基因治疗
基因治疗(生物化学)
基因载体的构建 使目的基因在受体细胞内高效、可控、 稳定地表达 受体细胞选择 易分离获取，体外增殖存活，大量扩增。
如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞
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基因转移(gene transfer)方法
1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移
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1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导基因转移效率较高 据统计，有72%的临床实验计划和71%的病 例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转
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基因增补（gene augmentation）
定义: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。
类型: 有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内 的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的 表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因， 利用其表达产物达到治疗疾病的目的。
整合
反 转 录 病 毒 载体
腺病毒载体
致病性
可能致病
感染细胞
分裂细胞
克隆容量
<7kb
随机整合，效率 高
不整合，可能丢 失
不致病
分裂细胞、非 分裂细胞
<7.5kb <5kb
腺相关病毒载 体
定点整合(19号染
色体特定区域)
不致病
分裂细胞、非 分裂细胞
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2.非病毒载体介导的基因转移系统
（1）脂质体介导的基因转移技术 使用方便、成本低廉。 基本原理: 利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可形成包埋 外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细 胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内， 并进行表达。
素；
– 肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。
基因治疗基本知识
抑癌基因疗法
抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑 制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。 Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因
p53基因治疗研究：
（1）野生型p53基因的替代疗法 （2）突变型p53基因的阻断疗法 （3）与p53基因有关的新型肿瘤疫苗
反义核酸
1. 反义RNA（antisense RNA）：与mRNA 互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。
基因治疗
基因工程研究所 宋艳斌
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗 新的生物治疗： 基因治疗 (gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、种类和策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
• 该基因表达产生的酶可催化无毒性的药物前体转变为 细胞毒性物质，从而杀死肿瘤细胞；
• 同时通过“旁观者效应”（bystander effect）杀死邻近 未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。
• 由于携带该基因的受体细胞本身也被杀死，所以这类 基因被称为“自杀基因”。
自杀基因
• 单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因 编 码 胸 苷 激 酶 （ TK ） 催 化 丙 氧 鸟 苷 （ganciclovir, GCV）成为磷酸化的核苷酸类似 物，阻断DNA的合成而使细胞死亡。
2.体细胞基因治疗： 研究重点
体细胞治疗的概念
• 指应用人的自体、同种异体或异种（非人体） 的体细胞；
基因治疗药物
腺病毒载体系统特点
➢ 感染分裂细胞和不分裂细胞 ➢ 容量大 ➢ 不整合，表达时间短 ➢ 免疫源性
其它病毒载体系统
• 腺病毒相关病毒载体 • 慢病毒载体 • 单纯疱疹病毒载体 • 牛痘苗病毒载体
2、非病毒载体系统
基因直接注射法：直接将裸露DNA注入动 物肌肉或某些器官组织内。
特点：DNA制备简便 避免病毒载体的潜在致癌性 可反复应用
遗传病的基因治疗
➢ 重症联合免疫缺陷综合征的基因治疗 ➢ 血友病B的基因治疗
含人凝血因子IX的 逆转录病毒载体
注入腹部或 背部皮下
导入自体皮肤 成纤维细胞
筛选高表达细 胞并体外扩增
肿瘤的基因治疗
免疫性基因治疗:
