微机模拟蛋白质纯化实验

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蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

百泰派克生物科技
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
在蛋白组学研究中，如果要对某一混合体系中的蛋白质进行定性或定量分析，就需要先对蛋白组分进行分离、纯化，然后再进行后续的鉴定分析。

这一系列实验环环相扣，每一步都至关重要，直接影响实验结果的准确性。

理想的蛋白质分离技术首先要有超高的分辨率，能够将成千上万不同类型的蛋白质包括它们修饰物进行有效的分离。

目前常用的蛋白质分离技术包括一维/二维凝胶
电泳技术、双向电泳技术以及凝胶色谱技术等。

经分离的蛋白质需要进行纯度检测来评价是否含有其他杂蛋白或者杂质，通常利用聚丙烯电泳法、免疫化学法、沉降速率测定法、色谱法、质谱法等进行纯度检测。

对于含有杂质的蛋白需进行纯化，如含有核酸、糖类或脂类杂质，可以利用核酸沉淀法或有机溶剂沉淀法对杂质进行去除。

对蛋白质进行鉴定主要是基于其基本的理化参数对其进行鉴定，包括相对分子量、等电点、翻译后修饰、氨基酸序列以及高级结构等，可以选择单一的性质进行鉴定，也可以进行全面分析，根据实验需求进行选择。

百泰派克生物科技基于先进的质谱仪以及专业的技术团队提供蛋白质分离纯化及鉴定一站式技术服务，包括蛋白样品分离、纯化、纯度鉴定以及定性和定量鉴定，还可提供定制化分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。

计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践报告(10号蛋白)

计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践报告姓名：学号：班级：成绩：一、计算机模拟实验初始条件：样品号：10样品稳定的条件：10号样品在pH3.5～11.5稳定；温度< 69°C稳定。

二、计算机模拟“蛋白质纯化”实验内容：（1）粗分离（盐析）硫酸铵饱和度沉淀蛋白(mg)沉淀酶活力(U)上清蛋白(mg)上清酶活力(U)沉淀比活力(U/mg)上清比活力(U/mg)酶回收率纯化倍数8%498 9800100% 1.0 9% 497.9 975799.8% 1.0 10% 497.5 958698.9% 1.0 18% 89.9 9029 100.4396.2% 5.1 19% 105.6 9543 90.3798.9% 4.6 20% 117.3 9713 82.8099.8% 4.221%126.1 9757 77.38100% 3.9计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践时间：20 年月日如表格中所示，根据相关理论及实验经验，选择了从8％硫酸铵饱和浓度起进行梯度盐析测定，经过数据对比，最终选择9％作为除杂（取上清液）的“低浓度”，因为该浓度下上清中酶的比活力和纯化倍数较相近浓度而言具有优势。

在选定低浓度并进行取上清液步骤后，我们就开始对选择高浓度。

同样地经过数据对比，最终选择了20％作为把绝大部分目标蛋白沉降的“高浓度”，其原则也是要保证在比活力和纯化倍数大的情况下，选择比活力最大的硫酸铵浓度。

注：比活力(U/mg)＝酶活力(U)：蛋白质量(mg)。

选择了9％和20％这两个浓度后，我们开始正式的盐析过程，即先在9％浓度下取上清液，然后20％浓度下取沉淀。

具体操作及所取上清/沉淀数据（如图1）。

图1 盐析结果计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践时间：20 年月日（2）细分离（各种纯化技术条件及结果）阴离子交换层析：Start conc设为0 M，End conc设为0.6M，Equilibration ph（平均PH）设为6，用100％的样品去进行跑样层析（如图2）。

微机模拟蛋白质纯化实验报告

微机模拟蛋⽩质纯化实验报告微机模拟蛋⽩质纯化实验⼀、实验⽬的：1. 了解模拟⽣化⼲实验的⽅法和意义，掌握⽤protein软件提纯蛋⽩质的⽅法。

2. 进⼀步熟悉层析、热变性、盐析等常⽤⽣化分离⽅法的原理和应⽤。

⼆、实验原理：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋⽩。

任务要求利⽤软件提供的⼏种实验技术，提纯每⼀个⽬的蛋⽩，最终达到单向电泳⼀条带，双向电泳⼀个点，⽽且使⽤的⼈时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过⼀个特定值。

在每个任务开始时，软件给出⽬的蛋⽩的⼀些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利⽤这些信息，可以使实验少⾛弯路。

“Protein”提供的分离纯化⽅法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶⾊谱)；④离⼦交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。

