血清胱抑素C及其临床应用

研发手记
血清胱抑素C是肾小球滤过率优良的内源性标志物，能够准确地反映肾损害程度，逐渐受到临床专家的重视，临床急需该项目的检测方法和检测试剂。因胱抑素C血清浓度较低，测定方法需较高的分析灵敏度及特异性，各种检测的方法也在不断发展。早期有单向免疫扩散法及酶免疫测定法，这两种测定方法操作复杂、耗时长且灵敏度低。随后相继出现较简单灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定方法，在一定程度上改善和提高了测定的简便性和可靠性。上世纪90年代出现了一种夹心酶免疫测定方法法存在污染，未能在临床上得到广泛应用。为满足临床检验的需要，中生北控生物科技股份有限公司在2007年初立项自主研制血清胱抑素C测定试剂盒。
2008年12月至2009年5月，该试剂盒在卫生部北京医院和中国医学科学院阜外心血管病医院完成临床试验，经过严格规范的实验，分别对试剂盒的最低检测限、精密度、测定范围、抗干扰性、相关性等指标进行了临床测试，结果与进口试剂相关性良好。在2009年11月，经过严格的现场考核，研发程序和试剂现场抽样程序，试剂盒顺利通过质量体系考核，为试剂盒完成注册打下良好基础。
CysC因其自身特性越来越多地被用于糖尿病肾病肾脏滤过功能早期损伤的评价、高血压肾功能损害早期诊断、肾移植病人肾功能的恢复情况评估、血液透析患者肾功能改变监测、老年人肾功能评价、儿科肾病的诊断、肿瘤化疗中肾功能的监测等。
糖尿病肾损害是糖尿病严重的慢性微血管并发症，也是糖尿患者的主要死因之一。肾损害在糖尿病早期就已开始，但此阶段病情较隐匿，通常无明显临床症状，而临床实验室常规肾功能检测因灵敏度低难以检出，因此糖尿病早期肾脏损害的发生和发展极易被忽视。临床专家通过比较早期糖尿病患者血清CysC、血肌酐及内生肌酐清除率与GFR的相关性，结果表明CysC与GFR具有更好的相关性，同时ROC评价也表明CysC的分析灵敏度和特异性均好于血肌酐及内生肌酐清除率，认为使用CysC检测可为糖尿病肾损害的早期诊断提供准确可靠的临床检验指标。
2007年4月，此项目正式进入研发阶段。根据文献调研，确定试剂盒的反应原理及剂型。试剂盒利用抗原抗体结合产生凝聚的原理，根据该项目检测灵敏度的要求，采用颗粒增强免疫比浊法液体双试剂剂型。研发人员分别对反应体系中的缓冲系统、抗体原料进行了筛选，确定原料种类、来源及缓冲系统。对标记抗体的制备和反应体系进行优化，最终确定了试剂盒配方。该试剂盒的R2选择纳米级胶体金作为胱抑素C抗体的标记物，在反应过程中标记胱抑素C抗体和血清中的抗原结合而发生凝聚，反应液在特定波长下吸光度发生改变以达到检测目的。经过标记的抗体提高了试剂检测灵敏度，最低检测限达到毫克级，完全满足了临床检测灵敏度的要求。经过全面的性能测试，试剂具有检测范围宽，重复性好，抗干扰性强的特点。试剂应用多点定标和非线性校准，可在全自动生化分析仪上自动完成，检测时间缩短至10分钟以内，极大地方便了临床检测应用。
肾移植患者用血清CysC评价移植肾功能，国外已有较多的研究。已有研究表明CysC在肾移植术后肾功能监测中具有很高的临床应用价值，尤其是术后出现感染时具有早期诊断价值。相比目前临床广泛使用的肾功能监测指标，CysC能更及时、灵敏、准确地反映肾移植术后肾功能的变化，对肾移植术后感染和急性排斥的早期诊断有着明显的优势。
基于CysC的特性和临床应用价值，加之因CysC血清浓度较低，测定方法需较高的分析灵敏度及特异性，检测CysC的灵敏方法也在不断发展。早期有单向免疫扩散法及酶免疫测定法，这两种测定方法灵敏度低。随后相继出现较为灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定方法。这些测定方法都为非均相检测，操作复杂且耗时长，不便广泛临床应用。最近出现了测定CysC的胶乳颗粒增强免疫比浊法，此方法为均相测定，测定时间短，因此该测定方法的研究也成为国内外的研究热点。
