枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达
一株可以高效分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌株及高纯纳豆激酶制备工
专利名称：一株可以高效分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌株及高纯纳豆激酶制备工艺
专利类型：发明专利
发明人：张建华,崔青,龚文秀,钱丙俊,李希强,姚晓敏,王杰,刘华奇
申请号：CN201710221567.5
申请日：20170406
公开号：CN107058204A
公开日：
20170818
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一株可以高效分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌菌株，利用PCR技术扩增纳豆枯草芽孢杆菌NK 的aprN基因，并依据枯草芽孢杆菌的密码子偏爱性优化了起始30个氨基酸的密码子，构建重组表达质粒pHT01‑aprN，经限制性酶切、PCR扩增和测序验证其正确性。
通过电击法将pHT01‑aprN导入枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)，利用氯霉素抗性筛选获得工程菌。
优化发酵条件后，经IPTG诱导表达，摇床培养发酵液中最高酶活为289U/ml，高密度发酵发酵液中最高酶活达到
7778U/ml，经亲和柱层析制备高纯纳豆激酶酶制剂最高酶活为981731U/g。
申请人：上海诺金科生物科技有限公司
地址：201201 上海市浦东新区张江高科技产业东区瑞庆路528号10幢甲
国籍：CN
代理机构：上海申新律师事务所
代理人：周云
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一种高分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用[发明专利]
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专利名称：一种高分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用专利类型：发明专利
发明人：郝宁,郭格格,许琳,欧阳平凯
申请号：CN201710498622.5
申请日：20170627
公开号：CN107099487A
公开日：
20170829
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种高分泌纳豆激酶枯草芽孢杆菌及其应用，所述菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs‑11061，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.13932。
本发明还公开了利用上述高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌生产纳豆激酶的方法。
本发明方法与其他发酵方法相比，在发酵方面，该菌可以在高温条件下发酵，同时明显地缩短发酵周期；在培养基成分方面，利用木糖母液粗原料降低成本，能耗低，污染小；与原始菌相比，纳豆激酶的分泌量明显提高，且发酵产物易处理，副产物少。
申请人：南京工业大学
地址：211816 江苏省南京市浦口区浦珠南路30号
国籍：CN
代理机构：南京汇恒知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王月霞
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大肠杆菌发酵生产表达纳豆酶的研究
大肠杆菌发酵生产表达纳豆酶的研究一、背景介绍纳豆酶是一种具有重要生物学功能和医学应用价值的酶，可以加速血栓溶解，预防心脑血管疾病。
所以，纳豆酶被广泛应用于医药、保健品等领域。
而大肠杆菌作为生物工程领域中广泛使用的微生物，其生产表达纳豆酶的研究可以提高纳豆酶的产率和纯度，降低成本，具有很大的现实意义和发展前景。
二、大肠杆菌表达纳豆酶的挑战大肠杆菌作为一种常见的微生物，普遍存在于自然环境中。
然而，要将其作为一个重要的表达工具，需要克服许多困难。
其中最主要的问题是，大肠杆菌受到外界环境的影响比较大，可以被各种抗生素、酶和化合物所抑制，这就限制了大肠杆菌用于酶表达的能力。
另外，由于纳豆酶的生物学特性以及结构复杂性，在大肠杆菌体内进行表达的过程中也存在很多困难。
其中，最主要的限制是，纳豆酶的相对分子量较大，需要在大肠杆菌体内进行正确的折叠和组装才能保证其活性和稳定性。
三、大肠杆菌发酵生产表达纳豆酶的研究现状为了克服大肠杆菌表达纳豆酶的挑战，研究人员开始从多个方面入手，不断探索最有效的表达策略和条件。
1. 选取合适的载体在大肠杆菌体内表达纳豆酶的过程中，载体选择显得非常重要。
一些研究表明，选择能够支持高效表达的载体是提高纳豆酶产量和纯度的关键。
目前，大肠杆菌表达纳豆酶主要采用质粒载体进行。
