构建⽅法1. 表达载体的构建⽅法及步骤2.3. ⼀、载体的选择及如何阅读质粒图谱4. ⽬前，载体主要有病毒和⾮病毒两⼤类,其中质粒DNA 是⼀种新的⾮病毒转基因载体。
5. ⼀个合格质粒的组成要素：6. （1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。
原核⽣物 DNA 分⼦中只有⼀个复制起始点。
⽽7. 真核⽣物 DNA 分⼦有多个复制起始位点。
8. （2）抗⽣素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+9. （3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因⽚段10. （4） P/E 启动⼦/增强⼦11. （5）Terms 终⽌信号12. （6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作⽤13. 选择载体主要依据构建的⽬的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的⽬14. 的是要表达⼀个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
15. 载体选择主要考虑下述3点：16. 【1】构建DNA 重组体的⽬的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
17. 【2】.载体的类型：18. （1）克隆载体的克隆能⼒－据克隆⽚段⼤⼩（⼤选⼤，⼩选⼩）。
如<10kb 选质粒。
19. （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
20. （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动⼦及相应的受体菌，⽤于表达真核蛋⽩质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋⽩质或融合蛋⽩作为相应载体的参考。
21. 【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成⽅向因载体不同⽽异，适应⽬的基因与载体易于链接，不能产⽣阅读框架错位。
22. 综上所述，选⽤质粒（最常⽤）做载体的5点要求：23. （1）选分⼦量⼩的质粒，即⼩载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌⾥⾯拷贝数也多（也有⼤载24. 体）；25. （2）⼀般使⽤松弛型质粒在细菌⾥扩增不受约束，⼀般10个以上的拷贝，⽽严谨型质粒<10个。
基因表达载体构建
谢谢大家！
三 将目的基因导入受体细胞
基因导入受体细胞的标志是什么？
1目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗 传和表达。或目的基因插入细胞染色体上DNA分 子之中，随同受体细胞DNA分子复制、遗传和表 达。
2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部 分，这种现象叫做转化。
2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？ 通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。
（2）启动子——位于编码蛋白质结构基因之首一段殊结 构的DNA片段，RNA聚合酶的识别部位和结合部位。
（3）终止子——位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊 结构的DNA片段，具有终止基因转录过程的作用。
（4）复制原点——能够自我复制保证目的基因在受体细 胞中复制遗传和表达。
（5）遗传标记基因——检测受体细胞中是否含有目的基 因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
宫或输卵管发育成具备新性状的动物。 2 实例
世界上第一例体型比普通小鼠大1.8 倍的转 基因“超级小鼠”就是用显微注射技术获得成
（三） 将目的基因导入微生物细胞
目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是：
1 用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能 够 吸收环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称 为感受态细胞。 2 用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基 因——质粒重组DNA分子。 3 将基因——质粒重组DNA分子与感受态细胞 混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重 组DNA分子，完成转化过程。
请你以质粒作载体构建基因表达载体之模式图
启动子Leabharlann 插入目的基因基因基因表表达达载载体体
终止子
复制原点
遗传标记基因
4 建构基因表达载体方法
（1）用某种限制酶如EcoRI限制酶，在基因插 入位点切割质粒，使质粒出现一个切口， 露出两个黏性末端。
载体构建实验报告模板
载体构建实验报告模板实验目的本实验旨在探究不同载体构建的效果，并评估其在基因转染中的表现。
实验原理1. 载体构建：选择合适的载体，将目标基因序列插入载体中，然后经过酶切和连接等步骤构建完整的载体。
2. 细胞培养：选择适合的细胞系，进行细胞培养，使其处于最佳的生长状态。
3. 基因转染：将构建好的载体转染至目标细胞，使目标细胞表达目标基因。