IL-2、TNF
免疫效 应细胞
TIL、LAK、CTL
肿瘤细胞
MHC抗原、共刺激因子
自杀基因治疗
3.基因治疗的途径
ex vivo（体外转移）途径：
将含外源基因的载体在体外导入人体自身或 异体细胞，经体外细胞扩增后输回人体。
特点：安全、易控制 步骤多、技术复杂、不易推广
3.基因治疗的途径
in vivo（活体直接转移）途径：
利用基因转移载体将外源基因原位或直接导 入体内。
特点：操作简便、易推广 疗效持续时间短
ex vivo in vivo
四、基因转移的方法
➢ 病毒载体系统 ：将目的基因克隆至病毒载体， 再将此重组病毒载体感染靶细胞。
➢ 非病毒载体系统 ：采用物理或化学方法 将目的基因直接导入靶细胞。
1、病毒载体系统
应具备的条件：
• 易于制备，滴度高 • 能介导外源基因的转移和表达 • 无致病性
逆转录病毒载体
脂质体介导法：用脂质体包装目的基因，再与靶 细胞融合，将DNA导入细胞中。
基因治疗
与安全性相联系的就是生殖细胞基因治疗。虽然在人类尚未实施，但在动物实验已获成功，这就是转基因的 动物出现。这一事实既给人类生殖细胞基因治疗带来了希望，同时也使人们耽心这种遗传特征的变化世代相传， 将给人类带来的是福还是祸。
概念
狭义概念
广义概念
狭义概念
指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。
广义概念
基因治疗指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。
主要分类
按靶细胞
按基因操作
给药途径
按基因操作
基因治疗一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序 列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基 因在原位特异性修复。另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除 异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或 转录，以达到抑制某些异常基因表达。
①ex vivo途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞 扩增后，输回人体。ex vivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大， 不容易推广；
②in vivo途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或 非病毒性，甚至是裸DNA。in vivo基因转移途径操作简便，容易推广，但尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫 排斥及安全性等一系列问题。
基因治疗
• 反义核酸药物 • 反义技术（antisense technology）是采用反 义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因的技术。 根据碱基互补原理结合并调节靶基因活性的核 酸分子称为反义核酸，其种类有反义脱氧核糖 寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)、反义 RNA、核酶和三链形成寡核苷酸(triplexforming oligonucleotides,TFO)等。反义核 酸在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过 度表达上发挥着重要作用，可用于肿瘤、病毒 感染性疾病、高血压等的治疗。
• （二） 基因调控治疗 • 1．药物调控 用药物使被抑制的基因重新表 达或抑制某些过度表达基因的表达。 • 2．反义核酸技术 利用反义核酸 （antisense nucleic acid） 在复制、转录、 转录后加工及翻译水平上抑制目的基因的表 达。 • 3．核酶技术 利用核酶（ribozyme）的催化 活性将mRNA特异地剪切，从而不能承担翻译 模板作用。
• 生长激素 • 生长激素( growth factor,GH)是垂体前叶合 成与分泌的一种蛋白质激素，其分泌受下丘脑 的生长激素释放激素及生长抑素的调节。。 • 重组人生长激素（recombinant human growth factor，rhGH）主要用于内源性生长激素缺乏 的儿童以及治疗烧伤、创伤、肌肉萎缩症等疾 病。
• 一、 基因治疗的类型 • （一） 基因矫正治疗 • 1．基因修正（gene correction） :此种方 法较困难，尚无体内成功的报道。 • 2．基因置换（gene replacement）： 这是 最理想的基因治疗方法。但目前同源重组频 率太低而无法用于临床。 • 3．基因增补（gene augmentation） : 基 因增补较易实现，是目前基因治疗最常用的 方法。
人类疾病的基因治疗
人类疾病的基因治疗随着科技的不断发展，基因治疗作为一种全新的治疗手段逐渐引起了人们的关注。
基因治疗是一种通过修复或替换患者体内缺陷或异常基因来治疗疾病的方法。
本文将探讨基因治疗的原理、应用领域、挑战和前景。
一、基因治疗的原理基因治疗的核心原理是通过向人体细胞传递正常基因，改变患者体内缺陷基因的功能，从而治疗疾病。
具体而言，基因治疗可以分为三个步骤。
首先，选择合适的载体将正常基因送入患者体内。
常用的载体包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体通常是经过改造的病毒，可以把正常基因导入人体细胞，但需注意病毒本身的安全性。