已有研究证实CysC血清浓度与肾功能损害程度高度相关，能够准确反映人体GFR的变化。临床专家通过研究血中β2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、CysC浓度与GFR的相关性，发现CysC血清浓度与GFR的相关性最好，认为CysC是低分子量蛋白质中与GFR最相关的内源性标志物，甚至优于血清肌酐。因其基因属于“看家基因”，CysC蛋白具有产生率及释放入血速率恒定，能自由通过肾小球滤过，在近曲小管全部重吸收并迅速代谢分解，不和其他蛋白形成复合物等特点。其血清浓度变化不受炎症、感染、肿瘤及肝功能等因素的影响，与性别、饮食、体表面积、肌肉量无关，是一种反映GFR变化的理想的内源性标志物。
目前临床常用的肾功能检测以血肌酐、尿素氮等检测为主。血清尿素氮首先被作为肾功能的评价指标，但在临床应用中存在一定的缺陷，因为当肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）减少到正常值的40％以前，尿素氮浓度升高缓慢，并且其血清浓度与外源性（蛋白质摄入量）与内源性（感染、肾上腺皮质激素的应用、胃肠出血等）尿素负荷的大小有关；更重要的是肾小管对尿素氮有明显的被动重吸收，因此尿素氮不符合GFR内源性标志物要求。肌酐基本符合内源性GFR标志物的要求，目前国内外仍用血清肌酐作为临床常规评估肾小球滤过功能受损的指标。但只有当GFR下降接近一半时，血清肌酐才有明显的变化，且其血清含量受性别、饮食、肌肉量等因素的影响。因此，肾功能损害的敏感血清学指标的研究一直是临床检验研究的热点之一。
胱抑素C（Cystatin C，简称CysC）亦称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，是一种由120个氨基酸组成，分子量为13kDa的低分子量、碱性非糖化蛋白质。CysC基因在包括肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘等所有组织中持续地转录和表达。研究发现CysC是半胱氨酸蛋白酶抑制物家族的成员之一，是目前发现的对组织蛋白酶B抑制作用最强的抑制物。同时CysC对木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶H及L也有抑制。
高血压所致肾损害是高血压常见并发症，早期干预可改善高血压患者的预后。高血压是通过引起良性小动脉肾硬化而导致高血压慢性肾损害，临床研究表明在良性小动脉肾硬化出现临床症状之前，常规血液及尿液检查都还正常时，CysC血清浓度即出现异常，表明GFR已经改变，慢性肾损害已发生，因此通过检测CysC可为及早干预治疗高血压所致肾损害提供可靠的临床指标。
胶乳颗粒增强免疫比浊法CysC测定是利用血清样品中的CysC与检测试剂中适量的特异性标记抗体结合，形成不溶性的免疫复合物，反应液吸光度改变的大小与样品中的CysC含量呈正相关的原理进行。该方法可在全自动生化分析仪上进行常规血清测定。由中生北控生物科技股份有限公司新近自主研发的颗粒增强免疫比浊法血清CysC液体双试剂测定试剂盒，采用纳米级胶体金标记抗体试剂，有效提高了检测的灵敏度。该试剂盒经过在卫生部北京医院和中国医学科学院阜外心血管病医院严格的临床试验，检测性能与进口试剂盒相关性良好，并已开始临床推广。