第二次--第七章 外源性化学物致突变作用

1、光修复（光 裂合酶）：
修复由紫外线 损伤产生的胸 腺嘧啶二聚体。
2.“适应性”反应
主要是O 6 -甲基鸟嘌呤- DNA甲基转移酶 （MGMT）修复鸟嘌呤 O 6 位的烷基化损伤。
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（二） 切除修复
较大范围损伤的修复机制，多步骤修复过程。 是一种比较普遍的修复机制。 核苷酸切除修复和碱基切除修复两种。
常用的菌株有鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌。
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1.鼠伤寒沙门菌回复突变试验（Ames试验）：
是应用最广泛的检测基因突变的方法
检测环境诱变剂的一组实验中的首选试验
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Ames试验原理
组氨酸缺陷型沙门氏菌，均含有控制组氨酸合成基因， 当培养基中不含有组氨酸时它们不能生长。但在受到 某些致突变物作用时，菌体内DNA 特定部位发生基 因突变而回复为野生型菌，此时，培养基中不含组氨 酸该菌也能够生长，可据诱发的回复菌落数判断化学 毒物的致突变性。
设立阳性和阴性对照组。 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致
突变物。 仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非
致突变物。 一般用来测试受试物诱变性时，必须通过其中四个菌株
的检测。
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试验各组 均包括加S - 9和不加S - 9 两种情况。 ➢ 不加S-9得到阳性结果：受试物是直接致突变物； ➢ 加S-9才得到阳性结果：受试物是间接致突变物。
此时，用染色剂如吉姆萨和光处理，使双股含 BrdU的染色单体着色浅淡，而单股含BrdU的 染色单体着色深浓。在光镜下，可清晰分辨出发 生交换的染色单体。
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SCE 试验可分为体外试验、体内试验和体 内、体外结合试验。
体外 SCE 试验可采用CHO、V79、CHL， 人外周血淋巴细胞等。
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DNA碱基序列改变（基因突变）
Ames试验 tk基因座或hgprt基因座突变试验 转基因动物试验
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染色体完整性改变（染色体畸变）
微核试验 染色体畸变分析 显性致死实验
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染色体组畸变（非整倍体）
染色体畸变分析 显性致死试验 微核试验
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点试法：用作定性试验，适用于短期大量筛选
表层培养基＋指示菌±S9 受试物10μl
阳性
培养48小时
阴性
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平板掺入法：用作定量测定
表层培养基＋指示菌±S9＋受试物 阳 性
培养48小时
阴 性
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Ames试验结果判断
阳性结果判定： ①平均每皿回变菌落数为对照(自发回变菌落数)的2倍及 以上 ②可重复性，用一个相应菌株重复 (阴性全套菌株重复)； ③有剂量－反应关系。
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突
遗 传 学 终 点 的 关 系
变 发 生 过 程 中 的 事 件
与
细胞屏障 化学物
接触
DNA损伤
无误修复 正常细胞
未修复 修复错误
DNA完整 性改变
DNA 交换重
排
基因 突变
染色体 结构异
常
染色体数 目异常
遗传学终点
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已有致突变试验能反映的遗传学终点: 1. 基因突变 2. 染色体畸变 3. 染色体组畸变 4. DNA原始损伤
（2）检测外源性化学物对哺乳动物生殖细胞的遗 传毒性，预测其对人类的遗传危险性。
（3）各种遗传毒物的监测和评价，为化学物的可 使用性研究和卫生标准制定提供依据。
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基本原理： 将化学物与生物测试系统接触，然后
观察该生物系统是否发生致突变性检测指 标病及的毒哺、乳改细动变菌物，、等真以菌判、定植物其、是昆否虫、具培有养致的哺突乳变动性物细。胞 凡• 能昆虫使生果物蝇、测蟾试蜍系等 统发生突变的化合物， 即• 可哺乳认动为物具细胞有株致（突C变HO作、用V79。、人类淋巴细胞等）
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结果分析
每个剂量组至少观察5000个细胞 细胞微核率（‰）
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目前对微核试验已有较大的改进:
(1) 体外微核试验，常用细胞有中国仓鼠肺细胞(CHL）， 中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 等。
(2) 周围血微核试验 (3) 双核细胞法 (4) 免疫荧光染色法和荧光原位杂交法
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(三)染色体畸变分析 (chromosome aberration analysis)
化学致突变作用模式： DNA损伤－修复－突变模式
