高效液相色谱
高效液相色谱
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
hplc高效液相色谱
hplc高效液相色谱HPLC高效液相色谱简介高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），也被称为液相色谱法（Liquid Chromatography），是一种广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域的分离技术。
HPLC色谱技术通过物质在液体流动相和固定相之间的相互作用，实现对分子化合物的分离、检测和定量。
相对于传统的柱层析技术，HPLC具有分离效率高、分析灵敏度高、分析速度快等特点，被广泛应用于科学研究和工业生产。
HPLC的基本原理HPLC色谱技术是建立在分配系数理论的基础上。
它通过固定填料上溶解物质与流动相中溶解物质之间的分配与再分配，实现目标化合物在固定相中的分离。
HPLC色谱法的基本步骤包括：样品制备、装柱、选择流动相、进样、洗脱分离、检测及数据处理等。
HPLC的主要组成部分HPLC主要由一系列组成部分组成，包括：溶剂输送系统、无菌进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等。
其中，溶剂输送系统用于控制流动相的输送速率和压力，确保流动相以一定速率通过色谱柱；无菌进样器用来将样品进样并转送到色谱柱中；色谱柱是分离目标化合物的关键组成部分，根据所分离物质的化学性质和目标要求选择合适的色谱柱；检测器用来检测溶质的浓度，并将信号转换为电信号输出；数据处理系统用来处理和分析检测到的信号，得出结果。
HPLC的种类和应用领域根据不同的分离机制和柱填料，HPLC可以分为很多不同的类型，包括：反相色谱、离子交换色谱、分子筛色谱等。
反相色谱是最常用的一种HPLC技术，其应用领域非常广泛。
例如，在药物研究领域，HPLC被广泛应用于药物分析、药代动力学研究、质量控制等方面。
在环境监测领域，HPLC被用来检测土壤和水体中的有机污染物、重金属和农药等化学物质。
在食品安全检测领域，HPLC被用来检测食品中的添加剂、农药残留和重金属等有害物质。
HPLC的发展和进展自HPLC技术在20世纪60年代首次提出以来，随着科学技术的不断发展，HPLC技术也在不断进步和改进。
什么是高效液相色谱(HPLC)
（高效液相色谱）？
1
什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 2004年，液相色谱的仪器和 色谱柱技术取得了进一步发 展，在分离度、速度和灵敏 度方面实现了显著提升。需 要具有更小颗粒[1.7微米]的 色谱柱和具有专门功能的仪 器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高 的性能水平。必须从整体上 创建一套新系统来执行超高 效液相色谱（现在称为 UPLC技术）。
2
简史和一些定义
• 液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初 定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶 剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先 驱性研究。
• Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙] 和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物 叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯 溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样 品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快 于其他组分。
• 高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够 分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目 前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。 HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健 品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。
6
3
什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至 小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事 基础研究。这让我们可以一窥这项技术 的未来。
• 图：HPLC色谱柱
高效液相色谱法 HPLC
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱
高效液相色谱高效液相色谱，又称高压液相色谱（HPLC，High Performance Liquid Chromatography），是一种重要的色谱技术，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
相较于传统液相色谱，高效液相色谱具有分离效果好、分析速度快、灵敏度高等优势，因此成为现代分析实验的核心技术之一。
高效液相色谱的原理基于物质在不同相互作用力下的差异，通过样品在固定相上的分配行为，实现对不同成分的分离和分析。
其核心部分是色谱柱，包括固定相、流动相和样品分子。
其中，固定相是一种特定的固体或液体材料，具有一定的孔隙结构和表面特性，用于捕获和分离样品成分。
流动相则由溶剂组成，可以通过与固定相的相互作用调节分离效果。
而样品分子则根据其在固定相上的亲疏性，相继被吸附、扩散和解吸，最终实现分离。
高效液相色谱的分离过程包括样品进样、柱温控制、流速调节等步骤，每个步骤都需要严格控制，以保证分离效果和结果准确性。