这类载体具有简单、易操作、扩增方便等优点，同时也可以通过对载体的一些辅助调控，来提高纳豆酶的表达量和产量。
2. 优化发酵工艺优化发酵工艺是提高表达纳豆酶的重要措施。
在大肠杆菌发酵生产表达纳豆酶的研究中，研究人员通常会调整温度、pH值、培养基组成等因素，以达到高效产酶的目的。
例如，一些研究发现，在温度调控方面，将温度从37℃升高到42℃可以显著提高纳豆酶的产量，而在pH值方面，维持pH在7左右可以获得最佳的表达效果。
3. 应用融合表达技术为了提高纳豆酶在大肠杆菌中的表达效果，一些研究将纳豆酶与其他蛋白融合表达，以提高融合蛋白的表达水平，从而达到提高纳豆酶表达的目的。
通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达
激酶分泌表达 ，并对其纤溶活性进行测定 结果表明，启动子 Ｐ 陆 Ⅱ 介导的纳豆激酶纤溶活性 （ １ １ ０ ． ８ ０ Ｆ Ｕ ／ ｍＬ）明显优于其他四种 启 动 子 。通 过对 启 动 子 Ｐ ＾ 进 行 多 次 串联 ，成 功 构 建质 粒 ｐ Ｓ Ｇ１ ０ ６（ Ｐ 坳 Ｐ ） ，ｐ Ｓ Ｇ１ ０ ７（ （ Ｐ Ｐ 砌 Ｐ 脚 Ｐ ） 。数据显示，菌株 Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ＷＢ ８ ０ ０ ／ ｐ Ｓ Ｇ１ ０ ７（ Ｐ ）和 ｐ Ｓ Ｇ１ ０ ８
文章篇号 ： １ ６ ７ ３ — ９ ０ ７ ８ （ ２ ０ １ ６ ） １ １ — ７ ２ — ７ ７ Ｄ Ｏ Ｉ ： １ ０ ． １ ３ ９ ８ ２ ￣ ． ｍｆ ｓ ｔ ． １ ６ ７ ３ — ９ ０ ７ ８ ． ２ ０ １ ６ ． １ １ ． ０ １ １
Ｅｆ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ Ｏｖ ｅ ｒ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｒｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ Ｎａ ｔ ｔ ｏ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ｉ ｎ Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ
－ Ｐ 训 ）纳豆激酶产量最高为 ２ １ ３ ． ３ ０ Ｆ Ｕ ／ ｍＬ，
相 比单个启动子 Ｐ ， 提 高了９ ２ ． ５ １ ％。 通过对五种强启动子的比较以及对其进行 串联操作 ， 成功实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌 ＷＢ ８ ０ ０ 的高效表达，纤溶活性最高为 ２ １ ３ ． ３ ０ Ｆ Ｕ ／ ｍ Ｌ，与现有相关报道相比有明显优势。 关键词 ：纳豆激酶； 串联启动子；分泌表达；枯草芽孢杆 菌 ＷＢ ８ ０ ０
摘要 ： 本研究通过 串联启动子方式实现纳豆激酶在枯草 芽孢杆菌 ＷＢ８ ０ ０中的高效分泌表 达。 通过对 几种现有报道的强启动子的 比较并对其进行 串联操作，确定生产纳豆激酶的最优启动子及纳豆激酶的最 高产量。本研 究首先在枯草芽孢杆菌 ＷＢ ８ ０ ０中成功构建
一种高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用[发明专利]
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专利名称：一种高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用专利类型：发明专利
发明人：龚爱华,朱沛煌,严永敏,曾建,彭琬昕,杜凤移,崔恒林申请号：CN201711130808.1
申请日：20171115
公开号：CN107841473A
公开日：
20180327
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。
保藏编号：CGMCC No.14435，保藏时间：2017年07月17日。
建议的分类命名：枯草芽孢杆菌亚种Bacillus subtilis.利用该菌种与液体发酵培养基生产含有纳豆激酶发酵液，酶活高达35850U/g，利用发酵液制备高纯纳豆激酶粉，酶活高达594730u/g，以纳豆冻干粉和高纯纳豆激酶粉为主要原料制备的一种可预防心脑血栓疾病的保健品具有纳豆激酶活性高，食疗效果好，无副作用的特点。
申请人：江苏大学
地址：212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
国籍：CN
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纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达
纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达黄磊;谢玉娟;李申;李丹;梁凤来;刘如林【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2007(028)005【摘要】以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌一枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析.【总页数】4页(P199-202)【作者】黄磊;谢玉娟;李申;李丹;梁凤来;刘如林【作者单位】南开大学生命科学学院,天津,300071;南开大学生命科学学院,天津,300071;南开大学生命科学学院,天津,300071;南开大学生命科学学院,天津,300071;南开大学生命科学学院,天津,300071;南开大学生命科学学院,天津,300071【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 黄志立;罗立新;凌均建;杨汝德;梁世中2.纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究 [J], 闫达中;许芳;李洁;冯建成;杨艳燕3.植物内生枯草芽孢杆菌纳豆激酶同源基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达[J], 姜嵛;梁晨;姜国勇4.一种新型纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 辛及娣;范长胜5.纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达 [J], 余榕捷;汪炬;谢秋玲;洪岸因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
纳豆激酶的克隆及在大肠杆菌中的表达
纳豆激酶的克隆及在大肠杆菌中的表达李敏;陈柳萌;张诚;曾小军;刘芬;陈时建;李文婧;罗武【摘要】该文采用PCR方法扩增获得了纳豆激酶基因(pro-NK),通过酶切与酶连反应使其与原核表达载体Pet32a相连,构建重组质粒Pet32a-pro-NK,先转入到大肠杆菌DH5α中进行筛选与验证,再将阳性克隆子转化到宿主菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行纳豆激酶蛋白的表达研究.SDS-PAGE电泳分析结果表明,纳豆激酶蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达.%The nattokinase gene pro - NK was cloned by PCR technique. The expression plasmid of Pet32a - pro - NK was constructed based on enzyme digestion and enzyme - linked reaction. The confirmed positive clones were further transformed into Esche-rkhia coli strain BL21(DE3) to study the expression of nattokinase with IPTG induction. The result of SDS -PAGE electrophoretic a-nalysis manifested that nattokinase protein could express efficiently in BL21(DE3).【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2012(024)012【总页数】3页(P144-146)【关键词】纳豆激酶基因;克隆;表达;大肠杆菌【作者】李敏;陈柳萌;张诚;曾小军;刘芬;陈时建;李文婧;罗武【作者单位】南昌大学科学技术学院,江西南昌330046;江西省农业科学院农业微生物研究所,江西南昌330200;江西省农业科学院农业微生物研究所,江西南昌330200;江西省农业科学院农业信息研究所,江西南昌330200;江西省南昌县农业技术推广中心土肥站,江西南昌330200;南昌大学科学技术学院,江西南昌330046;南昌大学科学技术学院,江西南昌330046;南昌大学科学技术学院,江西南昌330046【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q7860 前言纳豆是日本的传统食品［1］，已食用千年，1987年Sumi等［2］首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶在纳豆发酵过程中，由枯草杆菌纳豆变种Bacillus subtilis(natto.var)产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，并将其命名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)。
枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达
枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达乔建军;路福平;陈启明;杜连祥;耿运琪【期刊名称】《南开大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2004(037)002【摘要】The gene of glucose dehydrogenase (GDH) from Bacillus subtilis was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the plasmid pUC-T then sub-cloned into the expression vector pBV220 to give a high level expression of the native protein in E.coli. The SDS-PAGE and thin layer scanning experiments showed that the amount of GDH was up to about 45% of the total proteins from transformants. The activity of GDH from cell-free extract of the genetic engineering Escherichia coli was around 7.8U/mg, 30-fold higher than that of the control. The results showed that GDH, a widely used enzyme in industry, has been expressed efficiently in E.coli.%利用PCR技术扩增得到来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因片段,并构建重组质粒pUC-T-GDH,然后将基因片段克隆于大肠杆菌表达载体pBV220中,得到表达质粒pBV-GDH.葡萄糖脱氢酶在含有表达质粒的基因工程菌株中得以诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层扫描结果表明,经诱导表达的葡萄糖脱氢酶约占基因工程菌株总蛋白的45%.葡萄糖脱氢酶活力测试表明,基因工程菌株无细胞抽提液中葡萄糖脱氢酶的活力为7.8U/毫克,约为对照组的30倍.实验结果初步说明,广泛应用于工业化生产的葡萄糖脱氢酶可以在基因工程菌株中得以大量表达并维持较高活力.【总页数】5页(P13-17)【作者】乔建军;路福平;陈启明;杜连祥;耿运琪【作者单位】天津科技大学,食品科学与生物技术学院,天津,300222;天津科技大学,食品科学与生物技术学院,天津,300222;南开大学,生命科学学院,天津,300071;天津科技大学,食品科学与生物技术学院,天津,300222;南开大学,生命科学学院,天津,300071【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及高效表达 [J], 徐娴;谢承佳;何冰芳2.枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达 [J], 许波;黄遵锡;陈金全;杨云娟;刘海燕3.大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化 [J], 李永海;徐燕;席慧;刘凤华;周霞;高音4.中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达 [J], 刘逸寒;路福平;王建玲;胡博5.鸡支气管炎病毒N基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达 [J], 周建杰;马文富;项勋;段纲;代飞燕;常华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆与序列分析
枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆与序列分析
尹俊;郭军;石有斐;张树军;王铁娟
【期刊名称】《内蒙古农业大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】2001(22)3
【摘要】用 CTAB法从枯草杆菌 (N atto)提取基因组 DNA,聚合酶链式反应 (PCR)扩增获得约 1.3kp的 DNA片段 ,在 T4DNA连接酶作用下 ,将扩增片段连接到 p UCm- T载体上 ,转化 Ecoli DH5 a感受态细菌。
将初步鉴定的阳性细菌提取质粒DNA进行 PCR鉴定和测序。
【总页数】4页(P31-34)
【关键词】纳豆激酶;PCR;序列分析;枯草杆菌
【作者】尹俊;郭军;石有斐;张树军;王铁娟
【作者单位】内蒙古农业大学生物工程系;内蒙古农业大学食品工程系;内蒙古师范大学生物系
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.1;Q933
【相关文献】
1.纳豆芽胞杆菌KX株纳豆激酶基因的克隆及序列分析 [J], 王星;覃宗华;李国清;余劲术;吕敏娜;吴彩艳;蔡建平;谢明权
2.纳豆激酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达 [J], 刘北域;宋后燕