非病毒载体则是指通过化学方法将基因导入细胞，常用的方法包括电穿孔和脂质体转染。
其次，正常基因在细胞内表达并产生有效的蛋白质。
一旦正常基因成功导入细胞，它会被细胞内的转录和翻译系统读取，并转录成相应的mRNA。
随后，mRNA通过翻译系统转译为蛋白质，起到修复或替代缺陷基因的作用。
最后，修复或替代的基因开始发挥作用。
一旦正常基因成功表达，它将修复或替代患者体内缺陷基因所导致的疾病。
这种基因治疗方法的独特之处在于，它能够从根本上改变疾病的发展过程，具有长期疗效。
二、基因治疗的应用领域基因治疗在许多领域都有广泛的应用前景。
以遗传性疾病为例，一些单基因遗传疾病如囊性纤维化和遗传性失明等，由于其与特定基因的直接关联，因此非常适合基因治疗。
此外，基因治疗还可应用于常见病如癌症和心脑血管疾病等的治疗。
对于癌症患者来说，基因治疗可以有选择地杀死恶性肿瘤细胞，减少对正常细胞的伤害。
例如，通过向白血病患者体内输送能够识别白血病细胞并杀死它们的基因，可以极大地提高白血病患者的生存率。
对于心脑血管疾病患者而言，基因治疗可以促进新血管的生长，改善血液供应。
通过增加血管生长因子基因的表达，可以刺激新血管的生成，改善心肌缺血和脑卒中等疾病的症状。
三、基因治疗的挑战然而，基因治疗仍面临着一些挑战。
首先，基因治疗的安全性是一个重要问题。
基因治疗的例子
基因治疗的例子基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的方法。
它通过将正常的基因导入患者的体内，修复或替代缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。
以下是基因治疗的十个例子：1. 囊性纤维化治疗：囊性纤维化是一种常见的遗传性疾病，基因治疗可以通过将正常的CFTR基因导入患者体内来修复缺陷基因，从而恢复肺部和胰腺的正常功能。
2. 血友病治疗：血友病是一种由于凝血因子缺乏导致的出血性疾病，基因治疗可以通过导入正常的凝血因子基因来恢复凝血功能，从而治疗血友病。
3. 巨细胞病毒感染治疗：巨细胞病毒感染是一种常见的病毒感染，基因治疗可以通过导入抗病毒基因来增强机体对巨细胞病毒的抵抗能力，从而治疗感染。
4. 癌症治疗：基因治疗在癌症治疗中有广泛的应用。
例如，通过导入抑制癌细胞生长的基因，可以抑制癌细胞的增殖，达到治疗癌症的效果。
5. 心血管疾病治疗：基因治疗可以通过导入修复心脏血管的基因来治疗心血管疾病。
例如，通过导入血管生成因子基因，可以促进新血管的生成，改善心脏供血情况。
6. 免疫缺陷病治疗：免疫缺陷病是一类免疫系统功能异常的疾病，基因治疗可以通过导入正常的免疫相关基因来增强免疫功能，从而治疗免疫缺陷病。
7. 遗传性视网膜病治疗：遗传性视网膜病是一类导致视网膜退化的疾病，基因治疗可以通过导入修复视网膜功能的基因来治疗视网膜病，恢复视力。
8. 先天性免疫缺陷病治疗：先天性免疫缺陷病是一类由于先天基因缺陷导致的免疫系统功能异常的疾病，基因治疗可以通过导入正常的免疫相关基因来修复免疫功能，从而治疗先天性免疫缺陷病。
9. 神经退行性疾病治疗：神经退行性疾病是一类由于神经细胞退化导致的疾病，基因治疗可以通过导入促进神经细胞生长和修复的基因来治疗神经退行性疾病，延缓疾病进展。
10. 遗传性代谢病治疗：遗传性代谢病是一类由于代谢酶缺乏或功能异常导致的疾病，基因治疗可以通过导入正常的代谢酶基因来修复代谢功能，从而治疗遗传性代谢病。
基因治疗
二,基因治疗的程序
(一)目的基因的准备 受体细胞(靶细胞) (二)受体细胞(靶细胞)的选择和培养 (三)载体的选择 (四)目的基因导入靶细胞的基因转移方法
(一)目的基因的准备 目的基因特点: 目的基因特点: 其表达产物已证明有活性,功能确切, 其表达产物已证明有活性,功能确切,在 启动子下游可表达,有标记基因可供筛选. 启动子下游可表达,有标记基因可供筛选.
基因治疗简介
内容
一,基因治疗的概念 二,基因治疗的程序 三,基因治疗的问题与前景
一,基因治疗的概念
基因治疗( 基因治疗(gene therapy)是将有功能 ) 的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换 致病基因的一种治疗方法. 致病基因的一种治疗方法.其机制在于功 能基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因 发生整合, 发生整合,成为宿主细胞遗传物质的一部 分,目的基因的表达产物起到对疾病的治 疗作用. 疗作用.
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(四)目的基因导入靶细胞的基因转移方法 1,基因转移的物理法 , (1) 显微注射法 显微注射法: ① 显微注射法:直接在显微镜下向胞内注入 基因; 基因; 穿刺法:先在胞膜, ② 穿刺法:先在胞膜,胞核上穿孔后导入基 因 (2) 电脉冲介导法:在高压电脉冲下,使胞膜 电脉冲介导法:在高压电脉冲下, 瞬间形成孔洞,基因在强电场下导入,电 瞬间形成孔洞,基因在强电场下导入, 场强度和持续时间随种类而异. 场强度和持续时间随种类而异.
(三)载体的选择 1,质粒载体(穿梭载体): ,质粒载体(穿梭载体): 既具有动物( 细胞表达元件, 既具有动物(人)细胞表达元件,又具有细 菌质粒相关元件. 菌质粒相关元件. 2,病毒载体: ,病毒载体: (1) 重组病毒载体:基因重组病毒可直接感染 重组病毒载体: 细胞,导入基因. 细胞,导入基因. (2) 重组质粒型病毒载体:在细菌中扩增质粒 重组质粒型病毒载体: 体外包装形成假病毒,感染靶细胞, ,体外包装形成假病毒,感染靶细胞,将 基因导入. 基因导入.
