全基因组扩增
孙宝发-使用多重置换扩增(MDA)技术对单细胞基因组进行测序p
单细胞测序与宏基因组的数据相结合，将成为一种将单细 胞测序指导结合多物种的鸟枪测序纳入到单个基因组中的 强大工具。
利用单细胞方法在人类的生物群落中发现新型微生物现 正被一些实验室提出。 对于传染病的研究，它将有可能用 来确定从临床标本中无选择性偏好的培养方法中遗传变异 的病原菌。从单细胞获得的遗传连锁的致病因素和其他基 因与从宏基因组数据获得的全基因组频率相对应。或许， 全环境基因组的方法的可能的最大挑战是巨大的遗传多样 性，即使在相同株的成员间也存在。 到此为止，单细胞测序将对揭示多样性的程度和性质， 种的本质核心或一致基因，自然演变中水平基因转移的作 用，环境因素与多样性关系等方面起重要作用。最后，为 实现更完整的有代表性的基因组的目标，MDA反应酶学的 改进还在继续进行。
Sanger测序：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序 列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一 次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所 有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同 的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需 要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、 T或C处终止。终止点由反应中相应的ddNTP而定。 焦磷酸测序：焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进 行DNA序列分析的技术.在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、 荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP 聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放 和强度,达到实时测定DNA序列的目的.此技术不需要荧光 标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快 速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 鸟枪法测序：将基因组DNA打成小片段进行测序，然后 再将这些小的片段拼接起来，重新组装成一个完整的基因 组。
全基因扩增的引物设计步骤
全基因扩增的引物设计步骤引言全基因扩增（Whole Genome Amplification，WGA）是一种将整个基因组进行扩增的技术，可以从极少量的DNA样本中获得足够的DNA量进行后续实验。
在全基因扩增过程中，引物设计是至关重要的一步，它直接影响扩增效率和特异性。
本文将详细介绍全基因扩增的引物设计步骤。
引物设计步骤1. 确定扩增目标在进行全基因扩增之前，首先需要确定扩增的目标。
可以是整个基因组的扩增，也可以是特定区域的扩增。
根据扩增目标的不同，可以选择不同的引物设计策略。
2. 引物长度选择引物的长度对扩增效率和特异性有重要影响。
通常，引物的长度在18-30个碱基对之间。
较短的引物可以提高扩增效率，但可能会导致非特异性扩增产物的产生；较长的引物可以提高特异性，但可能会降低扩增效率。
3. 引物序列选择引物序列的选择是引物设计中最关键的一步。
以下是引物序列选择的几个要点： - 引物应具有足够的特异性，避免非特异性扩增产物的产生。
可以通过比对基因组数据库或使用引物设计软件来评估引物的特异性。
- 引物的GC含量应适中，一般在40-60%之间。
过高或过低的GC含量可能会影响扩增效率。
- 引物的3’端应尽量避免出现重复序列或富含AT或GC碱基对的序列，以减少扩增的非特异性。
- 引物的3’端还可以加入一些特定的序列，如限制性酶切位点、引物标签等，以方便后续实验操作。
4. 引物的互补性检查在引物设计完成后，需要进行引物的互补性检查。
引物之间的互补性可能会导致二聚体的形成，影响扩增效率和特异性。
可以使用引物设计软件或进行体外实验来检查引物之间的互补性。
5. 引物的合成合成引物时，可以选择商业合成或自行合成。
在合成引物时，需要注意以下几个问题： - 引物的纯度要求较高，以避免污染对扩增结果的影响。
- 引物的浓度要适中，一般在10-100 μM之间。
引物设计实例以下是一个全基因扩增引物设计的实例：1.扩增目标：整个基因组的扩增。
全基因扩增的引物设计步骤
全基因扩增的引物设计步骤全基因扩增是一种常用的基因组测序方法，它可以同时扩增整个基因组或某些特定区域的DNA序列。
在进行全基因扩增前，需要设计适合的引物。
下面将详细介绍全基因扩增的引物设计步骤。
一、确定目标基因组或区域首先需要确定要扩增的目标基因组或区域。
这可以通过文献资料、数据库查询、实验经验等方式获得。
在确定目标基因组或区域时，需要考虑以下几个方面：1. 目标基因组或区域的大小：全基因扩增需要设计一对引物，其长度通常为20-30个碱基对，能够覆盖目标序列的全部或大部分区域。