3.纳豆杆菌纳豆激酶成熟肽基因的克隆与同源性分析 [J], 彭勇;黄庆;张义正
4.枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coliBL21(DE3)plysS中的表达 [J], 张立全;刘慧;苏慧敏;扈廷茂;侯鑫;扈会平;邢万金;常福厚;王永胜
5.枯草杆菌DC-2纳豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达 [J], 彭勇;黄庆;张义正
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枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达
枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达
枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达
借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶LipB2全长基因序列进行比对分析.结果显示该脂肪酶基因全长635 bp,编码包括31个氨基酸分泌型信号肽在内的211个氨基酸,与NCBI GenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序列有94.0%的一致性.将该基因克隆到pET-28a(+)表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用枯草杆菌脂肪酶的信号肽序列进行了分泌表达.SDS-PAGE电泳显示分泌表达的脂肪酶分子质量约为21 kD.对表达条件优化后,在30℃、大肠杆菌菌液OD_(600)值为1 8、乳糖诱导浓度为1 5 mM、摇瓶发酵10 h后大肠杆菌分泌表达26 0 U/mL重组脂肪酶,相比较IPTG的诱导,既实现了脂肪酶的高效表达,又节省了成本.
作者：李海军王林刚王治泽陈芳高剑峰Li Haijun Wang Lingang Wang Zhize Chen Fang Gao Jianfeng 作者单位：石河子大学生命科学学院,石河子,832003 刊名：生物技术通报PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年，卷(期)：2010 ""(3) 分类号：Q93 关键词：乳糖诱导 IPTG诱导枯草杆菌脂肪酶基因分泌表达 Induction of lactose Induction of IPTG Bacillus subtili Lipase gene Secretory expression。
枯草芽孢杆菌筛选及其产纳豆激酶的液态发酵条件优化
枯草芽孢杆菌筛选及其产纳豆激酶的液态发酵条件优化
周雪琴;刘良忠
【期刊名称】《食品工业科技》
【年(卷),期】2022(43)7
【摘要】为了提高现有纳豆激酶产量,促进其工业化生产与应用,本文从不同产地的鲜纳豆中分离出枯草芽孢杆菌,先后通过菌落形态初筛与酪蛋白平板复筛,选出水解圈与菌落比值较大的菌株,测定其发酵液中纳豆激酶酶活,选定一株酶活相对较高的菌株X_(3)。
通过系统16S rDNA测序鉴定和系统发育树对比,确定X_(3)菌株为枯草芽孢杆菌。
在单因素试验的基础上,设计响应面试验,优化纳豆激酶摇瓶液态发酵条件,确定了X_(3)菌株液态发酵的最佳条件为:温度34℃,初始pH6.5,接种量2%,装瓶量20%,发酵时间30 h。
在该条件下,发酵生产的纳豆激酶酶活为393.095
U/mL,且与购买的纳豆激酶相比具有更高的酶活。
本试验为后续工业化生产奠定了一定基础。
【总页数】7页(P163-169)
【作者】周雪琴;刘良忠
【作者单位】武汉轻工大学食品科学与工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
【相关文献】
1.纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶发酵条件优化
2.产纳豆激酶枯草芽孢杆菌种子液培养条件的优化
3.产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵条件的\r响应面优化
4.响应面法优化枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶发酵条件
5.低嘌呤、高纳豆激酶活性枯草芽孢杆菌SH21筛选及发酵条件优化
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（ Ｅ ） ｌｓ ） 内蒙 古大学 生命科 学学 院提 供． Ｄ ３ ｐｙＳ 由 成像 系统 为 ＵＶＩ ＣＨ 公司产 品 ． ＴＥ １ ２ １ ｐ Ｔ ｈｓＮＫ 质粒 的提取 接种 大肠杆 菌 Ｄ ａ ｐ Ｔ ｈｓ ． ． Ｅ － ｉ — Ｈ５ （ Ｅ － ｉ ＮＫ） — 于新鲜 Ｌ Ｂ培养基 （ Ａｍｐ１ ０￣ ／ ） ０ ｇ ｍＬ ｔ 中 ，７ ３ ℃振荡 培养过 夜 ， 碱裂解 法提 取质 粒． 用
