第二章 基因工程制药 新版2
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生物制药：基因工程制药2
影响蛋白质的活性和包含体的形成
4、溶解氧
影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物 的生成影响很大 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值 （>40%） 调节搅拌转速法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活 菌产量
5、诱导时机
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达
6、诱导表达程序 热诱导 7、pH pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有
获得微生物自身基因表 达所产生的初级或次级 代谢产物
工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于 产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶解氧的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响
1、培养基
提高工程菌生长速率，保持重组质粒的稳定性，使外源基因能 够高效表达 常用碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等
发酵液
细胞分离 胞内产物
细胞破碎
固液分离
包含体
细胞碎片分离
变性
复性
胞外产物 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
一般不应超过4～5个步骤 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化直至得到纯品以及成品加工
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质， 如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
(七) 基因工程菌中试、培养 及高密度发酵
基因工程菌的培养过程
(1) 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件， 如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分 析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；
4、溶解氧
影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物 的生成影响很大 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值 （>40%） 调节搅拌转速法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活 菌产量
5、诱导时机
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达
6、诱导表达程序 热诱导 7、pH pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有
获得微生物自身基因表 达所产生的初级或次级 代谢产物
工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于 产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶解氧的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响
1、培养基
提高工程菌生长速率，保持重组质粒的稳定性，使外源基因能 够高效表达 常用碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等
发酵液
细胞分离 胞内产物
细胞破碎
固液分离
包含体
细胞碎片分离
变性
复性
胞外产物 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
一般不应超过4～5个步骤 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化直至得到纯品以及成品加工
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质， 如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
(七) 基因工程菌中试、培养 及高密度发酵
基因工程菌的培养过程
(1) 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件， 如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分 析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；
第二章基因工程制药新版2
pUC质粒优点：
１．具有更小的分子，更高的拷数 ２．适于组织化学检测重组体．
[C]、 pGEM-3Z质粒
含一个ampR基因和一个
lacZ’编码基因;
有多克隆位点（MCS）;
正选择颜色标记 lacZ’;
Apr
有两个来自噬菌体的强启
动子PT7和PSP6,用于外源基 因的高效表达
lacZ’
PT7
MCS
1、宿主限制现象
病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在 宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受 到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限 制 （restriction）与修饰(modification) ,简 称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降 解掉。
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
（3）质粒的分类
F质粒----可使宿主A的部分基因随着F质粒一起 转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。
R质粒----可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗 性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另 一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。
2、作用----主要用于 （1）正常DNA的合成。 （2）损伤DNA的修复。
3、种类 （1）DNA-连接酶----广泛存在于生物细胞之中，主要取 自于大肠杆菌E.coli。 （2）T4-DNA连接酶----来自于经过T4-噬菌体感染的大 肠杆菌E.coli。 （3 T4-RNA连接酶----催化单链DNA或RNA的5‘磷酸与 另一单链DNA或RNA的3’羟基之间形成共价连接。
第二章基因工程制药part2
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
第二章 基因工程制药.ppt
2019-10-13
谢谢你的关注
五、重组蛋白质的分离纯化
1. 离子交换层析：
是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。
6. 降低成本，提高产品质量。
2019-10-13
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二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
2019-10-13
谢谢你的关注
2019-10-13
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1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3．费用较高
2019-10-13
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V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。
2019-10-13
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Vitamin A
2019-10-13
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第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
2019-10-13
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一、反转录法
1．mRNA的纯化
（1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
（2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子
生物技术制药：2-基因工程制药-2