2. 目标序列的GC含量：GC含量高于50%或低于30%时，引物设计会更具挑战性。
3. 目标序列中是否存在重复序列：重复序列会使得引物无法特异性地结合到目标DNA上，从而导致非特异性扩增。
二、获取参考序列获取参考序列是进行引物设计的关键步骤之一。
常用的参考序列包括已知基因组测序数据、转录本数据和EST（表达顺反转录本）序列。
在获取参考序列时，需要注意以下几个方面：1. 确定参考序列的来源：不同来源的参考序列可能存在差异，需要根据实际情况选择合适的来源。
2. 确定参考序列的版本：同一基因组或转录本可能存在多个版本，需要选择最新、最全面、最准确的版本作为参考序列。
3. 确定参考序列的长度：通常选择包含目标区域或基因组全部或大部分区域的参考序列。
三、引物设计引物设计是全基因扩增中最重要和最复杂的步骤之一。
引物设计需要满足以下几个要求：1. 引物长度：引物长度通常为20-30个碱基对，太短会导致特异性不足，太长则会影响扩增效率。
2. 引物特异性：引物应该特异性地结合到目标DNA上，避免非特异性扩增。
可以通过BLAST等软件进行引物特异性检测。
3. 引物Tm值：引物Tm值应该在50-65℃之间，过高或过低都会影响扩增效率。
4. 引物末端结构：引物末端应该避免出现稳定的二聚体结构或自身互补结构，以免影响扩增效率。
5. 引物位置：引物应该位于目标序列的两端，避免扩增出不必要的片段。
全基因组扩增技术
全基因组扩增技术 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020全基因组扩增(whole?gemomeamplification，WGA)是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。
其基本原理为：采用的多重置换扩增（MDA）技术，能对基因组DNA进行稳定的扩增。
利用随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接下来在高扩增效率和保真性的Phi29?DNA聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。
被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终我们可以获得大量高分子量的DNA。
全基因扩增中使用独特的Phi29DNA聚合酶，该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb的DNA模板而不从模板上解离。
同时这种酶具有3’—5’外切酶活性，可以保证扩增的高保真性。
目前市场上普遍采用Qiagen公司的Repli-gMiniKit系列全基因组试剂盒。
本试剂盒的开发对国内用于全基因扩增领域有着广泛的应用前景。
可以从少量样本中稳定扩增全基因组DNA。
该试剂盒的开发过程包括分离和扩增DNA的试剂，适用的样本广泛，包括已纯化的基因组DNA、全血、组织培养细胞、显微切割得到的细胞、速冻的组织切片、血浆血清中的细胞、口腔细胞、血斑。
具有以下特点：1.产物应用途径广阔PCR（包括多重PCR、长片段PCR以及定量PCR）、克隆、文库构建、单倍型确定、测序、基因芯片、遗传分析（片段差异、微卫星差异、单碱基差异、SNP、STR等）。
2、高产量10ng基因组DNA经扩增后可产生〉15ug（20ul反应体系）的DNA反应产物，扩增倍数可达上万倍。
3、扩增产物长度以及覆盖率有保证这是我们公司全基因组扩增技术（多重置换扩增技术），这不是一个PCR过程。
目前这个技术比较流行，之前的技术已经有些过时。
全基因组扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用
ｍｕ ｉｌ ｄｓｌｃｍ ｎ ａ ｌｉａ ｏ （ Ａ ｏｉ ｔｅｍ ｌ ｍ ｌｉａｏ ｅ ｅ ｐｄｒｐｄｙａ ｄ ｈ ｐ ｌａｉ ｌｐｅ ｉ ａｅ ｅ ｔｍｐｉｃｔ ｎ ＭＤ ）ｆｓ ｈ ｒ ａ ａ ｐｉｃｔｎｄ ｖｌ ｅ ｉ ，ｎ ｅａｐｉ ｔｎｏ ｔ ｐ ｆ ｉ ｏ ｆ ｉ ｏ ａ ｌ ｔ ｃ ｏ ｆ ＭＤ ｒｉ ｐａｔｔ ｎｇｎ ｔ ｉ ｎ ｓ （Ｇ ） ａ ｒｗ ｏｅａ ｄｍ ｒ ｔ ｎｉｎ Ｔ ｉａｔ ｌ ｒｖ ｗ ｅ Ａ ｉ ｐｅｍ ｌｎａ ｏ ｅｅｉ ｄａ ｏｉ Ｐ Ｄ ｈｓ ａ ｎｍ ｒ ｎ ｏｅａｔ ｔ ． ｈｓ ｒｃｅ ｅ ｉ ｓｔ ｎ ｉ ｃ ｇ ｓ ｄ ｅ ｏ ｉ ｅ ｈ
・
综 述 ・
全基 因组扩增技术在植入前遗传 学诊 断中的应用
周 怡 雯综述
【 摘
赵 晓明 审校
要 】 全基 因组扩增技术是一种 对微量 Ｄ Ａ进行均衡扩增 的方法 ． 于各类遗传检测 ． 于 Ｎ 用 对
获取细胞数 目及 Ｄ Ａ量非常有限 的植入前 遗传 学诊 断是 十分可贵 的。该项技术主要包括经热循环扩增 Ｎ 和恒温扩增两类方法 ， 其中恒温扩增的多重置换扩增法为近几年发展起来 的技 术 ， 目前 多重 置换 扩增 法
ｄｉｇ ｓｓ ａ ｎｏ ｉ
（ ｎ ｐｒｄＨｅ ｌ ／ ａ Ｐａ ２ ０ ２ １ ０ １ ３） Ｊｌｔ Ｒｅ ｏ ａｔ Ｆ ｍ ｌｎ， ０ ９， ８： １ ． １ ｈ
全 基 因组 扩 增