基因治疗
基因矫正、基因置换、基因失活、基因修饰
从临床治疗角度，目前肿瘤基因基因治疗的策略
直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长； 增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤胞； 改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效；
肿瘤基因治疗常用方法
基因干预技术 反义RNA技术：①封闭异常表达的癌基因； ② 作用癌基因的易位和重排部位；⑶抑制肿瘤细胞 的耐药性，提高化疗效果。 RNA干扰技术：用于阻断、抑制癌基因异常表 达的恶性肿瘤治疗。 反义基因技术：设计原癌基因启动子的竞争剂， 从而抑制原癌基因转录。
遗传病的基因治疗研究
人类遗传病4000多种，发病率为40-50%， 必须符合以下要求的遗传病才可考虑开展 基因治疗研究：（30余种） 在DNA水平上明确其发病原因及机制； 单基因遗传病，而且属隐形遗传； 该基因的表达不需要精确调控； 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞 中表达并发挥其生理作用； 该遗传病不经治疗将有严重后果。
基因转移的生物学与非生物学方法
生物学方法：以病毒载体作为转移系统
逆转录病毒基因组经过改造后作为载体 ( retrovirus vector) 腺病毒(adenovirus,AV)基因组可作为载体携带治疗基因
腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus, AAV)载体适合治疗基因的稳定长效表达。
几种已经或可望在临床进行基因治疗的 人类单基因遗传病
腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP) 缺乏症； 血友病：针对凝血因子Ⅸ基因； 中国科学家1991年12月成功进行了血友病B的基因 治疗。 将携带凝血因子Ⅸ基因的巨细胞病毒载体导入患者 自身皮肤的成纤维细胞—— 经体外培养---再植入患者皮下----患者血浆中凝血因子Ⅸ浓度 上升，凝血活性改善。
基因治疗基础
定向干细胞 (造血祖细胞, HPC)
红系祖细胞 巨核系祖细胞 单核系祖细胞
成熟的终末细胞
ABioCell
(1). 造血干/祖细胞(HS/PC)
优点:
1）具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭， 只需单次治疗；
2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等 各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定， 使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身 受益；
ABioCell
2.成体细胞及组织
成纤维细胞 肌细胞 淋巴细胞 血管内皮细胞 皮肤组织 眼组织和神经组织
ABioCell
2.1 成纤维细胞
优点：易获得和在体外培养；方便进行遗传修饰；容易 移植回体内，必要时还可将已植入的细胞重新移走，使 其介导的基因治疗终止。已有多种细胞因子基因治疗在 小鼠上试验成效，使小鼠对肿瘤的免疫功能明显增强。
(2). 肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL） 主要获自实体瘤组织或癌性胸水、腹水等，具有肿 瘤病灶趋向性。 在IL-2的刺激下，从肿瘤组织分离的TIL体外培养能 大量扩增，存活时间可超过100天，回输到体内后能 聚集于病灶部发挥抗肿瘤作用而对机体不构成威胁， 因而是较为理想的靶细胞。
ABioCell
2.5 皮肤组织
最容易大面积接近的组织，质粒裸DNA可直接注入， 或经颗粒轰击（基因枪）而导入。外源基因的表达产 物可产生全身性影响。
针刺介导的基因转移（puncture-mediated gene transfer）可进行较大面积的体细胞基因治疗。
潜在临床应用范围： 1. 导入DNA疫苗, 诱导机体的保护性免疫。 2. 转入免疫增强基因 (immune-enhancing gene) 或
基因治疗(gene therapy)
近年来，更多采用体内方案。重组 逆转录病毒直接注射的途径主要有： 1）采用静脉注射等途径，将重组病 毒直接注射到机体内，通过重组病毒 的感染作用实现基因转移；2）直接 将产生重组逆转录病毒载体的包装细 胞注射到组织或肿瘤中，由包装细胞 释放再感染靶细胞；
3）直接将表达载体，可以是非 病毒性表达质粒，注射到人体内， 如将HIV-1病毒载体注射到肌肉 内，使其表达相应的env基因蛋 白，引起相应的细胞免疫。
定义 把基因转移到患者体内，使其发
挥作用，以达到治疗疾病目的的技 术称为基因治疗(Gene Therapy)。
基因治疗自Anderson于1990年进行 了第一例应用腺苷脱氨酶基因（ADA）， 经反转录病毒导入人体自身T淋巴细胞， 经扩增后输回患儿体内，获得了成功。 患儿5年后体内10%造血细胞ADA基因呈阳 性，除了还需应用部分剂量的ADA蛋白外， 其他体征正常。这一成功标记着基因治 疗的时代已经开始。
