化学发光免疫技术

1.1 鲁米诺
H2O2 /OH
—
+N2 + H2O +光 光
HRP
羟基苯乙酸（HPA） 对-羟基苯乙酸（HPA）
HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光 HPA在 存在下被HRP氧化成氧化二聚体（ HRP氧化成氧化二聚体 物质）， 350nm激发光作用下 发出450nm ），在 激发光作用下， 450nm波长 物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长 的荧光，可用荧光光度计测量。 的荧光，可用荧光光度计测量。
TPA TPA Ru( b py ) Ru(bpy)
基态
3+ 3
+●
●
电极
激发态
Ru(bpy) 3
2+ 3
*
不稳定
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光子(620nm)
Байду номын сангаас术要点
1.抗原抗体结合反应 1.抗原抗体结合反应 将已包被了抗体的乳胶微 粒和待测标本加入反应杯中， 粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间 再加入AP标记抗体，温育, AP标记抗体 后,再加入AP标记抗体，温育,形成固相包被抗 体-抗原-酶标抗体复合物 抗原2.分离技术 将复合物转移到玻璃纤维上， 2.分离技术 将复合物转移到玻璃纤维上，用缓 冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体-抗 胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。 原-胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。 3.酶促发光反应 加入4 MUP，酶标抗体上AP AP将 3.酶促发光反应 加入4-MUP，酶标抗体上AP将 MUP分解 形成4 MU，它在360nm 分解， 360nm激发光的照 4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激发光的照 射下，发出448nm的荧光，经荧光仪记录，放大， 448nm的荧光 射下，发出448nm的荧光，经荧光仪记录，放大， 根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量
化学发光剂应符合以下几个条件
①能参与化学发光反应； 能参与化学发光反应； ②与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂； 与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂； ③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； 偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； ④应不改变或极少改变被标记物的理化特性， 应不改变或极少改变被标记物的理化特性， 特别是免疫活性。 特别是免疫活性。
概
念
化学发光免疫技术：集灵敏的化学 化学发光免疫技术： 发光分析和特异的抗原抗体免疫测 定于一体的检测技术。 定于一体的检测技术。 特点： 特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、 特异性高、敏感性高、分离简便、 快速、试剂无毒、安全稳定、 快速、试剂无毒、安全稳定、 可自动化。 可自动化。
化学发光免疫技术的类型
第三节 化学发光免疫测定技术（CLIA） ）
用化学发光剂直接标记抗原或抗体, 一、原理 用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与 待测标本中相应Ab或Ag、磁颗粒性的Ag或Ab反 待测标本中相应Ab或Ag、磁颗粒性的Ag或Ab反 Ab Ag 应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离 通过磁场把结合状态（沉淀部分） 状态的化学发光剂标记物分离开来， 状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入 发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的 发光促进剂进行发光反应， 检测进行定量或定性检测 。 二、技术类型 1.分离方法 1.分离方法 常用磁颗粒分离技术 2.免疫学反应模式 2.免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术 3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶 3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶
萤火虫荧光素 荧光素酶 ATP；O2；Mg2+ ；
光 + AMP+ O2 + CO2 + 氧化萤火虫荧光素
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化学发光 机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能 机制： 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。 化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参 化学发光剂或发光底物： 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。 的化合物。 发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂 发光剂分为荧光素、生物发光剂、 荧光素
分离技术
1.磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒, 1.磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒,与标 磁颗粒分离法 本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过 一定模式的免疫学反应后, 一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合 酶标记物IC和游离酶标记物进行分离的技术。 酶标记物IC和游离酶标记物进行分离的技术。 IC和游离酶标记物进行分离的技术 2.微粒子捕获法：所用颗粒是无磁性微粒子作为 2.微粒子捕获法： 微粒子捕获法 抗体或抗原的包被载体, 抗体或抗原的包被载体, 然后用纤维膜柱子进 行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。 行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。 3.包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成小珠, 3.包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在 包被珠分离法 小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后, 小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将 结合状态和游离状态的酶标记物进行分离. 结合状态和游离状态的酶标记物进行分离.
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1.酶促反应的发光底物 1.酶促反应的发光底物
是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 CLEIA中常用的酶有HRP和 中常用的酶有HRP CLEIA中常用的酶有HRP和AP HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸 HRP的发光底物有鲁米诺、 的发光底物有鲁米诺 AP的发光底物有AMPPD、 MUP（荧光底物） 的发光底物有AMPPD AP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物） 特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物 特点：可作标记物、
第一节 发光与化学发光剂
一种物质由电子激发态回复到基态时， 一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。 释放出的能量表现为光的发射。 1.光照发光: 1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 光照发光 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。 2.生物发光: 2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用 生物发光 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素， ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 产能 复到基态时多余的能量以光子形式放出。 复到基态时多余的能量以光子形式放出。 3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。 3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。 化学发光 化学发光是一个多步骤的过程。 化学发光是一个多步骤的过程。
E E E E
洗涤
E
弃上清
E
E
AMPPD发光
E 碱性磷酸酶 标记抗体 AMPPD 样本 是利用酶对发光底物催化作用而直接发光， 是利用酶对发光底物催化作用而直接发光， 抗体包被 抗原
塑料微珠
通过光强度的测定而直接进行定量。 通过光强度的测定而直接进行定量。
电化学发光原理图
这一过程可在电极表面周而复始地进行 产生许多光子，使光信号增强 产生许多光子，
按发光剂不同分为 1.发光酶免疫测定 发光酶免疫测定（ LEIA） 1.发光酶免疫测定（CLEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.化学发光免疫测定技术 化学发光免疫测定技术(CLIA) 2.化学发光免疫测定技术(CLIA) chemiluminescence immunoassay 3.电化学发光免疫测定技术 电化学发光免疫测定技术( 3.电化学发光免疫测定技术(ECLI) electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分 1.微粒子化学发光免疫测定 1.微粒子化学发光免疫测定 2.磁颗粒化学发光免疫测定 2.磁颗粒化学发光免疫测定
N Ru N N N O O N N O O N
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第二节 发光酶免疫测定（CLEIA） ）
属于酶免疫测定的一种。 一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一 步酶反应所用底物为发光剂， 步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应 发出的光在特定的仪器上进行测定。 发出的光在特定的仪器上进行测定。 二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为： 根据酶促反应底物不同可分为： 1.荧光酶免疫测定技术 1.荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术 根据免疫学反应模式分 1.双抗体夹心法和双抗原夹心法 1.双抗体夹心法和双抗原夹心法 3.固相抗原竞争法 固相抗原竞争法： 3.固相抗原竞争法：
1.4 44-MUP
AP
H3PO4 +
4-MU
360nm 激发光
荧 光
2.直接化学发光剂 2.直接化学发光剂
特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件 特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件 pH 就能发光的物质。反应迅速、背景低、 就能发光的物质。反应迅速、背景低、 信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。 信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。 AE浓度呈线性关系 常用试剂：吖啶酯（ 常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE） ，AE）
CH3 N+ HO 2
CH3
O
N
CH3
C O O
N
O
C O
+ CO2+ 光
O C O O
R
R
3.电化学发光剂 3.电化学发光剂
是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。 光的物质。 特点： 反应在电极进行； 特点：①反应在电极进行； 电子供体为：三丙胺（TPA） ②电子供体为：三丙胺（TPA） 化学发光剂： ③化学发光剂：三联毗啶钌 三联毗啶钌 分子结构图
1.2 HPA
H2O2 HRP
HO