（ ｈ ｌ ｅ ｏ ｅａ ｐｉｃｔ ｎ ｗ ｏ ｇｎｍ ｍ ｌ ａｏ ， ｅ ｉ ｆ ｉ
显 得 无力 。一 方 面 单 细胞 Ｄ Ａ检测 的材 料来 源极 Ｎ 其 有 限 ；另 一方 面该 检测 对 时 间 的要 求 非 常高 ， 若
乙型肝炎病毒全基因组PCR扩增产物的直接测序
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔ ｅ Ｔ ｓｂ ｓ ａ ｅ ｏ ｆ ｉ ｃｓｑｅｃ ｇｔ Ｃ ｍ ｌ ｃｔｎｐｏｕｔ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂ ｃ ｖ ｏ ｔ ｌｈ ｔ ｄ ｏ ｄ ｅ ｕｎｉ ｅ Ｒａ ｐｆａｏ ｒ ｃ ｅ ｉ ｅａｉ ｍ ｈ ｒ ｒｔｅ ｎ ｈＰ ｉ ｉ ｉ ｄ ｓ
方法 方法分析 Ｈ Ｖ基 因型和 Ｙ Ｄ变异情况 。结果 Ｂ ＭＤ ２ ０例标 本 中有 １ 扩增 阳性并 得到全 长基 因组 ８例
乙型肝炎 病
序列 ； 真性分析表 明， 保 本法引起的人为核苷酸 突变率约 为 １ 。序 列分 析表 明 ，８例 标本 中有 １ ％； １ ０例
为基因型 Ｂ ８例为基因型 Ｃ； 出现 耐拉 米夫定的 Ｙ Ｄ变异 ， 为基 因型 Ｃ 、 ２例 ＭＤ 均 。结论
毒全基因组 Ｐ Ｒ扩增产物直接测序 ， Ｃ 方法简便 ， 可满足临床和科研的需要 。
【 关键词 】 乙型肝炎病 毒 ；Ｃ Ｐ Ｒ产 物 ； 测序
Ｄｉｅ ｔｓ ｑ ｅ ｃｎ ｆＰ ｒ ｃ ｅ ｕ ｎ ｉ ｇ ｏ ＣＲ ｍ ｐ ｉ ｃ ｔ ｎ ｐ ｏ ｕ ￣ ｏ ｐ ｔ ｓＢ ｉ ｕ ｏ ａ ｌ ａ ｏ ｒｄ ｃ ｉ ｆ ｉ ｆＨｅ ａ ｔ ｖ ｒ ｓ ｃ ｍｐ ｅ ｅ ｇ ｎ ｍｅ Ｃ Ｎ ｉ ｉ ｉ ｌｔ ｅ ｏ ＨＥ Ｗｅ －
２０ Ｏ９年 ２月 第 ３卷 第 ｔ Ｏ／ Ｅｐ 期 ｎＪ ｘ
ｈｅｔ ｉ Ｈｅｒ／ ｉ ｎ ， ¨ａ ２０ ￣ｃＤｓ（ ａ￣ ｃＦ ｔ ）Ｆ ｒ ０９，Ｖ ｌ ，Ｎ ． ｆ Ａｉ ｏ ｄ ｙ ｏ３ ｏ１
乙型肝炎病毒全长基因组的扩增
一
Ｄ Ａ 板 量 对 Ｐ Ｒ扩 增 效 率 的 影 响 。 果 ： Ｎ 模 Ｃ 结 最佳 退 火 温度 为 ６ ％， 佳 引 物 浓 度 为 ０５Ｉ ｏ Ｌ 模 板 量在 １０拷 贝 ８ 最 、ｘ ｌ ， ｍ ／ ５ 以上 能扩 增 出 乙肝 病 毒 全 长基 因 ． 模 板 量 达 到 １ｓ 贝抑 制 扩 增 效 率 。 结 论 ： 火温 度 为 ６ ℃ 、 但 ０拷 退 ８ 引物 浓 度 为 ０５ ．
ｇ ｎｏ ｓ Ｍ ｅｈｏｄ Ｐｒｍｅ ｓ ｗｉｈ ｔ ｅ ｂｎ ｎｇ ｓｔ ｔ５ ｅ ｄ ｏ ｈ ｅ ａ ｉｅ ｓｒ ｄ ｗｅ ｅ ｄ ｓｇ ｅ ｎ ｏ ｅ ｈ ｐ ｔｔｓ Ｂ ｅ ｍｅ ． ｔ ｓ ｉ ｒ ｔ ｈ ｉｄｉ ｉｅ ａ 一 ｎ ｆｔ ｅ ｎ ｇ ｔｖ ｔａｎ ｒ ｅ ｉｎ ｄ ａ ｄ ｗｈ ｌ ｅ ａ ｉｉ ｖｒ ｎ ｍｅ ｒ ｍｐ ｉ ｅ ｓｎ ｎｅ ｓｅｐ ＰＣＲ ． ＰＣＲ ｏ ｄｉｉｎ ｒ ｈ ｎ ｄ ｔ ｃｄｅ ｔｅ ｍｏ ｔａ ｐ ｏ ｉａｅ ｍｅｌｉｇ ｉ ｇｅ ｏ ｓ ｗｅ ｅ ａ ｌｆ ｄ ｕ ｉ ｇ ｏ —ｔ ｕｓ ｉ ｃ ｎ ｔｏ ｓｗｅ ｅ ｃ ａ ｇｅ ｏ ｄｅ ｉ ｈ ｓ ｐ ｒ ｐｒ ｔ ｔｎ ｔｍｐｅａ ｕ ｅａｎ ｈ ｐ ｉ ｌｃ ｃ ｎｒ ｔｏ ｆｔｅ ｐｒｍｅ ｓ Ｉ ｆｕ ｎ ｅ ｏ ｈ ａ ｔｔ ｆｔｍ ｐａ ｅＤＮＡ ｎ ａ ｐｉ ｃ ｔｏ ｅ ｒ ｔ ｒ ｄ ｔ ｅ ｏ ｔｍａ ｏｎ ｅ ｔａ ｉｎ ｏ ｈ ｉ ｒ ． ｎ ｅ ｃ ｆｔ ｅ ｑｕ ｎ ｉ ｏ ｅ ｌｔ ｌ ｙ ｏ ｍ ｌ ａ ｉｎ ｗａｓ ｉ ｆ
Ｉ ｏ／ 、 － ＩＬ 乙肝病毒 Ｄ Ａ模板量在 １０～１ｓ 贝为 乙肝病毒全长基 因扩增的合 适 Ｐ Ｒ反应条件 。 ｔ ｍ Ｎ ５ ０拷 Ｃ 关 键 词 肝 炎病 毒 ， 乙型 基 因组 聚合 酶 链 反 应 退 火 温度 （ｍ 值 ） Ｔ
分子医学中基因组扩增技术的应用研究
分子医学中基因组扩增技术的应用研究随着分子生物学和基因组学的快速发展，基因测序的重要性也越来越受到人们的关注。
在对基因组进行测序时，人们发现有些区域的DNA序列重复出现，而且这些重复序列往往与某些遗传性疾病的发生有密切关系。
因此，研究这些重复序列的特点和功能，对于预防和治疗遗传性疾病具有重要的意义。
分子医学中，基因组扩增技术是一种应用广泛的技术之一。
它可以扩增目标DNA序列，生成大量的DNA片段进行研究。
本文将从以下几个方面介绍基因组扩增技术在分子医学中的应用研究。
一、PCR技术的发展PCR技术是一种重要的基因组扩增技术。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶的扩增作用，将目标区域的DNA序列扩增成为大量的DNA片段。
PCR技术的出现，极大地促进了基因组研究的进展，并在分子诊断和分子治疗中得到广泛应用。
但是，PCR技术也存在一些局限性，如扩增长度的限制、特异性的选择以及样本的质量控制等问题。
因此，人们不断对PCR技术进行改进和优化。
二、全基因组扩增技术的发展随着分子生物学技术的不断发展，人们对基因组测序的需求也越来越高。
传统的PCR技术只能对特定区域进行扩增，无法对整个基因组进行扩增。
