液相培训内容

L600系列液相色谱仪培训内容一、基本原理色谱技术是利用待测组分与流动相、固定相之间的作用（分配系数）不同，从而实现分离的过程。

先解释2个名词：1、流动相：顾名思义是在整个系统中处于流动状态的流体。

流动相是液体的叫液相（就是我们今天要学习的这一款仪器），起到运输样品和参与组分分离的作用。

流动相是气体的叫气相，只起运输样品的作用。

2、固定相：是静止不动的一相，装填或涂布于色谱柱内，参与组分分离。

“分离”是色谱区别于光谱仪器最大的特点和作用，一般的光谱仪器只能通过波长等特性从混合物中去选择待测物，一般一次只能检测一种物质；而色谱能够将复杂的混合物逐一分离成单一组分，逐个检测，可以实现多种组分的同时分析，比如我们熟悉的色素，苏丹红1、2、3、4，就可以一针进样同时检测。

二、仪器结构及各部分的使用要点液相色谱一般由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统构成。

下面我们按照这个组成的顺序逐一讲解每一部分的使用要点。

1、输液系统输液系统顾名思义就是用来输送流动相的部分，它包含了“输”和“液”两部分，“输”的部分就是指高压输液泵，它就像我们人体的心脏一样，是一切动力的源头，没有它液体不可能流动。

“液”就是指流动相了，它就像我们人体的血液一样，在泵给与的动力下，运送到整个系统。

下面分别讲解这两部分的使用方法和注意事项。

（1）流动相a、流动相类型：我们一般使用的流动相有三种类型，第一种是纯的有机溶剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等，其中甲醇是最常用的，通常用它来冲洗平衡系统，C18柱在工作完后需要保存在纯甲醇中。

第二种是检测样品用的流动相，根据标准或方法来配置，通常含有缓冲盐。

第三种是10%-20%的甲醇水溶液（比例并不需要非常的准确），它是用于纯有机溶剂与含有缓冲盐的流动相之间的过渡冲洗液，因为缓冲盐溶于水但不溶于有机溶剂，如果不过渡直接更换，就会使缓冲盐在有机溶剂中析出成结晶盐，造成系统的堵塞，尤其是色谱柱，这是不可逆的损坏。

但也不能直接用纯水来做过渡液，这是因为水的表面张力很大，直接用纯水来冲洗，容易造成色谱柱碳链的断裂，就是我们常说的“疏水坍塌”，因此需要在水里面加入一定比例的有机溶剂减少其表面张力，使冲洗过程变得柔和，保护碳链。

b、流动相容器：我们平时需要在液相色谱的顶端流动相盒中至少准备三个瓶子来分别装盛以上三种液体。

当然，如果你的仪器是梯度配置，你可以准备一个装纯水的容器，让仪器自己去将甲醇和水混合形成过渡冲洗液。

装盛流动相的容器必须是玻璃或耐腐蚀的聚四氟乙烯材质，视流动相的性质，需要避光的就装在棕色瓶中。

绝对不允许装在塑料瓶中，因为有机溶剂会溶解塑料制品，杂质进入系统会造成堵塞及鬼峰增多，既损坏仪器，又影响分析。

容器要尽量盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。

容器应定期清洗或更换，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。

c、流动相处理三要素：第一是必须选择高纯试剂，有机溶剂必须是色谱纯级以上的，一般瓶身上都有HPLC标志，尽量选择较好的品牌，因为即使都是色谱纯的试剂，国产和进口的，不同厂家的品质也有差别。

水必须是超纯水，所以实验室最好备有超纯水器，如果没有超纯水器，也至少要购买正品娃哈哈或屈臣氏的纯净水，一般的蒸馏水甚至是重蒸水，都达不到液相分析的要求，如果勉强使用，短期内不是不可以，但肯定会造成色谱柱使用寿命的缩短，也会在一定程度上影响基线噪声。