在样品进样之前，通常需要采用样品前处理方法，如固相萃取、溶剂萃取等，以去除杂质和提高分析物的浓度。
然后，样品通过进样器进入色谱柱，通过控制流速和柱温，使样品成分在固定相上发生分配行为，从而实现分离。
最后，通过采集柱洗脱出来的物质，并通过检测器检测其浓度变化，得到分析结果。
高效液相色谱的关键是选择适当的固定相和流动相。
不同的样品性质和分析要求需要选择不同的固定相。
常见的固定相包括疏水相、离子交换相、亲水相等。
此外，流动相的选择也非常重要，常见的流动相溶剂有水、有机溶剂（如甲醇、乙腈）等。
合理选择固定相和流动相能提高分离效果，提高检测灵敏度。
高效液相色谱有多种检测器可供选择，常用的有紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）、荧光检测器、质谱检测器等。
通过检测器的信号，可以得到样品的浓度信息，从而进行定量分析。
高效液相色谱在药物分析中的应用广泛。
例如，针对不同药物的检测需求，可以选择不同的色谱柱和流动相，在合适的检测器下进行分析。
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
第五章高效液相色谱法
数据处理系统
打开工作站，选择工作通道 编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法 输入路径名、样品名、操作者等 样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等
2019/7/25
四. 液相色谱固定相
1.液-固色谱固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响
小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
2019/7/25
气相色谱中的固定相原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的 工作，一般很少自行制备。
2019/7/25
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2019/7/25
二极管阵列检测器
样品池 D2 / W 灯
光栅
每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值
二极管阵列
二极管阵列检测器的优点
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
2019/7/25
2. 液-液色谱固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
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液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
16
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
中国药典2020 高效液相色谱
中国药典2020 高效液相色谱第一部分：高效液相色谱的概述高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种分离和分析化合物的重要技术。
它通过液相色谱柱将混合物中的化合物分离出来，然后利用不同化合物在柱中的分配和吸附作用，采用不同的流动相来实现化合物的分离和分析。
HPLC已成为分析化学中不可或缺的技术手段，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
第二部分：高效液相色谱的原理高效液相色谱的分离原理是基于样品与固定相的相互作用来实现的。
样品经过柱子时，不同的成分会在固定相和流动相的作用下以不同的速率迁移，从而实现分离。
常用的固定相有反相、离子交换、凝胶等。
流动相通常是有机溶剂和水的混合物，也可以根据样品的性质来选择适当的流动相。
在分离过程中，通过调节柱温、流速、流动相和检测器参数等因素，可实现对目标物的选择性提取和分离。
第三部分：高效液相色谱的仪器设备高效液相色谱仪主要包括进样器、色谱柱、泵、检测器和数据处理系统等组成。
进样器用于将样品引入色谱柱，色谱柱是色谱分离的关键部分，泵用于推动流动相，检测器用于监测样品的出峰情况并进行定量分析，数据处理系统用于处理和分析所得的色谱数据。
现代高效液相色谱仪通常还配备有自动进样和自动数据处理功能，提高了分析效率和准确性。
第四部分：高效液相色谱的应用HPLC技术在药物分析中有着广泛的应用，可以用于药物的纯度检测、含量测定、稳定性研究等。
它还可以用于分析环境中的有机污染物和重金属离子、食品中的添加剂和残留物、植物中的活性成分等。
此外，HPLC还可以用于生物分析，如蛋白质和肽类的纯度和组成分析、核酸和小分子的分析等。
第五部分：高效液相色谱的发展趋势随着科学技术的不断进步，高效液相色谱仪的性能和分析能力不断提升，包括色谱柱材料的改进、检测器的灵敏度和分辨率的提高、数据处理系统的智能化等。
同时，绿色分析、微型化、高通量分析等也成为研究热点。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱(HPLC)简介
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动
相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失，酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。
高效液相色谱（HPLC）简介
目
1, 液相色谱分析法的发展 2, 高效液相色谱的特点 3, 高效液相色谱仪简介 4, 液相色谱法介绍 5, 分析方法的选择 6, 实际分析操作过程
录
1、液相色谱分析法的发展
20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液 相色谱法。经典液相色谱法包括柱色 谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 随着色谱理论的发展、高效细微 固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏 度检测器的应用，高效液相色谱法得 到了突破性的发展。