为了解决这一问题，人们发展出了全基因组扩增技术。
全基因组扩增技术可以对整个基因组进行扩增，并进行高通量测序，从而获取更全面的基因组信息。
全基因组扩增技术的发展，使得基因组研究的深度和广度大大提高，为预防和治疗遗传性疾病提供了更加可靠的数据基础。
三、基因组编辑技术的应用基因组编辑技术是指通过人为干预基因组序列，改变细胞或生物的遗传信息。
目前，基因组编辑技术在生命科学领域被广泛应用，它能够实现基于目标序列进行精准编辑，从而解决很多遗传性疾病的问题。
如CRISPR/Cas9基因组编辑技术，可以通过CRISPR-Cas9系统导入外源DNA，在基因组上实现精准的编辑。
该技术具有高效性、精准性以及可操作性等优点，已成为新一代基因组编辑技术的代表。
全基因组的可移动遗传元件方法描述
全基因组的可移动遗传元件方法描述可移动遗传元件（MGEs）是一类能够在基因组中扩散或转移的遗传元件。
MGEs包括转座子、质粒、噬菌体、整合子等，它们与细胞质外派生物和细胞共同作用，维持生态系统的稳定性。
全基因组的MGEs研究是一项经典技术，旨在揭示MGEs在基因组进化中的作用和分布情况。
下面我们将介绍全基因组的MGEs检测方法和分析方法。
1. 可移动遗传元件检测方法（1）转座子检测转座子是一种能够在基因组中移动的DNA序列，可以通过PCR扩增、Southern blotting等方法进行检测。
PCR扩增常用的引物为IS（插入序列）元件的端序列，Southern blotting则需要使用与转座子序列特异性的探针进行杂交检测。
（2）质粒检测质粒通常具有复制原点、药物耐受等特征，可以通过质粒提取和PCR扩增等方法进行检测。
质粒提取需要破碎菌体或重组细胞，并通过离心或柱层析等技术提取质粒DNA。
（3）噬菌体检测噬菌体的检测通常使用PCR扩增和电子显微镜等技术。
PCR扩增的引物为噬菌体的相对保守区域，电子显微镜则可用于检测噬菌体的形态和大小。
整合子是一种可以将自身嵌入到宿主基因组的遗传元件，可以通过PCR扩增、均聚酶链反应（LAMP）、实时PCR等方法进行检测。
PCR扩增通常使用整合子序列特异性的引物，LAMP则需要4个特异性引物和Bst DNA聚合酶进行反应，实时PCR可根据扩增曲线检测整合子在基因组中的存在情况。
（1）整合子插入机制分析对整合子插入机制的分析可以探究整合子与基因组的相互作用，一般使用约束酶切位点的扩增方法和基因组测序数据的比对方法进行分析。
约束酶切点扩增可检测整合子插入位点周围的相对一致性，比对数据则可揭示整合子插入位点与基因组中其他序列的关系。
质粒分析可基于序列分析和稳定性的分析进行，包括DNA序列的比对、基因组插入的检测和稳定性的分析。
同时，也可以根据质粒的不同特征进行分类和进一步分析。
基因扩增名词解释
基因扩增名词解释
基因扩增（GeneAmplification）是指复制和拷贝整条染色体上的基因，使其在细胞中的表达量显著增加的一种遗传现象。
它是自然界进化的一种有效的技术，可以帮助物种适应环境的变化，从而实现物种演化。
基因扩增发生在细胞中，首先，特定的基因会被复制，这个复制过程是由蛋白质DNA复制酶实现的，这些蛋白质会使复制过程变得更加有效率。
复制后，细胞就可以拥有两个相同的染色体，染色体上的基因数量就会增多，染色体中的基因表达也会随之增加，导致生物器官功能的变化。
基因扩增的发生受到多种因素的影响，一方面是外界环境因素，比如空气污染、水环境污染、污染物的侵入以及生物敌对的影响等等。
另一方面是内部因素，比如细胞内的基因复制机制和表达异常、基因突变等。
还有一些基因特异性的因素，比如基因型异质性、细胞内环境差异和调控因子水平等。
基因扩增可以有效地改变基因表达水平，参与调节细胞的生长发育，从而可以调节某些器官的功能。
因此，基因扩增也被用于生物学研究，特别是临床肿瘤实验中，基因扩增可以帮助更好地了解恶性肿瘤的发展规律，从而帮助医学工作者更好地治疗肿瘤。
最后，基因扩增也可以用于分子生物学技术，可以更快更好地分子克隆，从而更有效率地完成生物医学研究。
例如，基因扩增可以用于活性基因组学，这是一种较新的利用基因扩增在细胞中进行研究的
方法，用来了解细胞的表型和基因的特征。
总之，基因扩增是一种有效的技术，可以用于调节细胞的功能，从而帮助物种适应环境的变化。
基因扩增可以用于生物学研究，也可以用于分子生物学技术，为以往的研究提供了新的思路，无论是调节细胞功能还是治疗肿瘤，都有着广阔的应用前景。
WGA（全基因组扩增）技术
WGA（全基因组扩增）技术作为⼀种增加有限DNA量的⽅法，全基因组扩增技术于1992年出现，该⽅法特别适于法医学鉴定和遗传疾病的研究，以及如⼆代测序技术和CGH阵列（⽐较基因组杂交）等新技术应⽤，后者的主要难题就在于DNA样本数量有限，但分析需求量⼜很可观。
⽬前业界已经开发出多种WGA技术，它们之间的实验⽅案和复制准确度有所不同。
业界已经开发出多种WGA技术；不过这些技术在其扩增准确性和易⽤性等⽅⾯有所区别。
多重置换扩增（MDA）的WGA技术，能够提供⽆偏差的准确全基因组扩增基于PCR的WGA技术：基于PCR的WGA技术主要有两种：简并寡核苷酸PCR (DOP-PCR)技术(1)和扩增前引物延伸(PEP)技术(2)。
