氨基甲酸乙酯的研究进展_高年发

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｊｅｏｐａｒｄｙ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ（ＥＣ）ｗａｓ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｓｏｃｉａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔ ａｓ ａ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ． Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ＥＣ ｗａｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｔｏ ｂｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄ： ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ； ｃｏｎｔｅｎｔ； ｍｅｃｈａｎｉｓｍ； ＧＣ／ＭＳ； ｓｕｍｍａｒｙ
通过对体内氨基甲酸乙酯的代谢途径的研究可知 有３种途径：第一超过９０％的氨基甲酸乙酯可被分解为 乙醇、氨和碳水化合物等（这种途径是无毒性的）；第二 约０．５％的氨基甲酸乙酯被细胞色素Ｐ４５０氧化成ＤＮＡ加 聚物，造成ＤＮＡ双链破坏，可导致癌变；第三种途径较 为普遍，即约０．１％的氨基甲酸乙酯被细胞色素Ｐ４５０氧 化为Ｎ－羟基－氨基甲酸乙酯，后者能够诱导Ｃｕ２＋调控的ＤＮＡ 损伤，这种损伤多发生于胸腺嘧啶（Ｔ）和胞嘧啶（Ｃ）的 残基上。大多数认为第三种途径是氨基甲酸乙酯的主要 致癌途径。 ３ 氨基甲酸乙酯的检测方法
２０世纪７０年代Ｏｕｇｈ证明了ＥＣ可以由氨甲酰磷酸和 乙醇反应形成。酵母中的ＡＴＰ、ＣＯ２和铵在氨甲酰磷酸合 成酶作用下生成氨甲酰磷酸。反应式如下：
Ｈ２ＮＣＯ２ＰＯ３Ｈ２＋Ｃ２Ｈ５ＯＨ→Ｈ２ＮＣＯ２Ｃ２Ｈ５＋Ｈ３ＰＯ４
经过实验得出氨基甲酸乙酯的生成量与乙醇的浓 度成正比。在进一步的研究中发现葡萄酒和黄酒中ＥＣ 的形成并不主要是靠上述途径的。 １．４ 尿素和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯［１］
Ｏ（ＣＯ２Ｃ２Ｈ５）２＋ＮＨ３→Ｈ２ＮＣＯ２Ｃ２Ｈ５＋ＣＯ２＋Ｃ２Ｈ５ＯＨ
１．２ 由氰化物和乙醇反应而生成氨基甲酸乙酯［４］ 有研究结果表明蒸馏酒如白兰地中ＥＣ的形成首先
是氢化物被氧化成氰酸，然后氰酸和乙醇反应而产生 ＥＣ，反应如下：
ＨＮＣ→ＨＯＣＮ ＨＯＣＮ＋Ｃ２Ｈ５ＯＨ→Ｈ２ＮＣＯ２Ｃ２Ｈ５
发酵过程中存在于植物中的氰化物（或氰）参与了 ＥＣ的形成反应。反应过程中乙醇、连二碳基化合物和光 线起了作用，氧气也是ＥＣ形成过程中必需的，ＥＣ在贮存 过程中逐渐形成，特别在见光后也会形成。 １．３ 由氨甲酰磷酸和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯［４］
通过对黄酒的研究发现，黄酒中９０％的氨基甲酸乙 酯也是由尿素和乙醇反应生成的。尿素的浓度、乙醇含量、 反应温度、ｐＨ值和时间都与氨基甲酸乙酯的生成量有关。 尿素浓度高、反应温度高、反应时间长及ｐＨ呈微酸性都会 使氨基甲酸乙酯的含量增加。黄酒酿造时，原料、辅料和 水中会带入部分尿素，但最主要的还是在发酵过程中由 酵母菌代谢产生的。酵母菌在生长繁殖和进行酒精发酵 时，合成的大量尿素除了满足自身菌体需要外，多余的尿 素被分泌到体外，从而使酒中的尿素含量增加，酵母菌细 胞内的精氨酸酶的活力也会随之提高，进一步加速了尿 素的生成。黄酒中尿素主要由精氨酸经酵母菌细胞内精 氨酸酶一尿酶（ＡＵ）途径分解而来，酵母菌处于生长繁 殖状态时精氨酸降解及尿素的形成过程如下：