实验步骤1. 载体构建- 根据实验需要，选择适合的载体。
常用的载体有质粒、病毒等。
- 执行酶切。
将载体和目标基因进行相应的酶切，并进行凝胶电泳以确认切割效果。
- 进行连接。
将切割好的载体与目标基因连接，生成完整的载体。
- 进行质粒提取，获取纯化后的载体。
2. 细胞培养- 根据实验需要，选择合适的细胞系进行培养。
常用的细胞系有HEK293、CHO等。
- 预处理培养皿。
将培养皿用70%乙醇消毒后，进行干燥。
- 细胞解冻。
取出冻存的细胞，放置在37摄氏度恒温培养箱中，使其迅速解冻。
- 细胞培养。
将解冻后的细胞转移到预处理的培养皿中，加入合适的培养基，使其在恒温培养箱中继续培养。
3. 基因转染- 收集细胞。
在细胞密度达到一定程度后，停止细胞培养，收集细胞供后续转染使用。
- 转染操作。
根据实验要求，选择不同的转染方法，如细胞破裂法、化学转染法等。
- 转染后处理。
转染一定时间后，根据实验需要，对细胞进行相关的处理，如加入抗生素筛选等。
- 观察结果。
根据实验设计，选取适当的时间点，观察目标基因的表达情况。
实验结果与分析1. 载体构建结果- 根据酶切和凝胶电泳结果，确认目标基因成功插入载体中。
- 质粒提取结果良好，获得了纯化的载体。
2. 基因转染结果- 观察细胞形态，发现转染后的细胞形态与未转染的细胞有所不同。
- 进行目标基因表达定量分析，发现转染组的表达量明显高于对照组。
- 进行功能性实验，如细胞增殖、凋亡等，发现转染组在某些方面与对照组有明显的差异。
实验总结通过本实验，我们成功构建了目标基因载体，并将其转染至细胞中。
shrna表达载体构建原则
shrna表达载体构建原则概述shrna（short hairpin RNA）是一种具有干扰RNA（RNAi）功能的小分子RNA，通过与靶标mRNA相结合，诱导靶标基因的沉默。
构建有效的shrna表达载体是进行RNAi实验的关键一步。
本文将从选择shrna靶序列、设计shrna引物和构建shrna表达载体等方面介绍shrna表达载体构建的原则和方法。
选择shrna靶序列选择合适的靶序列是构建shrna表达载体的第一步。
靶序列应具有高度特异性，只对目标基因进行干扰，而不影响其他基因的表达。
为了确保选择的靶序列具有高特异性，可以借助多种在线数据库和软件工具，如NCBI、Ensembl和RNAi设计工具等。
此外，还需考虑靶序列的长度、GC含量和可靶序列的二级结构等因素，以提高shrna的稳定性和特异性。
设计shrna引物shrna引物是用于合成shrna的DNA序列，由sense链和antisense链组成。
shrna引物的设计应遵循一定的原则。
首先，引物的长度通常为19-21个碱基，不宜过长或过短。
其次，引物两端应含有适当的限制性内切酶切位点，以方便将其插入表达载体中。
此外，引物两端还应包含一定长度的串联环序列，以形成shrna的特殊结构。
最后，为了提高shrna的稳定性和特异性，引物的GC 含量应在40%-60%之间。
构建shrna表达载体构建shrna表达载体主要包括插入shrna引物、验证插入序列和筛选正向克隆等步骤。
首先，将设计好的shrna引物插入到适当的表达载体中，常用的载体有pLKO.1和pGIPZ等。
插入shrna引物后，通过限制性内切酶切和测序等方法验证插入序列的正确性。
最后，通过转染、筛选和扩增等步骤，得到正向克隆用于进一步的RNAi 实验。
总结构建shrna表达载体是进行RNAi实验的关键一步。
在选择shrna 靶序列时，应考虑靶序列的特异性和稳定性。
在设计shrna引物时，应注意引物的长度、限制性内切酶切位点和GC含量。
载体构建方法
载体构建方法
载体构建方法是指通过合适的技术手段，创建出用于携带DNA等遗传物质的载体。
常见的载体包括质粒、噬菌体、大肠杆菌、酵母等微生物，以及病毒等。
以下是一些常用的载体构建方法：
1. 质粒构建方法：质粒是一种环状DNA分子，可用于携带外源DNA。
通常采用PCR扩增和限制性酶切等技术将外源DNA插入到质粒中，然后转化到宿主细胞中。
2. 噬菌体构建方法：噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。
常用的噬菌体构建方法包括重组噬菌体技术和噬菌体展示技术等。
3. 大肠杆菌构建方法：大肠杆菌是一种常见的细菌，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。
常用的大肠杆菌构建方法包括转化、电转化、化学转化等。
4. 酵母构建方法：酵母是一种单细胞真核生物，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。
常用的酵母构建方法包括转化、电转化、融合等。
5. 病毒构建方法：病毒是一种寄生于细胞的微生物，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。
常用的病毒构建方法包括重组病毒技术、腺病毒技术、AAV技术等。
以上是一些常见的载体构建方法，不同的载体构建方法适用于不同的实验需求。
在选择合适的载体构建方法时，需要考虑到载体的稳定性、转化效率、表达效率等因素。
基因工程-基因表达载体构建(2)
（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 DNA分子杂交 方法，用 DNA与RNA杂交 方法检测目的基因是否转录，用 免疫（ 抗原抗体反应 ）法检测目的基因是否表达。另外也 让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。 可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因 DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱 ；
（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞 受精卵 等。动物常把 细胞作为受体细胞。导入植物细胞的 方法有 等；农杆菌转化 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 染色体DNA 法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的 显微注射法 上，导入动物细胞的方法有 ；如果运载体是质 CaCl2 处理，以增大细菌 细胞壁 粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用 的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的 基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制， 由于 细菌繁殖的速度非常 ，在很短的时间内就能够获 快 得大量的目的基因。
途径 方法
供体细胞中的DNA 中直接分离基因 鸟枪法
供体细胞中的DNA ↓限制酶 许多DNA片段 ↓载入 运载体 ↓导入 受体细胞 ↓ 外源DNA扩增, 产生特定性状 ↓分离 目的基因
人工合成基因（真核细胞） 反转录法
目的基因mRNA ↓反转录 单链DNA ↓合成 双链DNA(即目的基因)
根据已知氨基酸 序列合成DNA
氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则
转基因表达成功的原因是生物 共用一套遗传密码 。 基因工程的意义： 。 目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。
实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺 中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可 想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？
实验十五、、表达载体的构建
在实验过程中，我们对实验条件进行了优化，提高了实验 的效率和成功率，为今后的实验提供了有益的参考。
研究展望
拓展应用领域
未来可以将该表达载体应用于更多的基因治疗和基因功能研究领域， 为相关领域的发展提供有力支持。
改进表达载体
针对本次实验中存在的不足，可以对表达载体进行进一步的优化和 改进，提高其转染效率和稳定性，以适应更多不同类型细胞的需求。
控机制，为基因治疗和基因功能研究提供更加坚实的基础。
03
拓展应用范围
在未来的研究中，可以尝试将该表达载体应用于动物模型和临床试验中，
以验证其在不同生物体内的应用效果和安全性。
THANKS
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表达载体通常由质粒或病毒DNA改造而来，它们能够将外源基因带入宿主细胞，并 在其中进行复制和表达。
通过构建不同的表达载体，科学家们可以实现基因的异源表达、高表达和定向进化 等目的，为生物制药、农业和工业生产等领域提供有力支持。
02
表达载体的基础知
识
表达载体的定义
表达载体是用于在宿主细胞中复制和 表达外源基因的运载体，它能够将目 的基因导入细胞并使其稳定遗传。
实验十五：表达载体 的构建
目录
CONTENTS
• 引言 • 表达载体的基础知识 • 实验材料与方法 • 实验结果与分析 • 结论与展望
01
引言
实验目的
了解表达载体在基因工程中的应 用。
学会设计并构建基因表达载体。
掌握表达载体构建的基本原理。
01
03 02
实验背景
表达载体构建是基因工程中的关键技术之一，它涉及到将目的基因插入到载体DNA 中，以便在宿主细胞中进行表达。
表达载体是基因工程中的重要工具， 它能够将外源基因在宿主细胞中进行 有效表达，产生所需的蛋白质或代谢 产物。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1O 7H2将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。
7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
载体构建 实验教学
载体构建实验教学载体构建一、实验目的本实验旨在通过载体构建的方式，探究基因转染技术对生物体的影响，培养学生的实验操作技能和科学研究能力。
二、实验原理基因转染是将外源DNA导入到细胞内，使其表达外源蛋白质的过程。
常用的转染方法包括化学法、物理法和病毒载体法等。
本实验采用病毒载体法来进行基因转染。
三、实验步骤1. 购买所需材料：含有目标基因的病毒载体、细胞培养液、培养皿等。
2. 培养细胞：将需要转染的细胞放入含有适当营养成分和温度条件下的培养液中进行培养。
3. 病毒感染：将含有目标基因的病毒载体加入到培养皿中，让其与细胞发生感染。
4. 检测表达：观察细胞是否表达了目标蛋白质，可以通过Western blot或ELISA等方法进行检测。
四、注意事项1. 实验过程需在无菌条件下进行。
2. 实验过程中需佩戴手套、口罩等防护用品，避免病毒传播。
3. 实验结束后，要彻底清洁实验台和器材。
实验教学一、前期准备1. 教师应提前准备好所需实验器材和试剂，并检查其完整性和有效期。
2. 教师应向学生介绍实验目的、原理和注意事项，让学生了解实验的意义和重要性。
二、实验操作1. 学生应按照教师的指导，正确操作实验器材和试剂。
2. 学生应注意无菌条件下进行操作，避免污染。