这两种技术之间的主要区别在于PEP技术使⽤随机引物和低PCR退⽕温度，⽽DOP-PCR技术则使⽤半简并寡核苷酸（例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG）和更⾼的退⽕温度。
两种⽅法中都使⽤了Taq DNA聚合酶，使得扩增长度限制在3 kb（平均⽚段长度为400–500 kb）以内，并且会在扩增序列中引⼊⼀些错误。
不仅如此，有研究发现这些技术的基因组覆盖度不够完整，并会在扩增中产⽣偏向性——由于引物优先结合某些特定区域，造成DNA扩增产物中的⼀些序列相对增多。
多重置换扩增的WGA技术多重置换扩增(MDA)的恒温基因组扩增技术，该技术包含了随机六聚体与变性DNA的结合过程，以及使⽤聚合酶在恒定温度下进⾏的链置换合成过程。
每个置换链上添加引物后，形成分枝状的DNA结构⽹络。
聚合酶不会从基因组DNA模板上⾯解离下来，这使得⽣成的⽆偏差DNA⽚段可延伸⾄100 kb。
该酶还具有3’端→5’端的外切酶校正活性，相⽐基于Taq DNA聚合酶的⽅法，能够提供⾼达1000倍的保真度（参见上述基于PCR的WGA技术）。
聚合酶由独特的优化缓冲液进⾏⽀撑，能够⽅便的克服如发卡环⼀类的⼆级结构困难，在扩增过程中避免滑脱、定制和聚合酶解离等现象的发⽣。
单细胞全基因组扩增技术
单细胞全基因组扩增技术全基因组扩增技术（whole genome amplification，WGA）是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA 的总量。
WGA主要有以下几种类型：1、DOP-PCR简并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）是一种基于PCR技术的全基因扩增方法。
主要原理使用部分简并寡核苷酸引物进行PCR反应（引物中间含6个随机碱基），首先使用较低的温度（～25℃）进行退火，随后再缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度（～55℃）进行多循环常规PCR 反应，从而实现对全基因组的扩增。
优点：•操作简单。
•产物产量较高。
缺点：•起始模板量低时，扩增偏差大。
•引物与模板间的不确定性以及引物间的相互作用均可能导致较低的全扩增灵敏度及较高的错误率。
•聚合酶及引物浓度需要进行优化。
2、LM-PCR连接反应介导的PCR（ligation mediated PRC，LM-PRCR）指的是有接头连接过程参与的PCR反应。
主要步骤1.模板DNA的片段化处理：物理剪切或限制性内切酶处理使DNA裂解成小片段。
2.模板片段与接头连接：根据酶切片段类型设计可与之连接的接头，在DNA连接酶的作用下，与模板片段两端连接，接头中含有一段外源通用引物序列，用作下一步PCR反应中的引物。
3.全扩增PCR反应：连接成功的模板片段经引物延伸后两端形成了通用引物结合位点，因此可以外源引入的通用引物进行PCR反应，包括接头在内的模板片段可同时得到扩增。
优点•灵敏度高。
•使用通用引物扩增均匀。
•产物产量高。
•对模板DNA质和量要求低。
缺点•操作繁琐。
•多步操作易丢失模板DNA。
3、PEPPEP扩增前引物延伸反应（primer extension pre-ampification，PEP）是基于PCR 技术发展而来的全基因扩增方法。
wga扩增原理
wga扩增原理WGA扩增原理WGA（全基因组扩增）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增整个基因组的DNA。
它是通过无特异性引物扩增的方法，可以从极少量的DNA样本中进行全基因组扩增，从而使得后续的研究更加方便和高效。
下面将详细介绍WGA扩增的原理。
WGA扩增的原理是通过将DNA样本与引物和酶结合，通过酶切和连接的方式来扩增整个基因组的DNA。
首先，将DNA样本与随机引物混合，随机引物是一种长度为6-10个碱基的寡核苷酸，能够与DNA样本的任意位置结合。
随机引物的引入能够产生足够多的起始位点，从而确保扩增过程中整个基因组的覆盖率。
接下来，在引物的作用下，将DNA样本进行酶切。
酶切是指利用特定的酶酶解DNA链，从而得到两个或多个DNA片段。
酶切反应一般分为限制性酶切和非限制性酶切两种。
限制性酶切是一种特异性的酶切反应，只在特定的DNA序列上起作用，从而产生特定长度的DNA片段。
而非限制性酶切则是在无特异性序列上进行切割，产生随机长度的DNA片段。
随后，将酶切后的DNA片段与引物连接。
连接是指将两个或多个DNA片段通过酶的作用，使其相互连接成为一个完整的DNA分子。
连接的方法有很多种，常用的有T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶等。
连接反应一般在适当的温度和时间下进行，使DNA片段能够稳定地连接在一起。
通过PCR反应来扩增连接后的DNA片段。
PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的技术，能够在短时间内扩增目标DNA序列。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性是指将DNA双链解开成为单链，使其成为PCR反应的起始物。
退火是指将引物与DNA靶标序列结合，使引物能够与靶标序列发生特异性的连接。