第二是过滤，尽管我们选择了高纯的试剂，但刚才也说到不同品牌的试剂是有差异的，为了更为保险，上机前，我们都要将流动相使用液相专用的溶剂过滤器进行过滤操作。

过滤要注意滤膜的选择，一般采用0.45um的微孔滤膜，滤膜有有机系和水系之分，要注意根据流动相的种类进行选择，千万不要选错，尤其是不要用水系滤膜去过滤有机溶剂和含有有机溶剂的流动相，原则就是凡是过滤含有有机溶剂的试剂，无论比例多少，我们都采用有机系滤膜，不含的则选用水系滤膜。

第三是脱气，我们一般采用超声脱气20分钟，操作比较简单实用，如果是多种液体混合的，一定是混合后再脱气，千万不要分别脱气了再混合，否则混合之前的脱气工作就白做了，一混合又有气泡了。

d、流动相使用的时间：试剂最好都是临用现制的。

在实验前计算好一天的使用量。

如果有剩余的话，不同的流动相采用不同的做法。

①纯的有机溶剂剩余，就用盖子密封严实，第二天可以接着使用，如果放置了一段时间的有机溶剂，就再经过一次过滤和超声处理再使用。

放置时间太久的试剂建议就不要使用了。

②含水流动相（不含缓冲盐），三天内可以使用。

三天后建议不再使用，重新配置。

③含有缓冲盐的流动相，必须现用现配，最好当天使用完，如果实在配制太多，顶多不能使用超过两天。

（2）高压输液泵：泵头部分我们需要操作的地方主要有两个，一是排空阀，每当更换流动相，或发现管路里有气泡时，都需要打开排空阀进行排空操作。

排空一般用3-5ml/min的流速，运行3-5min，具体流速和时间视气泡多少而定。

二是泵头在线密封清洗，它的作用是减少泵头缓冲结晶盐析出的机率。

如果您的流动相是含有缓冲盐的，就在每天实验结束后，利用冲洗系统和色谱柱的这段时间进行泵头的清洗，将清洗管进液端插入10%-20%甲醇水溶液中，用吸耳球从排废管末端将液体吸出，管路会依靠重力的作用持续流动清洗，大约冲洗20-30min即可。

检漏：从泵到色谱柱之前都是处于高压的部分，在高压的状态下，如果螺钉没有拧紧就会有漏液的情况，所以我们要不时地查漏。

查漏的方法是用定性滤纸边缘对准每一个螺母接头等地方试探，看有没有液体浸润滤纸，如果有漏的话，滤纸很容易就润湿了，很容易观察到。

2、进样系统我们通常用的进样装置是六通进样阀，它的阀位有两档，load是准备阶段，用于我们将样品注入定量环，inject是进样阶段，让流动相将样品带入色谱柱。

关于进样我们要注意以下几点：（1）新的六通阀进样器最好用甲醇和色谱用纯水清洗，以保证不会带入杂质。

（2）样品要经过0.45um的针式过滤器过滤后才能打入系统，针式过滤器也有水系和有机系之分，选择的原则同样是看溶解样品的溶剂是否含有有机溶剂，如果含有则用有机系，反之则用水系。

（3）我们使用的进样针是液相专用的平头进样针，千万不要用成气相用的尖头进样针，否则会损坏六通阀。

（4）为了使样品能够充分的充满定量环，我们的取样量应该是定量环体积的三倍以上，例如我们的定量环是20uL时，我们至少应该吸入60uL以上的样品打入，多余的样品会从废液管流出。

（5）进样针吸取样品时很容易吸入气泡，要像护士打针一样将针管中的气泡排出，然后用滤纸将针头上残留的液体轻轻吸干，才能打入定量环，注样前务必检查六通阀是否处于load状态。

（6）注样时针头一定要稍用力插到底。

（7）掰阀时一定要迅速，中间更不能停留。

（8）掰阀至inject进样后，不必将进样针立即拔出，也不必将阀立即掰回到load状态，可以让它维持至这一针分析即将结束，准备进下一针之前再将阀掰回并取出进样针。

在这个过程中，流动相可以同时清洗定量环。

（9）每天工作结束后，要充分清洗进样阀，可以利用附件箱中白色大针筒，吸取一定量的清洗液，套上六通阀自带的白色平头针头，在load状态下，缓慢注入定量环来进行清洗。