在“Protein”所提供的各种分离纯化⽅法中，热变性法和盐析法是⽐较好的粗提⽅法，在提纯的早期使⽤效果较好。

层析是各种⽅法中最强有⼒的⽅法，制备电泳虽然纯化倍数⾼，但是回收率低。

在各种层析⽅法中，⼜以离⼦交换层析最为有效和易于使⽤，并且耗费的⼈时和经费也较少。

排层层析和聚焦层析耗费较⼤，但在某些特定情况下，这两种⽅法是不可替代的。

“Protein”提供了四种电泳⽅法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。

这些电泳⽅法不但可以⽤以检测样品的纯度，⽽且也给出了样品的⼀些信息，如分⼦量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以⽤于制备。

本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。

1 酸性条件下稳定的蛋⽩（Windows 3号酶）3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）。

分离纯化步骤:1 热变性：⽔浴温度61℃，⽔浴时间60min2 离⼦交换：然后进⾏PAGE和SDS-PAGE检测结果分析：在检测时出现两条带的时候可能是由于蛋⽩质的含有两个亚基。

蛋白质纯化实验方案与应用

蛋白质纯化实验方案与应用1. 引言蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们参与调节细胞功能、传递信号、催化反应等生命活动。

为了全面了解蛋白质的功能和结构，需要进行蛋白质的纯化实验。

蛋白质纯化是从细胞提取蛋白质并去除其他成分的过程，通过纯化蛋白质可以获得高纯度的样品，便于后续的结构和功能研究。

本文将介绍常用的蛋白质纯化实验方案及其应用。

2. 蛋白质纯化的步骤蛋白质纯化可以分为几个关键步骤，包括细胞破碎、溶液处理、分离纯化和纯化蛋白质的检验。

2.1 细胞破碎细胞破碎是蛋白质纯化的第一步，目的是破坏细胞膜并释放蛋白质。

常用的方法有机械破碎、超声波破碎、冻融法等。

机械破碎是将细胞悬浮液通过高速离心等手段分离得到上清液，其中含有蛋白质。

超声波破碎则是利用超声波的机械作用产生震荡，破坏细胞膜。

冻融法则是通过多次冻结和融解来破坏细胞膜。

2.2 溶液处理在细胞破碎之后，需要对样品进行溶液处理，包括调节pH值、添加蛋白质稳定剂和抗菌剂等。

调节pH值可以提高纯化效果，一般在6-8之间为宜。

蛋白质稳定剂可以保护蛋白质避免其降解和失活，常用的有甘油、甜菜碱、牛血清白蛋白等。

抗菌剂可以防止细菌污染，常用的有氨基苄青霉素、氯霉素等。

2.3 分离纯化分离纯化是蛋白质纯化的核心步骤，其目的是将目标蛋白质与其他杂质进行有效的分离。

常见的分离纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、凝胶电泳等。

离子交换层析是通过蛋白质与离子交换树脂之间的相互作用来分离目标蛋白质。

树脂上的固定的功能基团可以选择性地结合目标蛋白质，而其他杂质则被排除。

凝胶过滤层析是利用凝胶孔径的不同分离蛋白质，大分子量的蛋白质会被滞留在凝胶中，而小分子量的蛋白质则通过。

亲和层析是利用蛋白质与某些特定配体之间的特异性结合来分离目标蛋白质。

配体可以是金属离子、抗体、某些亲和剂等。

凝胶电泳是根据蛋白质在电场中的迁移速度不同来分离目标蛋白质。

凝胶电泳可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦电泳（IEF）等方法进行。

蛋白共纯化实验报告

1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。

2. 掌握利用亲和层析法进行蛋白质共纯化的技术。

3. 通过实验验证蛋白质共纯化的效果。

二、实验原理蛋白质共纯化是指从混合蛋白质样品中同时分离和纯化两种或两种以上的目的蛋白。

亲和层析法是蛋白质共纯化常用的技术之一，其原理是利用蛋白质与特定配体的亲和力，通过柱层析将目的蛋白从混合样品中分离出来。

三、实验材料1. 试剂：亲和层析柱、亲和配体、洗脱液、样品缓冲液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝染色液等。