随着我国人民生活水平的提高，酒饮料的消费量日 趋上升，尤其是葡萄酒、米酒、啤酒等营养丰富的含酒 精饮料更是人们消费的热点，因此制定ＥＣ限量标准势 在必行。
收稿日期： ２００６－０３－２０ 作者简介： 高年发（１９４５－），男，江苏吴江人，教授，博士生导师，主要从事有机酸发酵和葡萄酒酿造工艺的研究。
２００６ Ｎｏ．９
世 界 卫 生 组 织 对 软 饮 料 中 ＥＣ 制 定 了 限 量 标 准 。 １９８５年，加拿大报道了 某 些 酒 中 ＥＣ 含 量 高 ，同 年 加 拿 大 政 府 的 卫 生 与 福 利 组 织 规 定 了各类酒中的ＥＣ限量 标准：佐餐葡萄酒３０!ｇ／Ｌ，强化葡萄酒１００!ｇ／Ｌ，蒸馏酒 １５０!ｇ／Ｌ，烈 性 酒 、水 果 白 兰 地 ４００!ｇ／Ｌ，日 本 清 酒
ＧＣ／ＭＳ 接 口 温 度 为 ２２０ ℃，质 谱 检 测 器 工 作 参 数 为：用全氟三丁胺样进行手动调谐，使低质量数的灵敏 度最高，选择离子检测方式，使用延迟至２２ｍｉｎ，开始离 子检测，单离子检测时间为１００ｍｓ，通过设定质量ｍ／ｚ６２ 的ＥＣ－ｎＰＣ的相应峰面积比，用内标物标准曲线计算洗脱 液中ＥＣ的浓度，用洗脱液中ＥＣ的量（μｇ／ｍＬ）除以测试 样 品 的 重 量（ｇ）可 计 算 出 测 试 样 品 中 ＥＣ 的 含 量（μｇ／Ｌ）。 ＧＣ／ＭＳ法的应用根据情况不同，可采用不同的实验参 数，以上所述是我国进出口检验行业标准所采用的。 ３．２ 固体微萃取＋ ＧＣ／ＭＳ［８］
１００!ｇ／Ｌ。美国的葡萄酒工业也对葡萄酒中ＥＣ含量做出 了限定：佐餐葡萄酒１５!ｇ／Ｌ，餐后甜葡萄酒６０!ｇ／Ｌ［１］。氨 基甲酸乙酯已经成为２００２年联合国粮农组织重点监控 物质，并制定了国际标准，其含量不得超过２０!ｇ／Ｌ。我 国在酒精饮料和发酵食品中尚未制定氨基甲酸乙酯限 量标准，也没有引起足够的重视。２００５年日本学者对上 百种清酒和烧酒中的ＥＣ含量进行了测定。普通清酒中 ＥＣ平均含量为４７!ｇ／Ｌ，最大２１０!ｇ／Ｌ；储存３年以上的清 酒中ＥＣ平均含量为１８３!ｇ／Ｌ，最大为１１００!ｇ／Ｌ；烧酒中 ＥＣ含量最大为３７!ｇ／Ｌ。合成清酒中的ＥＣ含量均低于日 本限量标准（２０!ｇ／Ｌ）［３］。
专论与综述
中国酿造
２００６ 年 第 ９ 期
总第 １６２ 期
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３．１ 二氯甲烷吸附＋色谱／质谱（ ＧＣ／ＭＳ法） ［５－７］ 该法是先将ＥＣ吸附到二氯甲烷液体中再用ＧＣ／ＭＳ
法分析ＥＣ。方法是精确称取（１０±０．０１）ｇ的液体样品置于 １００ｍＬ烧杯中，加入１ｍＬ ｎ－氨基甲酸丙酯作为内标液，然 后加入蒸馏水到４０．００ｇ，将此液体移入内填有Ｅｘｔｒｅｌｕｔ ＱＥ ｃｅｌｉｔｅ的固相抽提柱中，用８０ｍＬ二氯甲烷进行洗脱， 收集洗脱液，用旋转蒸发器在３０℃水浴中将洗脱液浓缩 为２ｍＬ￣３ｍＬ，再用氮气将其浓缩至１ｍＬ，将浓缩液移入 自动进样瓶中，用于ＧＣ／ＭＳ分析。
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Ｓ ｅｒｉａｌ Ｎｏ．１６２
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅ ｗｉｎｇ
Ｆｏｒｕｍ ａｎｄ Ｓｕｍｍａｒｙ
１ 氨基甲酸乙酯的形成机理 １．１ 由焦碳酸二乙酯和氨反应形成氨基甲酸乙酯［１］
早在２０世纪６０年代研究者发现焦碳酸二乙酯可用 于杀死葡萄酒中的酵母、细菌，并且发现了葡萄酒中存 在焦碳酸二乙酯与氨的反应。到了２０世纪７０年代时， Ｌｏｆｒｏｔｈ和Ｇｅｊｖａｌｌ发现在含有氨的白葡萄酒中，加入焦碳 酸二乙酯会产生ＥＣ。反应式如下：究者对精氨酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在