延伸是指在引物的作用下，通过DNA聚合酶的作用，在靶标序列上合成新的DNA链。
经过多轮PCR反应，可以得到大量的目标DNA序列。
WGA扩增通过引物和酶的作用，使DNA样本发生酶切、连接和PCR扩增等步骤，从而实现对整个基因组的扩增。
wga染色方法
WGA染色方法一、WGA染色方法概述WGA（Whole Genome Amplification，全基因组扩增）是一种在基因组水平上扩增DNA的方法，常用于微量样本或限量样本的基因分析。
WGA染色方法是一种利用分子探针和荧光信号来标记特定DNA序列的技术，常用于染色体分析和基因定位。
本文将详细介绍WGA染色方法的原理、步骤以及应用领域。
二、WGA染色方法步骤WGA染色方法包括以下几个步骤：1. 样本准备首先，需要从样本中提取DNA，并进行纯化和浓缩处理，以获取高质量的DNA模板。
2. 全基因组扩增接下来，使用WGA技术对提取的DNA进行全基因组扩增，以增加DNA的数量。
常用的WGA技术包括MDA（Multiple Displacement Amplification，多点位扩增）和MALBAC（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles，多位点退火环化扩增循环）等。
3. DNA标记在全基因组扩增的DNA样本中，选择目标DNA序列，并使用荧光标记的分子探针对目标序列进行特异性探测，以实现DNA标记。
常用的分子探针包括FISH探针（Fluorescence In Situ Hybridization，原位荧光杂交探针）和PCR引物（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应引物）等。
4. 荧光信号检测使用荧光显微镜或流式细胞术等方法对标记的DNA样本进行荧光信号的检测。
荧光信号可根据不同标记探针的颜色和强度，反映出DNA序列的分布和定位信息。
三、WGA染色方法原理WGA染色方法主要基于DNA的互补配对原理和荧光信号检测技术。
具体原理如下：1. DNA互补配对WGA染色方法利用分子探针与目标DNA序列发生互补配对，该分子探针通常是单链DNA或RNA分子，其序列与目标DNA特定区域互补。
当分子探针与目标DNA序列发生互补配对后，可以进一步标记和检测。
基因扩增简介
目的基因扩增SOP聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。
这也是“微量证据”的威力之所在。
由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。
到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。
1976年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
一、PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
PCR扩增时引物有几种
PCR扩增时引物有几种PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在生物分子研究领域广泛应用的技术，用于扩增DNA序列。
在PCR反应中，引物起着至关重要的作用，引物的选择直接影响到反应的效果和结果。
引物是在PCR反应中与待扩增DNA序列的两端互补配对的短链寡核苷酸分子。
PCR 反应通常需要两个引物，一个是前向引物（Forward Primer），另一个是反向引物（Reverse Primer）。
引物的选择应满足几个基本原则：与目标序列互补，引物长度适中，引物的Tm值相似且合适，引物之间不得有自身互补。
在PCR扩增中，引物的设计对扩增结果至关重要。
引物的选择根据实验需要而定，常见的引物包括：1. 特异性引物特异性引物是指与目标序列完全互补的引物，它们在PCR反应中与待扩增的目标序列的两端发生互补配对，从而引发扩增反应。
特异性引物的设计需要对目标序列进行详细的生物信息学分析，确保引物与其他非目标序列不发生非特异性扩增。
2. 基因组引物基因组引物是针对整个基因组范围的引物，用于对基因组DNA进行扩增。
基因组引物可以用于扩增未知序列或进行全基因组扩增。
基因组引物的设计需要充分考虑基因组的复杂性和多样性，平衡引物长度和特异性。
3. 编码区引物编码区引物用于扩增特定基因编码区域的DNA序列。
编码区引物的设计需要结合已知的基因编码区域序列进行，通常包括该基因的外显子或启动子等区域。
编码区引物用于检测和分析特定基因的表达或突变情况。
4. 母源引物母源引物是一种针对外源DNA序列的引物，常用于检测和分析DNA样本中存在的外源物质。
母源引物的设计需要与目标外源DNA序列进行互补配对，能够鉴别和区分样本中存在的外源物质。
在PCR反应中，引物的设计和选择是非常关键的。
合理选择引物可以确保PCR反应的特异性、敏感性和效果，从而获得准确和可靠的扩增结果。
同时，引物的设计需要充分考虑引物特性、目标序列特点和预期实验结果，以确保反应的成功和有效。