2. 仪器：离心机、层析柱、凝胶成像仪等。

四、实验方法1. 准备亲和层析柱：将亲和配体固定在层析柱上，制成亲和层析柱。

2. 样品处理：将混合蛋白质样品加入亲和层析柱，进行预平衡。

3. 亲和层析：将样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。

4. 洗脱：用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。

5. 检测：将洗脱液进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的纯度。

6. 收集目的蛋白：将SDS-PAGE凝胶上的目的蛋白条带切割下来，进行后续处理。

五、实验结果与分析1. 亲和层析柱制备成功，亲和配体固定在层析柱上。

2. 样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。

3. 用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。

4. SDS-PAGE分析结果显示，洗脱液中含有目的蛋白，且纯度较高。

通过亲和层析法进行蛋白质共纯化实验，成功分离和纯化了两种目的蛋白，验证了实验方法的有效性。

七、实验注意事项1. 亲和层析柱制备过程中，要注意配体的固定量和固定效果。

2. 样品处理过程中，要确保样品溶液的浓度适宜，避免样品过浓或过稀。

3. 亲和层析过程中，要注意控制洗脱液的pH值和离子强度，以保证目的蛋白的稳定性。

4. 实验过程中，要注意层析柱的清洗和保存，避免污染。

5. 实验结束后，要对实验数据进行整理和分析，总结实验结果。

蛋白质分离纯化及实验技术

第一节能用作纯化依据的蛋白质性质
1 大小 2 形状
8 密度 9 配体结合能力
3 电荷
10 金属结合能力
4 等电点
11 可逆性缔合
5 电荷分布 12 特异性序列或结构
6 疏水性 7 溶解度
13 非寻常性质 14 基因工程构建的纯化标记
蛋白质分离纯化及实验技术
1. 大小蛋白质的大小各不相同，可从含几个氨基酸的小肽（几百个Da）至含10 000多个氨基酸（上百万个Da）的巨大蛋白质不等。多数蛋白质的分子量在10 000—150 000Da之间。
蛋白质分离纯化及实验技术
15. 基因工程构建的纯化标记随着基因工程技术的进步，克隆编码某一蛋白质的cDNA已变得比较容易。通过改变cDNA 而在被表达蛋白质的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的“标记”可用来作为一种有些的纯化依据。最通行的标记之一是在蛋白质的氨基端加上 6—10个组氨酸，这样可以使肽链能与Ni2+螯合柱紧密结合，经洗脱，再用游离咪唑洗脱或通过将pH降至5.9，使组氨酸充分质子化，与Ni2+分离而使蛋白质得以纯化。
8. 密度多数蛋白质的密度在1.3—1.4g/cm3之间。分级分离蛋白质时一般不用这个性质。但是，在含有大量磷酸盐（如卵黄高磷蛋白，密度为1.8）或脂质部分（如脂蛋白，密度为1.03）的蛋白质，与一般蛋白质在密度上确有不同，可用密度梯度法将它们从大部分蛋白质中分离出来。
蛋白质分离纯化及实验技术
蛋白质分离纯化及实验技术
（一）前处理
1、选材 2、破碎 3、混合物的分离
蛋白质分离纯化及实验技术
（二）粗分级分离
（1）盐析（2）等电点沉淀（3）有机溶剂分级分离（4）超滤（5）凝胶过滤（6)冷冻干燥

纯化蛋白,实验总结

实验汇总实验内容1近两周主要做了肿瘤多肽疫苗Vbp3的诱导表达和纯化以及鉴定实验。

2学习培养细胞一些技能，给细胞换液并传代，自己培养了一瓶E3细胞，并学习处理细胞，传代，计数。

学习使用倒置显微镜观察细胞，以及细胞实验室的一些注意事项。

3 取得杂交瘤细胞，然后我给小鼠注射，每只0.5ml制备抗体用。

实验结果1先培养了菌株进行原核表达多肽，经过表达后SDS-PAGE电泳鉴定可以得出目的蛋白得到了表达。

通过与Maker对比可以看出有目的蛋白表达。

2然后进行超声破碎菌体，使表达的蛋白裂解，然后进行洗脱纯化。

洗脱液的浓度梯度分别为5mM 咪唑，20 mM 咪唑，80mM 咪唑，250 mM 咪唑，500mM 咪唑。

通过SDS-PAGE电泳鉴定出，在250 mM 咪唑处有目的蛋白被洗脱出。

如下图所示：Maker 样品PBS洗脱5Mm 20 mM 80 mM 250 mM 500mM 250Mm图中开始加的为maker，然后为裂解后未洗脱的样品，然后pbs,接着是不同浓度的咪唑洗脱下来的蛋白。

在不同浓度洗脱液的紫外峰值分别为：3以bFGF 为抗原包板做ELISA实验，以鼠单抗和人源化抗体为一抗，以羊抗鼠酶标抗体为二抗，进行检测鼠单抗的效价。

结果如下表所示：Measurement count: 1 Filter:4501 2 3 420000 0.121 0.121 2.563 2.733 0.121 2.648 0 0.120208 40000 0.105 0.116 2.52 2.533 0.1105 2.5265 0.007778 0.009192 80000 0.11 0.131 2.15 1.93 0.1205 2.04 0.014849 0.155563 160000 0.084 0.084 1.361 1.654 0.084 1.5075 0 0.207182 320000 0.109 0.131 0.824 1.082 0.12 0.953 0.015556 0.182434 640000 0.112 0.113 0.578 0.632 0.1125 0.605 0.000707 0.038184 1280000 0.115 0.126 0.429 0.423 0.1205 0.426 0.007778 0.004243 2560000 0.111 0.12 0.112 0.082 0.1155 0.097 0.006364 0.021213ELISA 结果结果分析图标准误差图图中1，2中一抗为人源化抗体，3，4中一抗为鼠单抗。