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机 化合物有响应。 特点： 灵敏度高；
线性范围宽；
流通池可做得很小(1mm × 10mm ，容积 8μL)； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展；
高效液相色谱的定义
高效液相色谱的定义
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种分离、检测物质的分析方法，是液相色谱技术的一种。
它利用高压泵将样品溶液注入色谱柱中，利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，实现不同组分的分离和检测。
与传统的液相色谱相比，高效液相色谱具有更高的分离效率和更高的分离精度，可以对复杂混合物进行高效分离和准确定量。
高效液相色谱广泛应用于生命科学、化学、制药、食品科学、环境科学等领域的研究和生产中。
高效液相色谱是一种分离和检测物质的分析方法，其原理是利用物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，通过色谱柱将混合物分离出不同组分，并通过检测器进行检测和记录。
高效液相色谱与传统的液相色谱相比，具有更高的分离效率和更高的分离精度，可以对复杂混合物进行高效分离和准确定量。
高效液相色谱的基本组成包括高压泵、色谱柱、检测器和数据处理系统等部分。
高压泵将样品溶液注入色谱柱中，通过调整流速和梯度，使得不同组分在柱中的停留时间不同，从而达到分离的目的。
柱子中填充着不同材料的填料，如硅胶、氧化铝、聚合物等，这些填料具有不同的孔径和表面特性，可以针对不同的化合物进行选择性分离。
检测器用于检
测分离后的组分，常用的检测器有紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
数据处理系统用于处理和分析色谱图，得出分离组分的质量和数量等信息。
高效液相色谱的优点包括：分离效率高、分离精度高、适用于复杂混合物的分离和检测、样品消耗少、分析速度快等。
因此，它在生命科学、化学、制药、食品科学、环境科学等领域的研究和生产中得到了广泛的应用。
高效液相色谱
应用
由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、 适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工 业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用 极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化 合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固 醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。
液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统由 两相——固定相和流动相组成。液相色谱的 固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或 在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换 树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。根据各组分在固定相及流动 相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均 匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称 现代液相色谱。
敏感，且不适于梯度淋洗。
平面镜
样品
透镜
遮光板
光源
参比
光学零
光电转换 调零
放大器
记录仪
荧光检测器
许多有机物具荧光活性， 尤其是芳香族化合物具有很 强的活性。荧光检测器是一 种选择性很强的检测器，其
灵敏度比UV检测器高2～个数
量级。
电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电 阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。
流程及主要部件
流程
高效液相色谱
2 高效液相色谱仪
储液器 真空脱液器
高压泵
自动进样器 柱温箱
检测器 馏分收集器
图1 高效液相色谱仪示意图
由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统 组成。
进样系统
分离系统
高压输液系统
图2 高效液相色谱仪示意图
数据处理系统
检测系统
HPLC组成 主要部分：高压输液系统、进样系统、分离 系统和检测系统。
100mg
1g
高效液相色谱与经典液相色谱比较
➢ 与经典液相色谱的工作原 理相同，但使用效能却远 大于经典的液相色谱；
➢ 高效液相色谱又被称为 现代液相色谱。
（1）高柱效：由于新型高效微粒固定相填料的使用，柱效 可达30000块/m理论塔板数；
（2）高灵敏度：在高效液相色谱中常使用的紫外吸收检测 器的最小检测量可达10-9g，而荧光检测器的灵敏度可达10-11 g，非破坏性；
2.2 进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，把分 析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
微量注射器
定量管
采样
进样
六通阀进样器工作原理示意图
手动进样阀
定量管 接头
柱外效应
柱外展宽（柱外效应） ：色谱柱外的因素所引 起的峰展宽。主要包括进样系统、连接管道及检测 器中存在死体积。可分柱前和柱后展宽。
高效液相色谱
1 概述
高效液相色谱法（HPLC， high performance liquid chromatography）发展于20世纪60年代末；
它不受样品挥发性的限制，可完成气相色谱法不 易完成的分析任务；