下相 杂蛋白 （核酸、多糖）
上相 目的蛋白
白 流 程
第三步两相萃取
静置分层 +盐
下相 目的蛋白
上相 杂蛋白、 PEG、色素
（二）基因重组蛋白的主要纯化技术
➢ 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱 技术分为：
Ion exchange chromatography (IEC) Gel filtration chromatography (GFC) Hydrophobic interaction chromatography (HIC) Affinity chromatography (AC)
二、基因重组蛋白的分离纯化与分析鉴定 (自学）
基因重组蛋白的特点
➢ (1) 目的产物在初始原料中的含量较低; ➢ (2) 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的
产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、 无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分 离纯化影响很大；
➢ (3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表面张 力等十分敏感，容易是其失活、变性；
① 等电点沉淀法
➢ 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不 同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可 进行分离。
✓ 如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调pH8.0去除碱性 蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白质。
② 盐析法
定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度 的增加而升高的这种现象称为盐溶(salting in), 但 当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析 (salting out)
➢ 几种盐的盐析能力的排列次序：
• 磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。
基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
第2章 基因工程制药(二)
⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清igG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品干扰素效价测定、无菌试 验、热原试验。
3.2 成品检定 ⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验
二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
表达的Ala125 IL-2可占菌体总蛋白的42.7%。 超声波裂菌 离心收集包含体 SephacrylS200凝胶过滤 氧化剂复性 透析除盐 获得纯品 产品纯HPLC分析鉴定，纯度可达99%以上， 用3H-TdR掺入法进行活性测定，比活性 1×107U/mg，比野生型IL-2比活性平均提 高30%。
bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽， 其氨基酸序的55％和aFGF相同，分子量为16～18.5 KD。bFGF分子结构中有4个半胱氨基酸，以此形 成分子的三维空间结构。由丝氨酸取代半胱氨酸的 重组bFGF的生物学活性不变，而单链多肽则易于 在大肠杆菌中表达 。
bFGF基因位于人的第5对染色体上，为单拷贝基因， 呈不连续状态，其功能区被两个内含子隔开分为三 个外显子区域。 bFGF有很强的肝素亲和力。bFGF基因中未发现信 号肽顺序，可经自分泌方式释放 。
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GMCSF） 是一个具有多项潜能的造血生长因子，它不仅能够 促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，而且对其 它的细胞，如抗原递呈细胞、成纤维细胞、角质细 胞、皮肤粘膜细胞等，均有着不同程度的刺激作用。 GMCSF对某些疾病，如肿瘤患者放疗、化疗以后 的白细胞减少症、再生障碍性贫血和骨髓移植的治 疗有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治 疗中也有良好的疗效。
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化
反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA，而要 分离纯化目的基因的mRNA，其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA，mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 （polyA)组 成的末端，长达20~250个腺苷酸，足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的 作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被i洗脱下来， 经过两次寡聚(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的mRNA。
我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。 20 世纪70年代末以来，开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家 汁划，特别是国家"863"高技术计划的优先支持下， 使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点 是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。
基因工程制药新版(2)ppt课件
（二）关于限制酶
1、宿主限制现象 2、限制酶的定义 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影响限制酶作用的因素
1、宿主限制现象
病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在 宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受 到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限
制 （restriction）与修饰(modification) ,简
※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化
的序列。
甲基化酶
ECOB核酸酶
TGAN8TGCT ACTN8ACGA
CH3 TGAN8TGCT ACTN8ACGA CH3 CH3 CH3
噬菌体来源序列
宿主来源序列
R/M体系的作用：
保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
பைடு நூலகம்
※限制性内切酶本是微生物细胞中用于
称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降 解掉。
R/M体系： 是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有 EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲 硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列 的特定碱基，使之甲基化。
3、限制酶的特征
具有专一性的识别 位点。
能够形成固定的核 苷酸单链末端。 比较适合于进行 DNA结构的分析 和进行基因重组。
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（5）常用的细菌质粒
pBR322 pTR262 Pmk16 [A]、pBR322质粒 [B]、pUC19质粒 [C]、pGEM-3Z 质粒 pBH10 pAT153 pGEM-3Z pBH20 pXf3 pUC19
[A]、 pBR322质粒
① ②
③
4363 bp 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素基因 (ampR)
Col质粒----能编码大肠杆菌毒素基因，通过表 达之后产生的大肠杆菌毒素可以使得不带Col质 粒的其它菌株死亡。
（4）质粒载体具备条件
质粒载体，也称质粒克隆载体，是指用于实现基因 工程操作的质粒。必须具备以下条件： （1）其分子结构中必须具有多个单一限制酶的切割 位点。 （2）构建重组质粒之后必须具有转化功能。 （3）分子量较小，易于操作。 （4）宿主范围较为单一、无感染性。
④
⑤
一个抗四环素基因
(tetR)
ampR和tetR抗性基因内各有
一些限制酶的酶切位点，供 外源基因插入 当外源基因插入抗药基因内， 抗药基因失活。AmpR→Amp 敏感(AmpS )、TetR→Tet敏 感(TetS).