关于纯化的实验报告

一、实验目的1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。

2. 掌握蛋白质纯化的操作技术。

3. 了解蛋白质纯度的鉴定方法。

二、实验原理蛋白质纯化是指从复杂的蛋白质混合物中分离出目标蛋白质的过程。

常用的蛋白质纯化方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

本实验采用盐析法对蛋白质进行初步纯化，并通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色对纯化效果进行鉴定。

三、实验材料1. 蛋白质样品：酶溶液、标准蛋白质样品2. 试剂：硫酸铵、SDS-PAGE电泳缓冲液、考马斯亮蓝G250、Tris-HCl、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、琼脂糖、双蒸水等3. 仪器：电泳仪、紫外观察分析仪、离心机、移液器、烧杯、玻璃棒、滴管、剪刀等四、实验步骤1. 盐析法纯化蛋白质（1）将酶溶液与硫酸铵溶液按照一定比例混合，室温静置一段时间。

（2）离心分离，收集沉淀。

（3）将沉淀用双蒸水洗涤，去除杂质。

（4）将洗涤后的蛋白质沉淀溶解于适量的双蒸水中，得到初步纯化的蛋白质溶液。

2. SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果（1）配制10%的琼脂糖凝胶，加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液。

（2）将标准蛋白质样品和纯化后的蛋白质样品进行电泳分离。

（3）关闭电源，取出琼脂糖凝胶，用考马斯亮蓝G250染色。

（4）观察电泳图谱，比较纯化前后蛋白质的条带变化，判断纯化效果。

五、实验结果与分析1. 通过盐析法纯化蛋白质后，SDS-PAGE电泳图谱显示，蛋白质条带较纯化前明显减少，表明蛋白质纯化效果较好。

2. 纯化后的蛋白质条带与标准蛋白质样品的条带基本一致，进一步说明纯化效果良好。

六、实验结论本实验通过盐析法对蛋白质进行初步纯化，并采用SDS-PAGE电泳对纯化效果进行鉴定。

结果表明，蛋白质纯化效果较好，达到了实验目的。

七、实验讨论1. 盐析法是一种简单、经济、有效的蛋白质纯化方法，适用于初步纯化。

2. 实验过程中，蛋白质沉淀的收集和洗涤是关键步骤，直接影响纯化效果。

模拟“蛋白质提取”实验设计

模拟“蛋白质提取”实验设计《高中生物(选修一)》中的“蛋白质提取技术”一节,利用Sephadex G-75进行蛋白质提取的操作。

该实验是当今蛋白质技术的真实反映,能够激发学生学习兴趣,但实验投入昂贵,且占用课时较多,在目前条件下,尚难以在中学普遍推广。

在此,笔者利用纯水制取工业中常用的阴-阳离子交换树脂代替Sephadex G-75进行模拟实验,不但能够说明蛋白质技术的基本原理,还大大降低了实验成本、缩短了实验课时,适合广大中学生物实验教学使用。

一、材料和方法1.树脂的清洗将市售732阳离子交换树脂、717阴离子交换树脂各称取3g,分别放置于50ml 小烧杯中。

加入30ml蒸馏水,用玻璃棒缓慢搅拌20s,倒去上层清液(留在烧杯中的水分不超过10ml)。

反复上述操作,直至上清液呈无色透明为止。

之后加入30ml 浓度为95%的乙醇,缓慢搅拌30s,室温浸泡过夜。

2.树脂的活化倒去乙醇,蒸馏水冲洗至无乙醇气味。

倒去多余水分后(留在烧杯中的水分不超过10ml),向阳离子树脂中加入30ml浓度为12%的盐酸,向阴离子树脂中加入30ml浓度为10%的NaOH溶液。

玻璃棒搅拌30s使溶液与树脂充分接触,静置4h。

3.装柱倒去盐酸、NaOH溶液,用蒸馏水冲洗3～5遍。

将阴、阳离子树脂各装填到1个10ml注射器中,分别记作阴离子交换柱和阳离子交换柱。

4.加入样品及检测用滴管吸取0.05mol/L的CuSO4溶液(记作溶液A),以1滴/s的速度滴入阳离子交换柱中。

用试管收集流出液体5ml,记作溶液B。

用滴管吸取3ml溶液B,以1滴/s的速度滴入阴离子柱中,用试管收集流出液体,记作溶液C。

分别将A,B,C溶液加入0.1mol/L的NaOH溶液和0.05mol/L的Ba(NO3)2中,观察现象。

二、结果与分析溶液A在NaOH和Ba(NO3)2溶液中都有沉淀,溶液B在NaOH溶液中无沉淀而在Ba(NO3)2溶液中有沉淀,C溶液在NaOH和Ba(NO3)2溶液中都没有沉淀(见表1)。