清洗液一般可以用甲醇、异丙醇等有一定洗脱强度的有机溶剂，如果样品的溶剂也是含有缓冲盐的，那么也请先用10%-20%的甲醇水溶液过渡性清洗后，再用纯的有机溶剂清洗，同样也是为了减少结晶盐的析出。

（10）每天工作结束后，要充分清洗进样针，清洗液的选择同上（9）。

清洗完毕后保存到针盒中，避免跌落损坏。

3、分离系统液相色谱的分离系统主要就是指的色谱柱，在这里我们主要针对常用的C8、C18反相色谱柱，如果您使用的是正相色谱柱，使用和维护请参照具体的使用说明。

反相色谱柱的维护注意以下几点：（1）色谱柱的安装是有方向性的，请按照色谱柱身上的箭头指示方向安装，切勿装反了。

否则容易损坏色谱柱。

（2）每天开机要充分平衡色谱柱，如果测样流动相是含有缓冲盐的，请先用10%-20%的甲醇水溶液冲洗30分钟以上，再用测样流动相平衡至基线平稳即可做样。

如果测样流动相不含缓冲盐，则可以直接用测样流动相平衡至基线平稳即可做样。

（3）每天实验结束后要充分清洗色谱柱，如果测样流动相是含有缓冲盐的，请先用10%-20%的甲醇水溶液冲洗30分钟以上，再用纯甲醇冲洗30分钟以上才能关机。

如果测样流动相不含缓冲盐，则可以直接用纯甲醇冲洗30分钟以上即可关机。

（按照我们通常使用的1ml/min的流速，一般色谱柱需要20-30分钟才能置换掉之前的溶液，因此每换一种流动相时都需要走至少30分钟以上）。

（4）长时间不用时，请将色谱柱在充满甲醇的状态下拆下，两端用堵头封好，装入色谱柱盒内保存，避免跌落损坏。

同时将仪器上连接色谱柱两端的不锈钢管接头用保鲜膜封好即可。

（5）再次安装色谱柱时，请先运行泵，使液体充分流经柱前端的管路，待有液体流出后，再装上色谱柱，避免空气挤入柱内。

4、检测系统检测器我们基本没有需要操作的地方，但要注意实验室的湿度环境，太潮湿的环境，检测器中的光学部件容易发霉，造成使用异常。

5、数据处理系统数据处理系统主要是指我们的色谱工作站，工作站本身没有需要维护的地方，在这里详细描述具体的使用方法。

开机前请确保溶剂瓶中已装好流动相，并且都经过了过滤和超声脱气处理，进液管已插入溶剂瓶中位于液面以下。

在运行的过程中要时刻注意流动相的用量，不够时及时添加。

（1）启动：开机，将您所要使用的仪器的电源全部打开，然后鼠标双击电脑桌面上的液相软件图标，打开色谱工作站。

进入用户管理登陆界面（如图1），默认的用户名是“admin”，密码是“000”。

您还可以通过“用户管理”程序重新设置用户及权限图1 登陆界面进入液相色谱工作站主界面后，可以看到8个功能模块（如图2）。

其中我们日常最常用的是“控制采集”和“数据分析”，用于仪器的控制、色谱图的采集、色谱图的分析及报告的打印。

偶尔会用到“报告编辑”和“用户管理”，用于报告模板的编辑及用户权限的设置。

其他模块，基本用不到。

图2 工作站主界面（2）打开“控制采集”界面：单击“控制采集”按钮，按钮变蓝，然后单击界面右下角的“启动”按钮，出现“仪器自检”界面（如图3）。

图3 仪器自检仪器自检全部通过并经过参数的初始化后，直接进入到“控制采集”界面（如图4）。

图4 控制采集界面（3）排空：手动旋开泵的排空阀，将鼠标放在flash图表示泵的部分并单击鼠标右键，选择“冲洗”，弹出冲洗控制对话框（如图5），设定“冲洗流速”和“冲洗时间”（排空一般用3-5ml/min的流速，运行3-5min，具体流速和时间视气泡多少而定），单击确定。

到达设定的时间，此操作将会自动停止，停止后手动拧紧泵的排空阀。