pBR322:人工构建重要质粒
优点：具有较小的分子量．
具有两种抗生素抗性基因，作为筛选标记． 具有高拷贝数． 是松弛型质粒．
质粒DNA的构型
三种不同的构型：
当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时， 称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常 呈现超螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环 形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之 为开环DNA(ocDNA)； 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子， 则通称为L构型。
二、基因工程载体的分离纯化
（一）定义
（二）基因工程载体的必备条件 （三）基因工程载体的种类
（一）定义
能够将目的 基因携带进 宿主细胞、 并可使得目 的基因能够 在宿主体内 进行自主性 复制的遗传 因子，称为 基因工程载 体。
（二）基因工程载体的必备条件
（1）具有有效运载能力。 （2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进 行自主性复制。 （3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体 内进行自主性复制。 （4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。 （5）能够携带大小不同的外源性目的基因。 （6）鉴定方便、装卸技术简单。 （7）容易控制、安全可靠。
6、影响限制酶作用的因素
（1）DNA的纯度 （2）DNA的甲基化程度 （3）DNA的结构 （4）反应的温度----最适温度为37度 （5）反应的缓冲体系----反应体系中通常含有 MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、 牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。
（三）关于连接酶
质粒载体(plasmid)
存在于天然细菌体 内的一种独立于细 菌染色体之外的双 链环状DNA，具有独 立复制的能力，常 带有细菌的抗药基 因。也存在于某些 真核细胞（酵母的 2μ环状质粒）
（2）质粒的特性
独立于细菌染色体之外的环状DNA或RNA。 其遗传特性属于非染色体控制。 能够进行自我复制。 容易在宿主体内进行转移和迁移。 可编码宿主染色体所不具有的基因。能够赋予宿 主额外的遗传特性： A、编码产生抗生素酶的抗性基因， B、编码产生糖酵解酶系的基因， C、编码产生抗重金属酶的抗性基因。
简称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降 解掉。
R/M体系： 是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有 EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲 硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列 的特定碱基，使之甲基化。
※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化
的序列。
甲基化酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ECOB核酸酶
TGAN8TGCT ACTN8ACGA
CH3 TGAN8TGCT ACTN8ACGA CH3 CH3 CH3
噬菌体来源序列
宿主来源序列
R/M体系的作用：
保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
※限制性内切酶本是微生物细胞中用于
质粒的复制类型
◆
严谨型（strigent plasmid)：
复制与宿主染色体同步受宿主 染色体复制的限制，在宿主细胞中 拷贝数低约１～３份拷贝。
◆
松弛型（relaxed plasmid):
复制不受宿主染色体复制的 限制可独立复制，在宿主细胞中拷 贝数高，宿主细胞中质粒有10-200 拷贝。基因工程常用载体。
（三）基因工程载体的种类
1、细菌质粒 2、真核基因病毒DNA 3、λ噬菌体DNA 4、单链DNA噬菌体M13载体 5、人工质粒载体----科斯质粒 6、酵母人工染色体 7、其他载体
1、细菌质粒
（1）质粒的定义 （2）质粒的特性 （3）质粒的分类 （4）质粒载体的具备条件 （5）常用的细菌质粒
（1）质粒的定义
（A2）、SV40病毒DNA的基因组
（A3）、SV40病毒DNA载体的构建
（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法
[G]、腺病毒
（G1）、腺病毒DNA载体