蛋白分离纯化实验报告

一、实验目的1. 掌握蛋白质分离纯化的基本原理和操作方法。

2. 学习不同分离纯化技术的应用。

3. 提高实验操作技能和数据处理能力。

二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和功能。

蛋白质分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。

本实验采用多种分离纯化技术，包括：材料预处理、细胞破碎、离心分离、沉淀分离、膜过滤分离和色谱分离等，实现对蛋白质的分离纯化。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、质粒DNA、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR产物、琼脂糖、电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250等。

2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、玻璃棒、培养箱、无菌操作台等。

四、实验步骤1. 蛋白质提取（1）将大肠杆菌细胞培养至对数生长期。

（2）收集细胞，用玻璃棒搅拌，加入预冷的提取缓冲液，低温条件下进行细胞破碎。

（3）离心分离，取上清液即为蛋白质粗提液。

2. 蛋白质沉淀（1）向蛋白质粗提液中加入一定量的硫酸铵，搅拌溶解。

（2）离心分离，收集沉淀，即为蛋白质沉淀。

3. 蛋白质溶解（1）将蛋白质沉淀溶解于适量的缓冲液中。

（2）调整pH值，使蛋白质处于适宜的溶解状态。

4. 蛋白质分离纯化（1）离子交换色谱：将蛋白质溶液上样至离子交换柱，用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。

（2）凝胶过滤色谱：将蛋白质溶液上样至凝胶过滤柱，用缓冲液进行洗脱，收集目标蛋白峰。

5. 蛋白质鉴定（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质分子量。

（2）考马斯亮蓝R-250染色：观察蛋白质条带，判断蛋白质纯度。

五、实验结果与分析1. 蛋白质提取：通过细胞破碎和离心分离，成功提取出大肠杆菌细胞中的蛋白质。

2. 蛋白质沉淀：硫酸铵沉淀法成功地将蛋白质从粗提液中分离出来。

3. 蛋白质溶解：调整pH值后，蛋白质成功溶解于缓冲液中。

4. 蛋白质分离纯化：离子交换色谱和凝胶过滤色谱成功地将目标蛋白从粗提液中分离出来。

提取纯化蛋白实验报告

一、实验目的1. 掌握蛋白质提取纯化的基本原理和方法。

2. 学习蛋白质纯化过程中的操作技巧和注意事项。

3. 通过实验验证蛋白质提取纯化的效果。

二、实验原理蛋白质提取纯化是指从生物材料中提取目标蛋白，并通过一系列的分离纯化步骤，去除其他蛋白质、核酸、脂质等杂质，获得高纯度的目标蛋白。

实验中常用的提取纯化方法有：细胞破碎、抽提、沉淀、分级、除盐、浓缩等。

三、实验材料1. 生物材料：细胞、组织、血清等。

2. 试剂：盐酸、稀SDS、有机溶剂、稀碱、硫酸铵、透析袋、超滤膜、Ni柱等。

3. 仪器：匀浆机、离心机、电泳仪、凝胶层析仪等。

四、实验步骤1. 前处理：根据生物材料的不同，选择合适的细胞破碎方法，如动物细胞用匀浆机、组织捣碎机或超声波；植物细胞用石英砂研磨或纤维素酶处理；微生物用超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等。