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全基因组扩增——微量DNA分析的金钥匙来源：青年人() 更新时间：2010/3/8 19:51:27 【字体：小大】聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用使得微量甚至单个细胞DNA的分析成为可能，极大地促进了法医学、古生物学、分子诊断学和分子病理学的发展。
但即便是对于非常敏感的PCR技术，许多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或几次PC R反应。
为能从少量细胞中最大限度的获取信息，全基因组扩增技术应运而生。
一、全基因组扩增的概念全基因组扩增（whole genome amplification, WGA）是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。
常用的方法有IRS-PCR（interspersed repeat sequence PCR）［1］、LA-PCR（linker ada ptor PCR）［2］、T-PCR（Tagged-PCR）［3］、DOP-PCR（degenerate oligonucleotide pr imed PCR）［4］、PEP-PCR（primer extension preamplification PCR）［5］等。
其中最具代表性方法是DOP-PCR和PEP-PCR。
DOP-PCR和PEP-PCR的基本原理都是通过其随机引物与基因组DNA多处退火从而使大部分基因组序列得到扩增。
DOP-PCR的引物是由其3′和5′端的特异核苷酸序列和中间的6个核苷酸构成的随机引物组成。
其PCR程序是先在低退火温度下进行几个循环的低严谨扩增，然后再提高退火温度，进行几十个循环的严谨扩增。
由于DOP-PCR的引物3′端设计的是在基因组中高频出现的序列，因此，在首轮的低严谨扩增条件下能与基因组多处退火，从而将基因组普遍扩增。
然后下一轮的严谨扩增中又将低严谨扩增的产物再次放大［4］。
与DOP-PCR不同的是，PEP-PCR的引物是由15个随机核苷酸组成的完全随机引物。
PCR由50个循环组成，每个循环的退火温度都是由37℃连续升温至55℃，从而确保不同组成的引物与尽可能多的基因组序列退火，使整个基因组得到放大［5］。
二、全基因组扩增的质量控制全基因组扩增的主要目的是在如实反映基因组原貌的基础上最大限度地增加DNA 量。
因此，扩增效率和保真性是衡量全基因组扩增技术优劣的主要标准，此外，扩增片段的大小对于序列较长的基因片段分析来讲也是一个重要因素。
（一）扩增效率DOP-PCR和PEP-PCR均能较大幅度地扩增模板DNA的量。
据Cheung等［6］报道，DOP -PCR可将原模板扩大12至2万倍，而且，模板量越少，扩增倍数越高，这主要是由于受到DNA聚合酶和引物量的限制。
PEP-PCR的精确定量研究尚未见报道，但就Zhang等［5］的保守估计，一个单一基因组拷贝的精子在PEP-PCR后至少有78%的基因组序列可以扩增30倍以上。
也有人报道，PEP-PCR的扩增效率可以在1 000倍以上［7］。
不同的模板扩增效率差别很大，一般说来，新鲜完整的细胞，如体外培养的细胞、外周血淋巴细胞等扩增效率最高，而组织切片，特别是经甲醛溶液固定的石蜡切片DNA扩增效率最低［8］,可能是由于在切割制片及后续处理中DNA受损质量下降所致。
但即便如此，其扩增效率仍然非常可观。
Duddy等［9］报道，3 μm的石蜡切片上1 mm2的细胞经PEP-PCR扩增后，可进行10～100个位点的分析。
与特异位点PCR不同，DOP-PCR和PEP-PCR的引物在整个基因组上有多个退火位点，因此相同量的引物和DNA聚合酶在前几个循环内便达到饱和而进入线性增长期，因此全基因组扩增效率的主要限制因素是DNA聚合酶和引物的量［4，10］。
实验也证明，在一定范围内增加引物和DNA聚合酶的量可以提高扩增效率，但过高的引物和酶量会由于引物自连形成过多非模板相关序列［4］。
WGA和后续的PCR循环数较多，时间较长，这对于DNA 聚合酶的耐热性和保真性是一个考验。
已有人用比Taq酶耐热性和保真性更好的DNA聚合酶Vent进行WGA［7］，也有人证明用高保真聚合酶能提高WGA的产率［8］，可能是由于后者的3′～5′的DNA外切酶活性可以校正在低严谨条件下不完全匹配的引物3′端，使之延伸更有效。
另外，Dietmaier等［8］认为，细胞的裂解法对于WGA的扩增效率也有影响。
PEP-PCR和DOP-PCR相比较，DOP-PCR扩增效率可能高于PEP-PCR，Wells等［11］用琼脂糖凝胶电泳EB染色的方法可以在紫外光下看到DOP-PCR产物的弥散带，但却不能看到PEP-PCR的产物；利用DOP-PCR从一个细胞制备的比较基因组杂交涂染探针可以呈现令人满意的杂交效果，而PEP-PCR制备的比较基因组杂交探针的杂交信号非常微弱。
（二）序列保真性WGA要求扩增DNA能如实反映模板原貌，这包括两层涵义：一是全部或绝大部分基因组序列能被以相同的比例扩增，即覆盖率问题；二是尽量减少原模板中不存在的序列。
PEP-PCR由于引物全部序列均为随机，其种类多达415，这便保证了它可以与基因组随机退火，从而使整个基因组得到放大［10］。
实验也证实了PEP-PCR可以扩增几乎整个基因组［12］。