3.腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）:AAV属于微小病毒家族成 员，是一类小的单链DNA病毒（基因组 约4.7kb），非常稳定。本身无致病性， 需辅助病毒（常为AV）存在时才能复 制。AAV可感染人的细胞，并能整合至 非分裂相细胞。
大部分AAV基因组可去除，从而可 使外源基因得以大量补足。AAV可以 整合进入宿主细胞基因组，但不如 RV的整合效率高。有趣的是，在感 染细胞中，野生型AAV基因组可高效 定点整合于人类第19号染色体长臂 的特定位置上，这种整合可导致染 色体基因重排，
5.调控性基因治疗 通过导入编码调控蛋白的
基因以治疗基因表达异常的疾 病。如：以野生型P53基因治疗 肺癌或急性白血病。
6.应用“自杀基因”的基因治疗 也称活化前体药物性基因治疗。
基因治疗存在的问题
基因治疗存在的问题一、引言基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗遗传性疾病和后天获得性疾病的新型医疗手段。
随着生物技术的不断发展，基因治疗已经取得了显著的进展，但仍存在许多问题需要解决。
本文将探讨基因治疗存在的问题，并对其进行详细分析。
二、基因治疗存在的问题1.靶点选择与定位基因治疗的首要问题是如何准确地选择和定位治疗的靶点。
在许多情况下，需要明确缺陷基因的位置和功能，以便精确地将外源基因导入到相应的位置。
然而，由于人体基因组的复杂性，这往往是一项极具挑战性的任务。
目前，基因治疗的靶点选择与定位技术尚不成熟，缺乏精准度和特异性，这可能导致治疗效果不佳或产生不必要的副作用。
2.安全性问题基因治疗的安全性问题是目前研究的重点之一。
将外源基因导入人体细胞可能导致不可预测的副作用或产生新的疾病。
例如，导入的基因可能引起免疫反应或插入到细胞的关键区域，导致细胞功能异常。
此外，基因治疗还可能引发长期副作用，例如致癌、致畸和遗传毒性等。
因此，确保基因治疗的安全性是至关重要的。
3.基因导入效率基因治疗的另一个问题是基因的导入效率。
目前，基因导入的效率仍然较低，需要大量的载体或细胞才能产生可见的效果。
这增加了治疗的复杂性和成本，并可能增加副作用的风险。
提高基因的导入效率和特异性是基因治疗研究的重要方向之一。
4.长期影响未知由于基因治疗仍处于发展阶段，许多治疗的长期影响尚未完全了解。
例如，导入的基因是否会在后代中传递？是否会产生潜在的长期副作用？这些都是需要进一步研究的问题。
因此，对于长期影响的监测和研究至关重要，以确保患者的安全和治疗效果的可持续性。
5.伦理与法律问题基因治疗还涉及到一系列伦理和法律问题。
例如，修改人类基因可能会引发关于人类身份、尊严和生物伦理的争议。
此外，不同国家和地区对基因治疗的法律和监管框架各不相同，这增加了治疗的复杂性。
因此，在开展基因治疗之前，必须进行充分的伦理和法律评估，以确保患者的权益和社会责任。
《基因治疗》PPT课件
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
基因治疗
2、导入基因的鉴定
• 直接对转染细胞的外源基因(目的基因) 的存在与否或对其表达产物的含量与活 性进行鉴定。 • 方法： • PCR • RT-PCR • Northern 印迹 • 免疫组化(染色) • 免疫印迹等等。
(七) 基因治疗临床试验的审批(略)
三、基因治疗的主要策略和 技术方法
(一)基因治疗的主要策略
•
• • •
目的基因 (正常基因)
靶细胞染色体 同源DNA序列 (缺陷基因)
同源重组
3、基因添加
• 又称基因增补或基因修饰： • 在不去除异常基因的前提下， 将目的基因 导入病变细胞或其他细胞(非定点整合)，以 目的基因的表达产物来补偿缺陷基因的功 能或使原来的功能得到加强。 • 例如，把细胞因子(如TNF)基因导入肿瘤细 胞并使其表达即属此类。
(二)基因干预主要有以下几种方法
• 弄清以下几个概念： 反义技术(antisense technology ) 研究和设计有效抑制靶基因表达以控制 和治疗疾病的人工反义分子的专门技术。 一般要满足以下3个条件： (1)能特异地识别靶基因的序列并与之结合； (2) 在细胞内不易被酶解，存留时间较长； (3) 能透过细胞膜到达作用部位。
(二)基因导入方式(方法)的选择
• 按导入方式的不同，外源基因导入人体内的方法可分 为3类： • 1.直接法(体内法) ( in vivo ) • 特点：直接向体内某组织(器官)转基因。 • 优点：操作简便；缺点：基因转移和表达的效率都 较低。 • 2.间接法(回输法) ( ex vivo )或称离体法 • 特点：离体培养细胞，转基因后回输至患者体内。 • 优点：成功率相对较高；缺点：操作繁琐。 • 目前此类方法常用。 • 3.原位法 ( in situ ) • 直接向患者的病变部位转基因。
基因治疗PPT课件
❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
4
基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
1
目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
2 2
一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