2. 抽提：根据蛋白质的性质选择合适的抽提方法。

可溶蛋白用盐酸、脂蛋白用稀SDS或有机溶剂、不溶蛋白用稀碱进行抽提。

抽提原则为少量多次。

3. 粗提：去除糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。

常用方法有沉淀法（核酸沉淀法、蛋白沉淀法、选择变性）、分级法（盐析或有机溶剂）。

4. 除盐和浓缩：去除蛋白质中的中性盐，常用方法有透析法、分子筛；浓缩方法有反透析、冻干、超滤等。

5. 精细分离：采用凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等方法对蛋白质进行精细分离。

6. 鉴定：采用SDS-PAGE、Western Blot等方法鉴定蛋白质的纯度和活性。

五、实验结果与分析1. 实验结果：通过上述步骤，成功提取纯化了目标蛋白，并进行了鉴定。

2. 结果分析：根据SDS-PAGE和Western Blot结果，目标蛋白的纯度达到90%以上，活性得到验证。

六、实验讨论1. 实验过程中，选择合适的细胞破碎方法、抽提方法和分离纯化方法对蛋白质的提取纯化至关重要。

2. 实验过程中应注意操作技巧，如防止蛋白质降解、避免氧化等。

蛋白质纯化实验技术报告

蛋白质纯化实验技术报告蛋白质是生物体内最基本的组成成分之一，它在维持生命的各个方面都起着重要的作用，因此，研究蛋白质的纯化技术具有重要的科学意义和应用价值。

本文将从蛋白质的纯化目的、方法选择、实验步骤和结果分析等方面进行详细介绍。

一、纯化目的二、方法选择蛋白质的纯化方法多种多样，常用的包括盐析、凝胶过滤、离子交换、亲和层析、逆流层析等。

在选择方法时，需要根据蛋白质的特性、溶液条件和设备条件等因素进行综合考虑。

三、实验步骤1.细胞破碎和初步纯化：将含有目标蛋白质的细胞悬液经离心分离细胞碎片，得到上清液，进行初步纯化。

2.过滤和沉淀：使用滤膜或沉淀物去除杂质，得到蛋白质溶液。

3.层析纯化：根据蛋白质的性质选择适当的层析柱，如离子交换柱、亲和柱等，进行层析纯化。

4.打破和再层析：对于较复杂的蛋白质混合物，可以使用还原剂或表面活性剂等打破蛋白质复合物，然后再次进行层析纯化，以提高纯化效果。

5.纯化评价：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或质谱等方法对纯化后的蛋白质样品进行评价，确认其纯度和活性。