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二、遗传因素对致突变作用的影响
个体因素影响致突变作用有两个方面: 一、先天性：遗传因素—起决定作用 二、后天性：不同生活方式等
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二、遗传因素对致突变作用的影响
(一) 代谢酶遗传多态性 遗传多态性 (genetic polymorphism)：
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致突变试验的分类
根据检出的突变类型分类 根据生物测试系统分类 根据试验时间长短分类 根据试验进行的方式分类 根据发生突变的细胞分类 根据检测终点分类
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二、常用的致突变试验
（一）细菌回复突变试验: 利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正 或补偿突变体所携带的突变改变，判断其致突 变性。
1. 原理：将受试物与检测系统(动物或细胞)接触，然后直 接观察生物体的细胞染色体发生的结构或数目的改变。 可在体细胞(骨髓细胞、外周血细胞)或生殖细胞 (精原细胞)进行。可为体外试验，也可为体内试验。
2. 方法：• 直接观察• 显带观察• 流式细胞仪
结构畸变：裂隙、断裂、断片、微小体、染色体环、多着 丝粒染色体等。
2．聚(二磷酸腺苷-核糖)多聚酶(PARP)： 另一类参与DNA断裂的修复酶。PARP的激
活为DNA损伤后细胞的早期反应之一。
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第五节 观察化学毒物致突变作用的基本方法
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1、如何进行致突变试验的选择？ 2、怎样进行化学致突物的检测？
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遗传毒理学试验目的：
（1）检测外源性化学物的致突变性，预测其对哺 乳动物和人的致癌性。
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传统的微核试验是体内试验，常用啮齿类动物 骨髓嗜多染红细胞（PCE）做微核试验：
（1）PCE 是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞 的主核已排出，微核仍保留在胞质内，易辨认。
（2）PCE 胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别。
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微核 嗜多染细胞
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(二)微核试验(Micronucleus test，MNT) 微核试验(Micronucleus test，MNT)： 是观察受试物能否产生微核的试验。 其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。
识别：糖基化酶识别异常的碱基， 随后
形成AP位点
糖基化酶切断碱基与脱氧核 糖连接的键，使受损的碱基
脱落，产生一个无嘌呤或无
AP内切酶将DNA链切断
嘧啶的位点
DNA聚合酶合成DNA片段，填补空缺
DNA连接酶将新合成的补片接上
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（三） DNA双链断裂修复: 是一种耐受过程。
（四）交联修复: 1）无误交联修复2）易误交联修复
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(五)果蝇伴性隐性致死试验 (sex-linked recessive lethal test，SLRL ）
在DNA合成期，所有染色体均进行复制，复制 后形成两条姐妹染色单体。
SCE：指染色体复制过程中同一条染色体中的 两条染色单体间发生遗传物质的互换。其频率 与可能与DNA的断裂和重接有关，故可间接反 映DNA损伤。
用于检测DNA损伤。
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原理：
对于分裂的细胞，如将5－溴脱氧尿嘧啶核苷 （BrdU）加入合成的原料中，经过2个分裂周 期，两条染色单体的其中一条的双股DNA链中 的胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一条只有一 股被取代。
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已有致突变试验能反映的遗传学终点: 1. 基因突变--DNA碱基序列改变 2. 染色体畸变--染色体完整性改变 3. 染色体组畸变--染色体分离改变 4. DNA原始损伤--DNA完整性改变， DNA重排或交换
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DNA原始损伤
彗星试验 SCE（姐妹染色单体交换试验） UDS（程序外DNA修复试验） 枯草杆菌DNA修复试验 SOS显色试验 原噬菌体诱导试验 酿酒酵母有丝分裂重组试验
以染色体结构异 常和数目异常为
观察终点
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Ames试验试验的优缺点：
检出率较高、重现性好、简便、快速、经济； 使用S9，具有与体内相似的代谢特点； 固体、液体、气体样品均可检测； 微生物遗传密码甚少；远不及哺乳动物； 受试物需命中限定数目的靶基因，才能显示致突
变活性。
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正常细胞、微核细胞
状态。 损伤耐受机制（tolerance mechanisms） ： 指DNA遗传可绕过阻止DNA复制的DNA损伤。
