流式细胞术

流式细胞术

流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。

流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。

基本信息

中文名称:流式细胞术

外文名称:Flow Cytometry, FCM

优点:速度快、精度高、准确性好等

作用快速测定细胞或细胞器生物学性质

特点:1.测量速度快；2.可进行多参数测量

最高速度:每秒钟3万个细胞

4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。

工作原理

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

应用范围：

随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免

疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的识别和艾滋病感染者T4、T8细胞的计数。

自70年代以来，随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。

1.在肿瘤学中的应用

这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。

(1)发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断：人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。

(2)在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用：FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。

FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从

DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。

此外FCM近几年还被应用于细胞凋亡和多药耐药基因的研究中[3，4]。医学工作者开始研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因，FCM对多药耐药基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。

2.在临床中的作用

FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。有大量文章介绍了淋巴细胞亚群等在各种疾病中的变化。正常人群淋巴细胞T4/T8比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应，如果T4/T8比例倒置，病人预后良好，较少发生肾排异现象；反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于艾滋病的诊断和治疗中。还有作者报告了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值，并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨。

目前FCM用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种，可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。

3.在血液病诊断和治疗中的应用

∙FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。

∙(1)白血病的诊断和治疗：FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体，借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC，藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用[6]。例如干细胞表达CD34，髓系表达CD13、CD14，B细胞系表达CD10、CD19、CD20等，T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平，协助临床确诊。同其它肿瘤的治疗一样，测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用，不同的白血病患者或