DOP-PCR的引物并非完全随机，与基因组的退火有一定序列倾向性，对质粒和粘粒等复杂性低的模板的扩增也证实了这一点［4］。
但就目前的多遗传位点的分析看，多数位点都获得了成功［6，11，13］，表明DOP-PCR可以覆盖大部分基因组。
对于双倍体的细胞来说，PEP-PCR、DOP-PCR均遇到一个能不能对两个等位基因同倍扩增的问题。
几乎所有的研究组都观察到在细胞数量较少时，DOP-PCR和(或)PEP-PCR 都会不均一扩增两个等位基因，造成人为的等位基因“缺失”（allele drop-out）从而被误认为杂合性缺失(loss of heterozygo-sity)［6-8，11，13，14］，这种现象也见于单个细胞的DNA片段扩增［15］。
虽然不能排除在WGA扩增后DNA总量仍很少的情况下，由于WGA 后续特异位点PCR偏差所致，但人们普遍认为造成等位基因“缺失”的主要原因是WGA 扩增过程中由于模板量少而退火偶然性增大所致［6-8］，因为对相同标本进行多次WGA会出现不同等位基因的等位基因“缺失”［14］；而同一WGA扩增产物多次取样进行PCR的等位基因“缺失”模式相同［11］。
为减少这种人为误差，人们规定了原始标本量的低限。
但由于研究材料和方法的差别，不同研究组的标准相差很大，如Dietmaier等［8］用10个体外培养的SW480细胞经改进的PEP-PCR扩增便可以获得可信的结果；而Barret等［14］则需要50～100个流式细胞仪分选的食管癌细胞才能达到两个等位基因的同倍扩增。
对于甲醛固定的石蜡切片，Dietmaier等［8］认为250个细胞就可以避免等位基因“缺失”的出现，而Kim等［13］则认为DNA量不应该少于20 ng（>1 000个细胞）。
对只能获得单个细胞的标本，如从母体外周血分离到的胎儿细胞，人们建议通过多次独立的WGA扩增以减少人为偏差的可能［7］。
由于WGA的扩增和后续PCR反应的循环数有近百次或更多，因此，DNA聚合酶的保真性是一个重要问题。
尽管Taq酶有一定的错误率［16，17］，但就目前的研究来看，WGA中由Taq酶引入的点突变的比例并不高［7，8，11，18］。
但仍有人用高保真聚合酶代替Taq酶，以减少这种可能性［8］。
对于微卫星等重复序列讲，在DNA量太少的情况下，除上述等位基因“缺失”和点突变外，还会产生微卫星片段长度的突变，一般表现为一个或几个重复单元的插入或缺失，这种现象有一定位点特异性，可能与位点所在区域的染色质结构、GC含量等因素有关［11］。
据认为可能是由于在WGA低严谨扩增条件下的链的滑动所致，因为对于未经WGA 扩增的单细胞微卫星分析没有发现这种现象［19］。
（三）扩增片段的长度片段长度是DNA质量的一个重要指标。
一般说来，DOP-PCR、PEP-PCR的扩增产物对于500 bp以内的序列分析没有问题［6，11，14，19］。
有报道PEP-PCR的扩增片段最多有800bp［5］，而DOP-PCR的扩增片段可达1.5 kb［11］。
综上所述，DOP-PCR与PEP-PCR相比，DOP-PCR在扩增效率和DNA片段长度方面优于PEP-PCR；而在覆盖率上不及后者，尤其是在DNA量少的情况下。
三、WGA的应用及注意事项WGA是一种能大量增加原始模板DNA的技术，对于原始材料很少的法医学、古生物学；对于只能从母体外周血和羊水中获取单个细胞的产前诊断；对于从有限标本进行多个位点遗传分析的肿瘤分子病理学来说，都有广阔的应用前景。
DOP-PCR主要用于原位杂交［4，20］和比较基因组杂交［11，13］的染色体特异探针和涂染探针的制备，近来也被用于微量DNA的分子遗传研究［11］。
PEP-PCR最早用于精子基因型分析［5］，后来在遗传病的产前诊断［7，18］和微量纯化肿瘤细胞的遗传异常分析中广泛应用［8，9，14］。
另外，值得一提的是，WGA可以提高肿瘤杂合性缺失分析的敏感性［8，14］，这可能是由于WGA的多次PCR 反应使肿瘤细胞和肿瘤组织中混杂的少量正常组织的差别更加显著。
这对于在肿瘤病人的尿、痰等混杂有正常组织的临床标本上进行微卫星分析，从而无创性诊断肿瘤具有重要意义。
WGA最主要的问题是人为的假象。
因此在做结论前应该慎重，尤其是以诊断为目的时，应该尽量增加原始模板的量、分别多次独立检测和使用高保真的聚合酶以减少人为假象的出现。
四、展望WGA已经在精子、胎儿细胞、淋巴细胞、组织切片等标本的微量分析中显示出强大优势，但如何减少甚至避免小量标本的扩增假象将是今后一个重要课题。
另外，对肿瘤病人血浆、尿、痰等体液中的DNA的扩增应用于肿瘤的无创性诊断及对经过处理的DNA 如转甲基后的DNA、RNA逆转录成的cDNA进行扩增将是一个很有前景的发展方向。
基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(G1998051207)作者单位：张建军（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室100021 北京）高燕宁（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室10 0021 北京）程书钧（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室100021 北京）。