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❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
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腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
26
首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
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第7章基因治疗精品PPT课件
1、内源基因的变异 2、外来生物的入侵
基因致病
基因结构的异常 基因表达的异常
2
基因诊断常用技术
• 核酸分子杂交： • PCR： • 生物芯片： DNA芯片或基因芯片 • 基因测序：
3
血友病A基因诊断
• 病因：factor VIII 基因缺陷 （碱基取代、缺失或插入等）， 使凝血因子VIII 无活性或不 稳定，导致凝血障碍。
10
基因治疗的两种途径
ex vivo
靶细胞
载体 目的基因
in vivo
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基因治疗的总体策略
1、基因矫正（修正）（gene correction）：未实现 2、基因置换 （gene replacement）： 3、基因修饰（增补）（gene augmentation）： 4 、基因激活（gene activation）： 5 、基因失活（干预）（gene interference ）：反
细胞生长分裂
10天 Gene表达
IL-2刺激C分裂
回输患儿体内
1~2月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%
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基因治疗基本过程 例2
• 逆转录病毒载体 +FⅨcDNA
重组体
5` LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3`
①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达；
②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养） →FⅨ表达；
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7.2 基因治疗的载体
7.2.1 逆转录病毒载体 7.2.2 腺病毒载体 7.2.4 单纯疱疹病毒
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7.2.1 逆转录病毒载体
• 正链RNA病毒
• 5’ gag- pol-
env 3’
基因治疗名词解释
基因治疗名词解释基因治疗是一种通过修复、替代或调控患者体内的异常基因来治疗遗传性疾病的方法。
它是一种新兴的生物医学技术，具有重要的临床应用前景。
下面将对一些与基因治疗相关的重要名词进行解释。
1. 基因：基因是生物体内能够传递遗传信息的分子单位，由DNA或RNA组成，是遗传信息的基本单位。
基因决定了生物体的形态、功能和特性。
2. 基因治疗：基因治疗是一种通过修复或调控患者体内异常基因的方法来治疗遗传性疾病。
它可以通过向患者体内导入健康基因、修复异常基因或调控基因表达来达到治疗疾病的目的。
3. 基因修复：基因修复是一种通过修复患者体内异常基因序列的方法，使其恢复正常功能。
这可以通过使用DNA修复酶或基因修复向导RNA介导的修复等技术实现。
4. 基因替代：基因替代是一种通过向患者体内导入健康基因来取代异常基因的方法。
这可以通过使用载体（如病毒载体）将健康基因导入到患者体内，使其表达出正常的功能。
5. 基因调控：基因调控是一种通过调控基因的表达水平来治疗疾病的方法。
通过引入特定的调控基因或RNA干扰技术，可以增强或抑制特定基因的表达，达到治疗疾病的目的。
6. 基因传递系统：基因传递系统是一种将治疗性基因导入患者体内的载体系统。
它可以是病毒载体、非病毒载体或其他纳米粒子等。
这些载体可以保护基因免受外界环境的损害，并帮助基因在患者体内有效地传递和表达。
7. 基因编辑：基因编辑是一种通过精确修改基因序列来改变基因的功能的技术。
目前常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALEN和ZFN等。
这些技术可以精确地删除、插入或替换目标基因序列，从而实现对基因功能的精确调控。
8. 向量：向量是一种可以携带外源基因并将其导入患者体内的工具。
病毒载体是目前最常用的向量，它可以通过改造病毒基因组并将治疗性基因插入其中，然后将其注射到患者体内，实现基因导入和表达。
9. 转基因：转基因是指通过人为手段将外源基因导入到生物体内，并使其在生物体内表达。
基因治疗的常用方法及比较
基因治疗的常用方法及比较基因治疗作为一种新兴的治疗方法，已经在许多疾病的治疗中取得了显著的进展。
本文将介绍基因治疗的常用方法，并对其进行比较，以期给读者带来更全面的了解。
基因治疗是一种通过改变个体的基因来治疗疾病的方法。
它涉及到将外源基因导入到个体的细胞中，以修复或替代受损的基因。