（G2）、腺病毒DNA载体的特点
3、λ噬菌体DNA
（1） λ噬菌体DNA的特性 （2） λ噬菌体DNA的改造
（A2）、SV40病毒DNA的基因组 （A3）、SV40病毒DNA载体的构建 （A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法
（A1）、SV40病毒DNA的特性
为环状双螺旋结构。其宿主为动物细胞。
SV40病毒有二种表达方式： （1）游离表达方式，SV40DNA+外源性DNA，形成 重组DNA，进入宿主体内，以重组DNA的方式表达。 （2）结合表达方式，重组DNA整合到宿主染色体 的DNA之中，与染色体基因一起表达。
第三节 基因工程制药生产的基本过程
一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例
[B]、 pUC系列质粒
由 pBR322 和 M13 噬菌体构建 而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampR和位于lacZ+ 基因 中靠近 5’ 端多克隆位点 (MCS) 和 来 源 于 pBR322 质 粒 的 复 制 起始点 （ 3 ）大肠杆菌β- 半乳糖苷酶 (lacZ) 的 启 动 子 及 其 编 码 该 基因氨基端α- 肽链的 DNA 序 列 , 此结构特称为 lacZ+ 基因， 便于蓝白筛选
（2）已经研究的真核基因病毒DNA
[A]、SV40病毒DNA [B]、牛乳头瘤病毒 [C]、RNA病毒 [D]、昆虫杆状病毒 [E]、人痘病毒DNA [F]、猴空泡病毒DNA [G]、人腺病毒DNA [H]、人牛痘病毒DNA [ I ]、逆转录病毒载体
[A]、SV40病毒DNA
（A1）、 SV40病毒DNA的特性
（8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选 标记。 （9）应具有很强的启动子。 （10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为 外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增 殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。 （11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源 基因区段，而不转录其它无关基因。 （12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号， 即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够 顺利于进行翻译。
pUC质粒优点：
１．具有更小的分子，更高的拷数 ２．适于组织化学检测重组体．
[C]、 pGEM-3Z质粒
lacZ’
含一个ampR基因和一个 lacZ’编码基因; 有多克隆位点（MCS）; 正选择颜色标记 lacZ’; 有两个来自噬菌体的强 启动子PT7和PSP6,用于外 源基因的高效表达
PT7
MCS Apr pGEM-3Z 2743 bp
单链切割
连接
线性DNA （L型）
开环DNA （oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
（3）质粒的分类
F质粒----可使宿主A的部分基因随着F质粒一起 转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。 R质粒----可编码宿主A的一种或者数种抗生素 抗性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的 另一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗 性。
3、限制酶的特征
具有专一性的识 别位点。
能够形成固定的 核苷酸单链末端。 比较适合于进行 DNA结构的分析和 进行基因重组。
4、限制酶的作用
（1）进行DNA重备DNA放射性探针。
5、基因工程所用到的限制酶
通常是Ⅱ型限制酶，具体有以下几种。 EcoR-I Hind-III BamH-I Pst-I Sst-I Sal-I Ava-I Bcl-I Hind-II Hpa-I Bgl-II Cla-I Hae-III Hha-I Hinf-I Hpa-II Mbo-I Sma-I Xba-I Xho-I
1、定义----凡是能够催化DNA片段5’-末端的磷酰基与3’-末 端的羟基结合成磷酸二酯键的酶，称为连接酶。 2、作用----主要用于 （1）正常DNA的合成。 （2）损伤DNA的修复。 3、种类 （1）DNA-连接酶----广泛存在于生物细胞之中，主要取 自于大肠杆菌E.coli。 （2）T4-DNA连接酶----来自于经过T4-噬菌体感染的大肠 杆菌E.coli。 （3 T4-RNA连接酶----催化单链DNA或RNA的5‘磷酸与另一 单链DNA或RNA的3’羟基之间形成共价连接。