适于分析沸点高、难气化、分子量大、受热不稳 定的有机化合物、生物活性样品，这些化合物约 占有机化合物ห้องสมุดไป่ตู้80％。
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高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography（HPLC）7.1 概述高效液相色谱法—高压液相色谱法 HPLC高效液相仪:流动相：液体固定相：柱子采用十分细小的颗粒填充，高效分离柱，高压泵输送流动相，柱后连高灵敏度检测器，对流出物连续检测。
高交效液相色谱分析过程高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。
7.1.1 高效液相色谱发展历史1903年茨维特发明液相色谱1931年Kuhn, Lederer，液固色谱分离结晶胡萝卜素为α和β异构体，同年制得叶黄素结晶，1938年从维生素B中分离出B6。
1938年获诺贝尔化学奖1958年Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，成为研究蛋白质和酶的重要工具。
1972年获得诺贝尔化学奖。
1968年出现商品化的高效液相色谱仪7.1.2 高效液相色谱的特点经典液相色谱高效液相色谱色谱柱：柱长10~200cm，内径10~50mm 色谱柱：柱长10~25cm，内径2~10mm常压或减压高压，40~50MPa填料颗粒大，75~600μm（200~30目）填料颗粒小，2~50μm（2500~300目）柱效低，20~50/m 柱效高，40000~60000块/m分析速度慢，1~20h 分析速度快，0.05~1.0h色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测设备不同GC：载气与组分无亲合力，体系和类型少，高温，柱外效应可忽略缺点，只分析可气化的试样HPLC：流动相对组分有亲和力，体系多，类型多，低温，可回收样品，柱外效应较大，缺通用型检测器，成本高2. 高效液相色谱的应用范围7.1.3 液相色谱的分类7.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素传质阻力系数C=流动相传质阻力系数+固定相传质阻力系数7.3.1 高压输液系统:1. 构成：储液罐/高压输液泵/过滤器/压力脉动阻力器2. 储液罐：盛入溶剂，连过滤器，防止颗粒进泵3. 高压输液泵: 密封性，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀。
压力：150～350×105 Pa。
作用：将流动相在高压下，连续不断地送入色谱系统。
高压目的：输送流动相及组分。
保持渗透性和快速分析。
装置：双活塞往复泵：稳定输出流量。
7.3.2 进样系统1. 作用：将试样引入色谱柱对分离产生影响：柱外展宽（柱前和柱后展宽）原因：进样系统、连接管道及检测器中存在死体积2. 进样装置：隔膜注射进样器，高压进样阀：六通阀进样装置7.3.3 分离系统-色谱柱和流动相1. 色谱柱作用：分离材料：内部抛光不锈钢管外型：内径：4mm ～5mm柱长：10cm ～50cm高效：填料粒度小：5~10μm塔板数：7 000 ～10 000固定相要求：耐高压基体：实心玻璃珠多孔活性材料：率相对硅胶而言比较低，重现性不好无定型硅胶: 最初的 HPLC 填料，粒径 >5 µm ，柱床稳定性差，比表面积较小，价格便宜球形硅胶: 现代 HPLC 填料，粒径小 (5 µm, 3 µm, <2 µm)，重现性好 ，稳定性好，分离效率高• 硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。
• 以前的纯度较低的硅胶（称为 A 型硅胶）, A 型硅胶是以金属硅酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。
• 纯度高、酸性较弱的硅胶 (称为 B 型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。
• 金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。
孔径 作用和效能< 60 nm对 HPLC 分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率 60 – 150 nm对小分子的分离效果理想 (MW < 4,000 to 130,000), 例如药物分子、传统的中药和小分子的缩氨酸 300 – 1,000 nm 对大分子的分离效果理想，如多肽、核苷和高分子 > 1,000 nm对聚合物的分离效果理想，如DNA 和生物大分子M+表面金属能与螯合化合物络合M SiOH内部的金属对表面硅羟基具有活化作用强酸性A 型硅胶 C18B 型硅胶C182.流动相（1）要求：针对分离组分有良好的选择性，与固定相不溶，对检测器有适当的响应，粘度适宜，化学稳定性，高纯度，安全（2）溶剂的特性参数：溶剂强度，溶解度，极性，选择流动相中溶剂的三角形图（3）流动相组成（4）梯度洗脱装置：梯度淋洗/洗提/淋洗（gradient elution）：将两种或两种以上不同性质但可以互溶的溶剂，随着时间改变而按一定比例混合，以连续改变色谱柱中冲洗液的极性、离子强度或pH等，从而改变被测组分的相对保留值。
目的：提高分离效率，加快分离速度。
分辨能力增加，峰形改善，为解决由k范围较宽的多组分复杂样品的分离，前面的分不开，后面的成分分离度太大，出峰慢，峰形差的问题7.3.4 检测系统检测器：用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。
要求：灵敏度，噪音低、线性范围宽、响应快，死体小、池体积小于15微升溶质性检测器: 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应:总体检测器: 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应:7.3.5 数据处理系统色谱参数的选择和设定：自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理；对采集和存储的数据进行后处理；自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。