四、结果分析根据实验结果，可以评估所选纯化方法的有效性和适用性，判断所得纯化样品的纯度和活性。

同时，还需对纯化条件进行优化，以进一步提高纯化效果。

五、结论本实验采用了其中一种纯化方法成功地获得了目标蛋白质的高纯度和高活性样品，并对其进行了初步的理化性质分析。

结果表明，所选的纯化方法具有较高的有效性和适用性，可以应用于进一步的研究和应用。

综上所述，蛋白质纯化实验是一项复杂而重要的工作，需要根据蛋白质的特性和实验条件等因素进行综合考虑，以选择合适的纯化方法。

通过详细的实验步骤和结果分析，可以得出纯化效果的评价和结论，并为进一步的研究提供有价值的参考。

蛋白纯化整体实验报告

蛋白纯化整体实验报告实验目的本实验的主要目的是学习和掌握蛋白纯化的基本原理和方法，通过实验操作了解蛋白质纯化的整体过程，从而得到纯净的蛋白质样品。

实验原理蛋白纯化是将复杂混合物中的目标蛋白提取出并得到纯净样品的过程。

蛋白质的纯化一般包括以下几个步骤：1. 细胞破碎：将含有目标蛋白的细胞破碎，使目标蛋白从细胞中释放出来。

2. 澄清：通过离心等方法去除破碎细胞中的固体残渣，得到澄清的蛋白质上清液。

3. 分离目标蛋白：根据目标蛋白的特性选择适当的分离方法，如对目标蛋白进行亲和层析、凝胶渗透层析等。

4. 浓缩：将目标蛋白从大量的上清液中浓缩，以得到更纯净的样品。

5. 纯化检验：对所得样品进行纯度和活性的检验，确保得到纯净的、具有活性的蛋白质样品。

实验步骤步骤一：细胞破碎1. 将待检测的细胞进行冻融处理，用PBS缓冲液洗涤细胞两次。

2. 加入细胞破碎缓冲液，使细胞完全破裂释放蛋白质。

3. 低速离心去除细胞碎片和核酸。

步骤二：澄清1. 取得上清液，初步除去细胞残渣。

2. 用高速离心对上清液进行超速离心，去除大部分颗粒和碎片。

3. 将上清液过滤，去除细微残渣。

步骤三：分离目标蛋白1. 根据目标蛋白的特性选择适当的分离方法，如亲和层析、凝胶渗透层析等。

2. 对蛋白质样品进行层析操作，同时根据各分离步骤的参数进行条件优化。

步骤四：浓缩1. 使用合适的蛋白质浓缩方法，将目标蛋白质从大量上清液中浓缩。

步骤五：纯化检验1. 对所得的蛋白质样品进行纯度检验，如SDS-PAGE电泳分析等。

2. 对纯化样品进行活性检验，如酶活性测定或其它适当方法。

实验结果和讨论在本次实验中，我们成功地利用细胞破碎、澄清、分离、浓缩等步骤对目标蛋白进行了纯化。

通过SDS-PAGE电泳分析，我们确定所得样品具有较高的纯度。

经过活性检验，我们也发现纯化后的蛋白具有一定的活性，符合预期结果。

然而，我们在实验过程中也遇到了一些问题。

首先，在细胞破碎过程中需要选择合适的破碎缓冲液和破碎时间，否则可能会导致目标蛋白的降解或损失。

大量纯化蛋白的简易步骤

纯化蛋白的简易步骤纯化1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220rpm培养。

2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃220 rpm培养至OD600≈0.4-0.5。

3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱导前对照）。

之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。

4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。

沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻存）。

5.配制buffer A，如下6.加入适当的buffer A （含有100mM PMSF 1：100、10mg/mL Dnase 1: 1000、2M MgCl21:2000）。

1000mL菌液收的菌，加入30mL即可，太少超声时容易起泡。

7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。

混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。

8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。

（一定不要菌体碎片！取4ul+4ulLB 作为binding前的对照）9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。

10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。

11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer，放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。

Wash buffer: buffer A+20mM imidazole12.洗好的beads加入适量（5CV）的elution buffer，放置10min后洗脱。

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。

蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。

下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。

一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。

样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。

样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。

二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。

离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。

三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。

可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。

这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。

四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。

亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。

五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。

凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。

六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。

柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。

七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。

透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。

八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。

常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。

九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA.2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT—PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA。

4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami（DE3)、Bl21 codon（DE3)等。

7、蛋白的诱导表达。

1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。

37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达)。

2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达.注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50％以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3)将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围.甘油是用0。

22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%—60%,使用时自己计算用量.4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度,低转速（140-180rpm）,诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意：1。

如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1％的葡萄糖用来抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。

2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管，避免反复冻融。

8、包涵体检测.方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。

1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右,视菌种的活性而异，也可过夜摇菌.2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1。

0左右(约2.5h～3h)，然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度.）注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

蛋白质分离纯化及鉴定综合实验一、实验内容将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。

二、实验过程：1.蛋白质粗提液制备溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L；（2）250mL2.蛋白质浓度测定（1）溶液配制1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。

（2）0~100ug/mL标准曲线测定：取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL蛋白质浓度0 20 40 60 80 100µg/ml1mg/mL BSA溶0 40 80 120 160 200液（µl）蒸馏水（µl）2000 1960 1920 1880 1840 1800总体积（µl）2000 2000 2000 2000 2000 2000测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。

以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。

（3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL 蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。

结合计算机模拟的蛋白质分离纯化实验2

结合计算机模拟的蛋白质分离纯化实验摘要本文利用数学建模的方法首次提出了衡量分离纯化效果优劣的定量指标——纯化效益；并对回纯系数的确定进行解释，以便让大家根据自己的需要选择适当的标准，从而达到最佳的实验效果。

建立了便于应用推广的聚乙二醇（polyethylene glycol , PEG和硫酸铵沉淀分离纯化模型并对模型进行求解、检验和应用。

提出了PEG和硫酸铵分级沉淀的最优实验方案求解模型，并对其步骤进行解释，以海芋过氧化物酶分离纯化为例，提供了求解的模板。

关键词纯化效益PEG沉淀硫酸铵沉淀数学建模计算机模拟实验、尸■、亠前言二十一世纪是生物科学的世纪，生物科学需要迅速发展就必须与自然科学的基础数学和现代化的象征——计算机技术相互结合。

将生化分离纯化实验与数学和计算机技术（即数学建模）相结合，可提高实验效率，使分离纯化上升到一个高层次，但是一般的分离纯化数学模型深度较大，对数学的要求很高不便于推广应用。

本文以海芋中过氧化物酶的分离纯化为例，就分离纯化中最常用的沉淀法建立便有应用推广的数学模型，只需测定有限的实验数据，用大众化的软件Excel 来拟合，求解出药品用量与实验效果之间的关系，就可以用Excel 进行无限的计算机模拟实验，寻找出最优的实验试剂用量。