以下是基因治疗的常用方法及其比较。
1. 基因替代疗法：基因替代疗法是最早被开发并被广泛使用的基因治疗方法之一。
该方法通过将正常的基因序列引入到受损的细胞中，以取代缺陷基因的功能。
借助载体（例如病毒或质粒），这些基因可以直接送入目标细胞中。
基因替代疗法通常在单基因疾病中应用较多，例如囊性纤维化和遗传性失聪。
2. 基因修复疗法：基因修复疗法旨在修复已经受损的基因，使其恢复正常功能。
这种方法通常适用于在基因上存在点突变的疾病。
通过使用工具基因编辑技术，如CRISPR-Cas9系统，可以直接在基因组中进行修改，以修复受损的基因。
基因修复疗法在近年来得到了广泛的关注和研究，被认为在治疗遗传性疾病和一些癌症方面具有巨大潜力。
3. 基因默化疗法：基因默化疗法是一种通过寄生基因干涉RNA（siRNA）或miRNA等小分子RNA来恢复受损细胞功能的方法。
这些小分子RNA可以通过干扰目标基因的表达，抑制基因转录和翻译，从而减轻或消除疾病症状。
基因默化疗法在癌症治疗中得到了广泛的应用，但其应用范围正在不断扩大，目前还在进行更多的研究和开发。
在比较这些基因治疗方法时，需要考虑其优点和局限性。
基因替代疗法的优点是它能够通过直接将正常基因导入受损细胞来恢复功能。
然而，这种方法存在一些限制，例如难以将基因传递到特定组织或器官，并且可能引起免疫反应。
相比之下，基因修复疗法通过直接修改已经受损的基因来恢复功能。
这种方法具有较高的精确性和有效性，但由于技术的复杂性和可行性的挑战，其实施仍面临一些困难。
与基因替代疗法和基因修复疗法相比，基因默化疗法具有更广泛的应用范围。
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基因治疗
基因治疗的发展
基因治疗的设想始于1967年，1973年一名美国研究人员和几位医生在德国进行了世界上第一例基因治疗试验，接受治疗的患者为两姐妹，研究人员将一种名为肖普氏乳头瘤的病毒(这种病毒携带有一种酶基因可能会使人本身的酶分泌正常)注射到患者体内,结果是既没有产生任何疗效,也没有出现不良反应。
1980年随着外源基因导入小鼠实验的成功，美国的另一名医生对两名地中海患者进行了第二例基因治疗，结果同样没有取得成功。
20世纪80年代初，美国科学家Anderson基因治疗的前景和发展方向。
此后的几年之中，一大批科学家在动物身上进行了大量的基因转移实验和基因标记实验，为以后基因治疗的临床应用积累了许多经验，也奠定了临床应用的理论基础。
1990年，美国国立卫生研究院的Blaste R.M.和Anderson W.F.用腺苷酸脱氨酶（ADA）基因导入一位由于ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁患者的淋巴细胞中，治疗取得了成功，转入这种可以产生腺苷酸脱氨酶能力的淋巴细胞后，患者症状得到明显缓解。
第二例接收同样方法治疗的的SCID患者是一名九岁的小女孩，治疗也同样取得成功。
1991年，美国科学家Rosenberg的研究小组对50名黑色素瘤晚期患者进行了基因治疗，将外源性肿瘤坏死因子转入肿瘤中的浸润淋巴细胞,结果这种转化的TIL能集中在肿瘤所在部位并杀伤肿瘤细胞,治疗也取得了一定效果。
此后世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮，1991年美国国立卫生研究院连续批准了包括肿瘤坏死因子基因导入肿瘤细胞在内的11项人类基因治疗的实验方案。
2001年法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，成为基因治疗开展近十年来科学家取得的最大成功。
目前基因治疗主要集中在美国，其次是欧洲。
基因治疗的适用范围也越来越广，其中，癌症居基因治疗首位，其次是单基因疾病，心血管病，传染性疾病和其他疾病。
我国的基因治疗的研究工作开展的也相对较早，且获得了很好的疗效。
1991年7月，中国复旦大学与第二军医大学长海医院合作，从一批自愿接受基因治疗的凝血因子IX基因缺陷血友病B患者中选择了两兄弟开始进行基因治疗临床研究。
研究人员将凝血因子IX基因导入患者皮肤成纤维细胞，再将转化的皮肤成纤维细胞回输到患者体内。
经过几次转化细
胞的回输治疗，两名患者血液中凝血因子明显增加，而且没有发现不良反应。
1994年8月，中国卫生部批准了这种基因治疗方案。
此后，许多科学家对多种疾病进行了临床基因治疗试验，各种临床治疗方案提出的速度非常惊人。
1993年5月5日，中国卫生部药政局颁布了《人体细胞及基因治疗临床研究质控要点》作为基因治疗的管理依据。
我国在基因治疗的关键技术研究方面也取得重大突破，建立了靶向性高效非病毒系统、通用性病毒载体——AAV,HSV载体、人造血干细胞的扩增、定向分化及基因导入技术，这些技术均获得了国内与国际专利。
随着研究工作的进展的展开和深入，基因治疗已从实验室阶段过渡到临床试用阶段。
目前基因治疗已被用于治疗恶性肿瘤、心脏病、关节炎、风湿病等疑难杂症。
.基因治疗的现状
生物医学的深入研究表明，人类的各种疾病都直接或间接与基因有关。
因此，可认为人类的一切疾病都是“基因病”。
故人类疾病可分为三大类。
一类是单基因病。
这类疾病只需一个基因缺陷即可发生，如腺苷脱氨基酶(ADA)缺陷症。
二是多基因病。
此类疾病的病因大多比较复杂，不但涉及各个基因，往往还与环境因素(包括自然环境、社会环境、生活方式等)有关。