葡萄酒汁发酵过程中对ＥＣ形成的影响进行了研究，结 果表明，ＥＣ的主要来源是由精氨酸分解而产生的尿素， 由尿素形成的ＥＣ远多于由氨甲酰磷酸形成的ＥＣ，由尿 素形成的ＥＣ量是成品葡萄酒中ＥＣ含量的绝大部分，因 而形成ＥＣ的主要前体物质是尿素。研究表明，在葡萄汁 中、发酵过程以及贮藏过程中，都存在形成ＥＣ的前体物 质。在葡萄酒的贮藏过程中，仍存在乙醇和尿素形成ＥＣ 的反应，但此阶段形成的ＥＣ的速度较慢。
我国进出口商品检验行业标准ＳＮ ０２８５－９３中，出口 酒类中氨基甲酸乙酯残留量检测采用二氯甲烷提取，然 后进行ＧＣ／ＭＳ分析，该方法回收率低，色素等杂质多； 国外多采用固相提取净化技术进行样品提取。采用固相 萃取技术对酒精饮料中氨基甲酸乙酯进行提取净化，然 后用ＧＣ／ＭＳ进行定性、定量分析的方法精度和效率都 有了很大提高。 ３．３ 用二维或多维色谱－稳定同位素稀释质谱联用技术
专论与综述
中国酿造
２００６ 年 第 ９ 期
总第 １６２ 期
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氨基甲酸乙酯的研究进展
高年发， 宝菊花
（ 天津市工业微生物重点实验室 天津科技大学生物工程学院， 天津 ３００２２２）
摘 要： 对氨基甲酸乙酯的危害、形成机制、分析和消除方法进行了综述，应加强对氨基甲酸乙酯这种致癌物质的认识，引起社会 的关注。倡导建立氨基甲酸乙酯的限量标准。 关 键 词： 氨基甲酸乙酯；含量；形成机制；ＧＣ／ＭＳ；综述 中图分类号： Ｑ９３９．９７ 文献标识码： Ａ 文章编号： ０２５４－ ５０７１（ ２００６ ） ０９－ ０００１－ ０４
谷氨酸
ＡＵ ↓
→
ＨＣＯ３↓－ ＡＴＰ
Ｏ
‖
精氨酸→鸟氨酸＋尿素→ＣＯＯＨ─ＨＮ─Ｃ─ＮＨ２→２ＨＮ３ ＋ ２ＣＯ２
↑
↓↓
精氨酸磷酸 ←瓜氨酸 生长必需
１．５ 由瓜氨酸和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯［１］ 目前普遍认为瓜氨酸是氨基甲酸乙酯形成的前体
物。但也有研究结果表明，葡萄汁中ＥＣ形成的数量并不 和瓜氨酸含量呈线性关系。需进一步研究。 ２ 氨基甲酸乙酯的致癌机理［２］
对氨基甲酸乙酯的研究早在２０世纪中期开始。２０世 纪 ４０ 年 代 ，Ｎｅｔｔｌｅｓｈｉｐ 实 验 证 明 了 氨 基 甲 酸 乙 酯（ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ；ｅｔｈｙｌ ｕｒｅｔｈａｎｅ；ｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，简称 为ＥＣ）具有致癌作用。其可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、 皮肤癌等。现今ＥＣ被广泛用于工业涂料及动物麻醉［１］。 氨基甲酸乙酯不仅是烟草叶及香烟的天然成分，也是发 酵食品（如面包，酸牛奶，乳酪、酱油等）和酒精饮料（如 葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等）的副产物。人 体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料。调查 显 示 ，如 果 饮 用 氨 基 甲 酸 乙 酯 含 量 超 过 ３０ ×１０－６ｇ／Ｌ的 酒，人饮用后患癌的机率大大增加。根据加利福尼亚环 保机构的一项统计数据得知，假设每个人的患癌症的机 率 为 １ ×１０－５，可 推 断 氨 基 甲 酸 乙 酯 的 摄 入 量 大 约 为 ０．７!ｇ／ｄ［２］。可见氨基甲酸乙酯是危害人类健康的一个不 可忽视的因素。
先将样品用固体微萃取法吸附样品中的氨基甲 酸乙酯，然后用色谱／质谱方法检测样品中的含量。
首先提取２．０ｍＬ的样品，加到ＳＬＥ固相萃取柱上，静置 使之吸附１０ｍｉｎ，用１０ｍＬ正己烷淋洗除杂，然后用１０ｍＬ 乙醚将氨基甲酸乙酯洗脱收集，将洗脱液在３０℃下氮气吹 干，然后用无水乙醇定容至０．５ｍＬ。采用ＧＣ／ＭＳ方法测量。