3. 学生应注意个人防护，在进行操作时佩戴手套、口罩等防护用品。
三、数据处理1. 学生应根据实验结果进行数据处理，并绘制相应的图表。
2. 学生应对数据进行分析，总结出结论，并撰写完整的实验报告。
四、问题解答1. 教师可以针对学生在实验中遇到的问题进行解答和指导。
2. 学生可以自主提出问题并向教师请教。
五、安全措施1. 教师应在实验前向学生介绍实验中的安全措施，并强调其重要性。
2. 学生应严格遵守实验中的安全规定，确保自身和他人的安全。
六、实验总结1. 教师应对本次实验进行总结和评价，并给予学生相应的建议。
2. 学生应对本次实验进行总结和反思，发现问题并加以改进。
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表达载体的构建方法及步骤
一、载体的选择及如何阅读质粒图谱
目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：
（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。
而
真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段
（4） P/E 启动子/增强子
（5）Terms 终止信号
（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目
的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：
（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载
体）；
（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。
如何阅读质粒图谱
第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源 DNA 片段。
一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
（1）启动子－促进 DNA 转录的 DNA 序列，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
（2）增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
其作用与增强子所在的位置或方向无关。
即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
/沉默子－负增强子，负调控序列。
（3）核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。
（4）转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点down－stream 有一段GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly（A）加尾信号。
质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上 .根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。
二、目的基因的获得
一般来说，目的基因的获得有三种途径：
调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都很难调取到目的基因。
全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接设计合成目的基因。
此方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。
优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。
三、克隆构建
目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。
下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。
实验材料
实验试剂
试剂名称生产厂家
载体Transheep
大肠杆菌菌株DH5αTiangen
限制性内切酶Fermentas
T4连接酶Fermentas
质粒DNA小,大量抽提试剂盒Axygen
凝胶回收试剂盒Axygen
琼脂糖Biowest
DNA ladder Fermentas
（2）X基因慢病毒载体的构建
X基因基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57中。
PUC57-X基因 EcoRI/BamHI酶切结果：
酶切完成后进行胶回收
2. 载体用双酶切，酶切体系如下。
20ul酶切体系 37度3小时
4ul 载体（500 ng/ul）
1ul BamHI
1ul EcoRI
2ul 10×buffer
12 ul H2O
酶切完成后胶回收（见附录）
处理好的目的片段与载体连接反应体系：
6ul PCR 酶切回收片段（约50ng/ul）
1ul 酶切好的载体（约50ng/ul）
2ul ligase buffer
1ul T4ligase
10ul H2O
以上连接液在16℃过夜。
转化 (感受态细胞: DH5a),具体步骤见附录转化部分。
抗性: Amp; 37℃，培养过夜
转化后X基因分别平板挑菌, 37℃ 250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。
X基因慢病毒载体单克隆菌落PCR鉴定（使用载体通用引物,PCR条带大小应比实际大200bp 左右）：。