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一、DNA 损伤的修复
（一）直接修复 （二）切除修复 （三） DNA双链断裂修复 （四）交联修复
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（一）直接修复
多数生物体内，主要依赖酶作用。
光修复 “适应性”反应
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第七章 外源化学物致突变作用 Chapter 7 Chemical Mutagenesis
公共卫生学院: 房蕾
主要内容
第一节 概述 第二节 外源化学物致突变的类型 第三节 外源化学物致突变的作用机制及后果 第四节 机体对致突变作用的影响 第五节 观察外源化学物致突变作用基本方法
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目的要求：
掌握：几种主要的遗传毒理学实验。 熟悉：其他观察外源化学物致突变作用的常用方
• 整体哺乳动物（小鼠，大鼠等） • 植物细胞 （紫露草，蚕豆根尖）
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一、观察项目的选择
（一）观察效应终点的类型 有许多试验所观察到的现象并不反映基
因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅 反映致突变过程中发生的其他事件。
遗传学终点（genetic endpoint）：通过遗传 毒理学试验观察到的现象所反映的各种事件即 试验的观察终点。
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Ames试验常用测试菌株及检测终点 我国普遍采用---- 四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株
➢ TA98、TA97 ：检测移码突变 ➢ TA100 ：检测碱基置换+移码突变 ➢ TA102 ：检测碱基置换+移码突变，还可检测
出某些DNA交联剂：甲醛、各种过氧化氢化合 物和丝裂霉素C等。
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Ames试验的方法
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(二)微核试验(Micronucleus test，MNT)
原理：指染色体或染色单体的无着丝点断片或纺
锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后
期遗留在子细胞胞质中，形成微核。
由于形成的园形或杏形结构较正常核小（小于正常间期核
的1/3～1/5，红细胞直径的1/20～1/5），故称为微核。
形成原因 （1）受到染色体断裂剂作用 （2）受到纺缍体毒物的作用
是一个衡量遗传变异的数据，即群体中多态基 因的比例。 1. 氧化代谢酶：细胞色素P450酶 2. 酯酶：环氧化物水解酶 3. 谷胱甘肽硫转移酶 (GST)
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（二） 修复功能的个体差异--修复酶的多态性
1．O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)： 体内一种特异性修复酶。MGMT多态性可
解释某些个体对烷化剂作用特别敏感的现象。有 明显的组织差异和个体差异
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（二） 切除修复
1. 核苷酸切除修复 （nucleotide excision repair， NER) :
内切酶打开受损DNA链，外切酶除去含有受损的 寡核苷酸链，
DNA聚合酶合成DNA片段，填补空缺， DNA连接酶将新合成的补片接上。
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2. 碱基切除修复（base-excision repair, BER ）
法及评价。 了解：机体对致突变作用的影响。
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第四节 机体对致突变作用的影响
遗传物质在所有物种中能世代相传的原因：
1）DNA执行高度保真的复制，对复制中的错误 能 及时纠正，即通过修复而达到高度保真；
2）机体已进化有多种机制修复DNA损伤以保护 亲
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DNA损伤修复按其机制可分为两类: 修复机制（repair mechanisms） ： 对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有
数目异常：需在染毒后经过一次有丝分裂才能发现。
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染色体图像分析系统
染色体被自动排序
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3. 结果分析
每个剂量组至少观察500个中期分裂相细胞 细胞畸变率（％） 染色体畸变率（％）
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(四) 姐妹染色单体交换试验 （sister-chromatid exchange，SCE）：
（二）成套的观察项目 没有一种致突变试验能涵盖所有的遗传学 终点，故需用一组试验配套进行检测。
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成套的观察项目中试验可入选原则：
一组可靠的试验系统应包括： 每Βιβλιοθήκη Baidu类型的遗传学终点 包括几个进化程度不同的物种：包括原核细胞
和真核细胞。 体内试验与体外试验相结合，体外实验要有活
化系统 生殖细胞和体细胞