常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
7.4 液相色谱法的主要类型7.4.1 分配色谱1.分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异进行分离。
根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。
分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
2.类型：据固定相状态分（1）液液色谱：固定相是通过物理吸附方法将液相固定液涂在载体表面。
缺点：物理浸渍的液体固定相，由于流动相的溶解作用或机械作用易流失，导致柱上保留行为改变。
（2）键合相色谱：固定相通过化学反应将有机分子键合到载体或硅胶表面上。
按固定相与流动相极性分3. 流动相选择：常用溶剂：己烷/甲醇/乙腈/水/乙酸乙酯/乙醇/四氯化碳常用溶剂的极性顺序：水(最大)>乙腈>甲醇>乙醇>四氢呋喃>正丁醇>己烷>煤油(最小)二元或多元组合溶剂:调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间4.固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用（1）表面多孔型固定相基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。
（2）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成；全多孔型固定相7.4.2 化学键合相色谱法（CBPC: Bonded Phase Chromatography ）涂渍固定液化学键合固定相:化学反应通过化学键将固定液结合在担体表面。
键合相色谱法：采用化学键合固定相的液相色谱法固定相的结构：载体或担体（基质)+功能层分类•化学键合相•反相键合相色谱•正相键合相色谱•离子对色谱和离子抑制色谱a. 硅氧碳键型：≡Si—O—Cb. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂应用最广；c. 硅碳键型：≡Si—Cd. 硅氮键型：≡Si—NR,-C4, -C8, -C18,-C6H5, -CN, -NH2,-SO3H, -COOH, -NR4＋Cl疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
分离机制：分配+ 吸附（以LLC为基础）特点：1）不易流失2）热稳定性好3）化学性能好4）盛载载样量大5）适于梯度洗脱A. 反相键合相色谱（RP-HPLC）（1）．分离机制：疏溶剂理论●非极性的烷基键合:“分子毛”，有较强的疏水特性。
●流动相：极性溶剂●任务：分离含有极性官能团的有机化合物时，●保留：分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；●洗脱：被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用，●分离：两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。
（2）固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）（3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性> 固定相极性底剂+ 有机调节剂（极性调节剂）例：水+ 甲醇，乙腈，THF（4）流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分t R↑（5）出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱（6 ）适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）反相键合相色谱法是高效液相色谱中应用最为广泛的一个分支，主要是因为：①各种不同碳链长度的非极性固定相已商品化，流动相由水及加入水中的少量有机溶剂组成，方便廉价，水的截止波长低，有利于痕量组分的紫外检测；②非极性固定相最适合于分离非极性或极性小的样品，对强极性或离子型化合物如生物碱、磺胺类药物也可通过调节流动相的pH值或在流动相中加入离子对试剂（离子对色谱法）实现分离；③色谱柱平衡快，适于梯度洗脱。
B. 正相键合相色谱（1）分离机制：存在溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力（2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相（3）流动相：极性小（同LSC）底剂+ 有机极性调节剂例：正己烷+ 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分t R↓，k↓固定相和流动相选择----n、k、α三者之间分子作用力：极性改变k，2～5，取决于流动相组成反相色谱：甲醇、乙腈、四氢呋喃和水改变α，改变流动相化学性质改变k值甾类化合物的分离k为定值时，改变α的影响（5）出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱化学键合相色谱法特点化学键合相色谱法适用：•氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）•异构体、极性不同的化合物，分离不同类型的化合物。
•氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性•分析极性大物质、糖类等7.4.3 吸附色谱（液-固吸附色谱）LSAC1.原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异。
过程：当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。