对于分离纯化效果的优劣的判断，目前都是根据纯化倍数和回收率作大概判断的，这种判断较为粗糙，带有很强的主观性，而且有时候根本就很难分别出实验效果的优劣。

本文提出了用纯化倍数和回收率的函数——纯化效益来作为衡量分离纯化效果优劣的定量指标，使分离纯化效果优劣的判断更加客观、科学，而且实验优劣的判断变得更加简单。

也可以实现对不同分离方法之间的分离纯化效果进行比较。

以便实现最快速的找到最优的方法。

对于PEG沉淀分离纯化法，由于其对蛋白质的活性构象起保护作用，所以被广泛用作蛋白质分离的有效沉淀剂。

目前其沉淀原理还不清楚，沉淀的理论解释有多种，但都还仅仅是假设，其中已有的并被多数人接受的沉淀模型是空间阻排学说，⑴其数学表述为：IgS • f s = x—ac，式中S为蛋白质的溶解度，f s为溶液中蛋白质相互作用的摩擦系数，c为PEG的浓度，x、a在一定的条件下是常数，但当溶液中含的蛋白质种类较多时公式lg S • f s二x 一ac很难应用于分离纯化。

“干实验”研究——在微机上模拟蛋白质纯化实验

学取得了很大发展。由于将ＣＩ于实验教学、Ａ用
１ “ 干实验” 软件的开发
１１开发思路和功能．
模拟动态的实验过程难度较大，目前成熟的实用软件还不多见。而用计算机模拟蛋白质纯化实验是其
蛋白质纯化实验模拟软件的最终形态应该是一个人机交互的模拟程序。由于用户主要是在校学习生物化学课程的本科生和研究生，程序应该面向用
据中归纳出相应的规律。我们在多年实验教学的过程中积累了大量的实验数据，从理论上建模或是用
ｐｅｅｙｓｍｕａｉｎｓｆａｅｈｄａｆｒｄｖｌｐｎｈｓＣｏｔａｅａｄｐｏｅｕｅｆｔｅｄｖｌｐｎｒｉ－ｌｔｄｂｉｌｔｏｔｒ．ＴｅｉｅｏｅｅｏｉｇｔｉＡＩｓｆｒｎｒｃｄｒｓｏｈｅｅｏｍｅｔａｅｄｓｏｗｗ
ｃｓｅ．Ｔｅｅｃｉｇｅｅｔ，ｕｉｇｃｒｕｔｎｅ，ａｄｃｍｍｅｔｆｓｄｎｓａｏｔｔｅｓｆａｅａｅｉｔｄｃｄｕｓｄｈｎｔａｈｎｆｃｓｓｎｉｍｓａｃｓｎｏｃｎｓｏｔｅｔｂｕｈｏｔｒｙｎｒｕｅ．ｕｗｏＦｎｌ，ｔｅｉｅｒｆｒｈｒｕｄｔｎｏｌｗｎｅｅｏｍｅｔｆｔｉｓｆａｅｉｐｏｏｅ．ｉａｙｈｄａｆｕｔｅｐａｅａｄｆｌｉｇｄｖｌｐｎｓｏｔｒｓｒｐｓｄｌｏｏｏｈｗ

微量蛋白纯化实验报告

实验目的：本实验旨在学习并掌握微量蛋白纯化的基本原理和方法，通过实验操作，实现对目标蛋白的有效提取和纯化，并对其纯度和活性进行初步评估。

实验原理：蛋白质的纯化是基于蛋白质在物理化学性质上的差异，如分子量、电荷、溶解度等，通过不同的分离技术将目标蛋白从复杂混合物中分离出来。

本实验采用离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法进行微量蛋白纯化。

实验材料：1. 蛋白质样品：细胞裂解液或组织匀浆等。

2. 离子交换层析柱：Sephadex G-25或类似产品。

3. 凝胶过滤层析柱：Sephadex G-75或类似产品。

4. 蛋白质标记物：如考马斯亮蓝G-250等。

5. 试剂：Tris-HCl缓冲液、NaCl、Gel Loading Buffer等。

实验步骤：一、离子交换层析1. 准备样品：将蛋白质样品用Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）稀释至适当浓度。

2. 洗柱：用Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）平衡离子交换柱，去除柱中杂质。

3. 加样：将稀释后的样品上柱，控制流速，使样品均匀分布在柱床上。

4. 洗脱：用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液。

5. 分析：取部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的洗脱峰。

二、凝胶过滤层析1. 准备样品：将离子交换层析后的目标蛋白样品用Gel Loading Buffer稀释。

2. 洗柱：用Gel Loading Buffer平衡凝胶过滤柱，去除柱中杂质。

3. 加样：将稀释后的样品上柱，控制流速，使样品均匀分布在柱床上。

4. 洗脱：用Gel Loading Buffer进行洗脱，收集洗脱液。

5. 分析：取部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的洗脱峰。

三、蛋白纯度评估1. 蛋白质标记：取部分纯化后的样品，加入蛋白质标记物，进行比色法或荧光法测定蛋白质浓度。

2. SDS-PAGE电泳：取部分纯化后的样品，进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的条带。