Ｖ０ ． ７ Ｎｏ ４ Ｉ３ ．
Ｊ ｌ ０ ８ ｕｙ ２ ０
枯草 杆 菌 纳 豆激 酶 基 因在 大肠 杆 菌 中的优 化 高效 表 达
扈 会 平 ，张 立全 ，格 根 通 拉 嘎
（ ． 珠 集 团制 药 厂 ，广 东 珠 海 ５ ９ ０ ； ． 蒙 古 大 学 生命 科 学 学 院 ， 蒙 古 呼 和 涪特 ０ ０ ２ ） １丽 １０ ０ ２ 内 内 １０ １
中图分类号 ： ７６ Ｑ ８ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：１ ０－ ７ ５ ２ ０ ） ４ ０ ４－ ３ ０ １ ８ ３ （ ０ ８０ － ５ ０ ０
纳 豆激 酶（ ｔｏ ｉａｅ ＮＫ） 由枯 草芽孢 杆 菌 （ ａｉｕ ｕ ｌ ｉ 分泌产 生 的一种具 有强 烈溶 栓作 用 的 Ｎａｔｋｎ ｓ ， 是 Ｂ ｃ ｌｓｓ ｂｉｓ ｌ ｔ）
稀释 于 ２ 新 鲜 的 液 体 Ｌ ＋ ｇｕ ｏｅ ０ ２ ＋ Ａｍｐ １ ０／ ／ ５ｍＬ Ｂ（ ｌｃ ｓ ． ％ ２ ｚ ｍＬ） ， 化 培 养 ２ ３ｈ 至 ＯＤ ｏ＝ ｇ 中 活 ～ ， ６ ｏ
０ ４ ． ． Ｅ ｃｌＢ ２ （ Ｅ ） ｌｓ ． ～Ｏ ６ 对 ． ｏｉ Ｌ １ Ｄ ３ ｐｙ Ｓ进 行 同样 的活化处 理 ， 以做 阴性对 照．
维普资讯
第 ３ ７卷 第 ４ 期 ２０ ０ ８年 ７月
内蒙 古 师 范 大 学 学报 （ 自然 科 学 汉文 版 ）
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＩ ｎ ｒＭｏ ｇ ｌ ｒ ｌ ｎｖ ｒｉｙ （ ｔ ｒｌＳ ｉｎ ｅＥｄｔ ｎ） ｏ ｒ ａ ｎ ｅ ｎ ｏｉ Ｎｏ ｍａ ｉｅｓｔ Ｎａ ｕａ ｃｅ ｃ ｉｉ ｏ ａ Ｕ ｏ
１２２ ｐ Ｔ ｈｓＮＫ 质 粒转 化 Ｅ ｃｌＢ ２ （ ３ ｐｙＳ感 受 态 细 胞 参 照 文献 ［ ］ 行 ， 化 后 涂 布 于 ．． Ｅ －ｉ — ．ｏｉ Ｌ １ＤＥ ） ｌｓ ６进 转
Ｌ Ｂ固 体培养 （ ｌｃ ｓ ． ＋Ａｍｐ１ ／ ） ，７℃倒置 培养过 夜． ＋ｇｕ ｏｅ０ ２ ｍＬ 上 ３ ｍｇ
碱性丝 氨酸蛋 白酶． ９ ７年 ， ｕ 等发 现 纳豆 激酶 由 ２ ５个 氨基 酸 组成 ， 子量 为 ２ Ｄ［ ． 酶 除具 有 较 １８ Ｓ ｍｉ ７ 分 ７ ¨该 ｋ 强 的溶 栓作用 外 ， 具有体 内作 用时 间长 、 还 无毒 副作用 等 优 点 ， 能 刺激 静 脉 内皮 细胞 产 生纤 溶 酶 原激 活 剂 并 （— Ａ）２， ｔ Ｐ ［ 从而 更有效 地发 挥溶栓 作用 ， ］ 因而 受 到 广泛 的关 注． 研究 表 明 ， 豆 激 酶 有 可能 作 为 新 一代 口服 纳
的表达进 行优化 筛选 ， 以期 为纳 豆激 酶 的开发与 生产 提供 实验 依据 ．
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
１ １ １ 质 粒与菌株 ．． １ １ ２ 试 剂 与仪 器 ．．
１ ２ 方 法 ．
菌株 ＤＨ５ （ Ｅ —ｉ ＮＫ） 原 核基 因高 效快 速 表 达试 剂 盒 （ Ｅ — ｉ ａ ｐ Ｔ ｈｓ — 、 ｐ Ｔ ｈｓ质粒 ， 菌株 Ｂ ２ Ｌ１ 蛋 白质 分子 量 标准 购 于华 美 生 物工 程 公 司 ， 他试 剂 均 为 国产 分析 纯 ， ｐ ｏ凝 胶 其 ＵＶＩ ｒ
药物用 于治疗 和预 防栓塞 性疾病 ［ ． 我 国 ， 豆激 酶 制 剂—— 恩 开胶 囊 也 已进 入 中试 阶段［ ． 立 全等 ［ ３在 ］ 纳 ‘张 ］ ５ ］
克隆 了 ＮＫ 基 因成 熟肽 片段 ， 实现 了在 Ｅ ｃｌＢ ２ （ ３ ｐｙ Ｓ中的表达 ． 文对 ＮＫ基 因在 大肠杆 菌 中 并 ． ｏｉ Ｌ １ ＤＥ ） ｌｓ 本
摘
要 ： 克 隆 、 达 纳 豆 激 酶 基 因 的 基 础 上 ， ＩＴＧ 浓 度 以 及 诱 导 时 间 两个 重 要 影 响 因 子 进 行 优 化 选 在 表 对 Ｐ
择 ． 果 表 明 ， ＩＴ ０ ／ ／ 结 在 Ｐ Ｇ １０￣ ｍＬ诱 导 ２ ５ ｇ ． ｈ时 ， 豆 激 酶 的 表达 量 相 对 较 高 ， 占 菌 体 蛋 白 重 量 的 ４ ．３ ， 纳 约 ６ ６ 为 实 验 最 佳 的诱 导 条 件 ． 关键 词 ： 草 杆 菌 ； 豆 激 酶 ； 化 表 达 ；大 肠 杆 菌 枯 纳 优
１ ２ ３ 优 化诱 导表达 ．．
（ ）菌体 的活化． 取 Ｌ 固体 培 养 基 上 的 Ｅ ｃｌ Ｂ ２ （ ３ ｐｙ Ｓ ｐ Ｔ— ｉ— １ 挑 Ｂ ． ｏｉ Ｌ １ ＤＥ ） ｌｓ （ Ｅ ｈｓ ＮＫ） 菌 落 ， 种 于 小 接
Ｌ （ ｌｃ ｓ ． ＋Ａｍｐ１ ０ｚ ／ ） Ｂ ＋ｇｕ ｏｅ０ ２ ２ ／ ｍＬ 液体培 养基 上 ，Ｏ℃ ７ ～９ ｒｍｉ ｇ ３ ０ Ｏ ／ ｎ振荡 培养 过夜． 日， １： Ｏ倍 次 按 ５
（ ）不 同时 间的诱 导． 别取 上述活 化 的菌体 ３ ２ 分 ｍＬ于 ７个 培养管 中 ， １ 置于 冰浴备 用 ， 为 未诱 导 取 管 作
收 稿 日期 ： ０ ７ １ １ ２ ０ —１ — ３ 作 者 简介 ：扈 会 平 （９ ７ ）女 ， １ ６ 一 ， 内蒙 古 呼研究 丽 主