基因缺陷和疾病表型都具有明显的多样性。
Ⅰ型糖尿病、肿瘤、心血管疾病等皆属此类。
三是获得性基因病。
此乃病原微生物入侵所致，如艾滋病、乙型肝炎等。
因此，理论上，人类所有的疾病都可采用基因治疗。
基因治疗技术
基因治疗常用方法
有两种，即体内疗法(In vivo)和体外疗法(Ex vivo)。
体内疗法是将外源基因导入受体体内有关的器官组织和细胞内，以达到治疗目的，这是一种简便易行的方法，如肌肉注射、
静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但其缺点是基因转染率较低。
研究和应用较多的还是体外疗法，即先在体外将外源基因导入载体细胞，然后将基因转染后的细胞回输给受者，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物，以达到治疗目的。
最常用的技术有三种：(1)体外处理疗法：将有基因缺陷的体细胞取出后，引入正常的基因拷贝后再送回体内;(2)原位疗法：使用载体将目的基因直接导入靶细胞;(3)体内疗法：将基因载体注入血液，定向寻找靶细胞并将基因安全有效地导入。
基因治疗载体
有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达，而这在很大程度上取决基因治疗所采用的载体系统。
基因治疗载体可分两大类：病毒性载体和非病毒性载体。
2.2.1 病毒性载体病毒性载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、疱疹病毒等。
逆转录病毒应用最早，研究也相当深入，目前仍被广泛应用。
逆转录病毒载体
反转录病毒是一类已知的RNA病毒。
该载体系统有两部分组成，一是带有外源基因的重组反转录病毒载体分子，二是能以反式提供病毒结构蛋白的包装细胞，其要求是能高效产生感染靶细胞的重组病毒颗粒，且无野生型的反转录病毒存在，后者是基因治疗安全性的关键问题。
逆转录病毒载体最大优点是：(1)转染谱广，可以感染各种细胞类型;(2)转入的外源基因可完全整合;(3)对细胞感染率高，达到100%;(4)感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。
根据报道利用逆转录病毒作为载体来进行血友病A的基因治疗已经有了很大的进展。
腺病毒载体
腺病毒(Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
临床上已运用Ad载体系统对囊性纤维病进行基因治疗，取得良好的效果。
Ad载体具有以下优点：(1)人类是Ad的自然宿主，因此比较安全;(2)靶细胞范围广，不仅能感染复制分裂细胞，也能感染非分裂细胞;(3)滴度高，可达1011～1012pfu·ml-1;(4)可在肠道及呼吸道内繁殖，其重组病毒可由静脉注射、肠道吸收或气管内滴注等多种方式给予，已达到有效的基因转移和治疗;(5)该载体没有包膜，不易被其补体所灭活，可直接在体内应用。
腺相关病毒载体
腺相关病毒(AAV)单链DNA病毒，是一种缺陷型病毒，只有与腺病毒、单纯疱疹病毒等共感染时才能进行有效复制。
与其他载体病毒相比：(1)AAV无致病性，并且在受染体上不会引发免疫反应;(2)宿主范围广，并可感染非分裂细胞;(3)AAV载体可将外源基因定点整合到人
类19号染色体长臂，基因表达稳定;(4)AAV是一种无包膜病毒，对各种理化处理稳定，易于分离纯化。
腺相关病毒载体目前已应用于临床治疗囊性纤维化病。
单纯疱疹病毒载体
单纯疱疹病毒载体(HSV)是一种长约152kb的双链DNA病毒，可在受染细胞的核中复制。
HSV载体具有以下优点：(1)宿主细胞广泛;(2)病毒滴度高;(3)外源基因容量大;(4)对神经细胞具有嗜向性，可在神经元细胞中建立终生潜伏性感染。
HSV载体的不足之处在于它的毒性。
其它，人们利用肝炎病毒、HIV病毒作为载体直接注射肝叶获长期表达，但对其安全性还有待进一步证实。
基因治疗存在的问题
社会和伦理问题
基因诊断和治疗技术是未来医学中的主流技术,但它也是一把双刃剑。
基因诊断中的道德问题包括基因取舍、基因歧视、基因隐私等;基因治疗中的道德问题包括基因设计、基因改造等。
基因诊断和治疗要坚持的道德原则有人类尊严与平等原则、知情同意原则、科学性原则、优后原则和治病救人原则等[5]。
总的来说，基因疗法面临的问题与任何一个重大新技术发展时所面临的问题是一样的。
这些技术能实现很多益处，但也会由于滥用而带来危害。
目前基因治疗所面临的问题
基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。
过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。
实际上，基因治疗也遇到了很多困难。
目前尚存在很多根本性的问题：许多基因缺陷病的早期诊断还有困难;缺乏对靶细胞定向导入基因的技术;基因治疗载体的安全性和有效性问题[6];导入基因的表达和调控问题;发现新的治疗基因，尤其是对疾病相关基因还不十分清楚的肿瘤基因治疗。
参考资料:
1.《生物技术概论》刘桂林中国农业大学出版社2010年
2.《人类基因治疗的现状及伦理争议》交通医学2012年第26卷第二期
3.《腺病毒载体在基因治疗研究中的应用》李爱玲陕西农业科学
4.《单纯疱疹病毒载体用于基因治疗的研究进展》国际病毒学杂志2007年2月第14卷第一期。