A549细胞培养方法
肿瘤实验报告实验结论
一、实验背景肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发生发展与细胞增殖和凋亡密切相关。
细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，对于维持生物体内环境稳定、消除异常细胞具有重要作用。
本研究旨在通过实验探讨肿瘤细胞增殖与凋亡的关系，为肿瘤的防治提供理论依据。
二、实验目的1. 观察肿瘤细胞在体外培养条件下的增殖情况；2. 评估肿瘤细胞凋亡水平；3. 分析肿瘤细胞增殖与凋亡的关系。
三、实验方法1. 细胞培养：采用人肺腺癌细胞系A549进行体外培养，置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
2. 细胞增殖实验：采用CCK-8法检测肿瘤细胞增殖。
将A549细胞以每孔2×10^3个细胞的密度接种于96孔板，分别培养0、24、48、72、96小时，每组设置3个复孔。
每孔加入10μl CCK-8试剂，孵育2小时后，用酶标仪检测各孔的吸光度值（OD值）。
3. 细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测肿瘤细胞凋亡。
将A549细胞以每孔1×10^5个细胞的密度接种于6孔板，分别培养24、48、72小时，每组设置3个复孔。
收集细胞，用Annexin V-FITC/PI双染液染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
4. 数据分析：采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。
四、实验结果1. 细胞增殖实验：A549细胞在体外培养条件下呈现出明显的增殖趋势，随着培养时间的延长，细胞增殖率逐渐增加（P<0.05）。
2. 细胞凋亡实验：A549细胞在体外培养过程中，随着培养时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高（P<0.05）。
3. 肿瘤细胞增殖与凋亡的关系：A549细胞的增殖与凋亡呈现出一定的负相关性，即随着细胞增殖率的增加，细胞凋亡率逐渐降低。
五、实验结论1. A549细胞在体外培养条件下具有明显的增殖能力，且细胞增殖与培养时间呈正相关。
A549细胞使用说明书
A549细胞使用说明书细胞基本信息产品货号YC-C016细胞名称A549中文名称人非小细胞肺癌细胞细胞形态上皮样，贴壁细胞传代比例1:3~1:590%F12K+10%FBS培养体系源井细胞培养未加双抗，客户可视实际情况选择添加。
冻存液体系50%F12K+40%FBS+10%DMSO特殊备注无STR鉴定细胞接收1)冻存细胞：如果是干冰运输的冻存细胞，收到后请立即转入液氮储存或短暂（24H)放至-80℃冰箱保存，或直接进行细胞复苏。
2)活细胞：如果是T25瓶活细胞运输，收到后用75%的酒精对T25瓶外表面进行消毒，之后放在5%CO2、37℃的细胞培养箱静置2h，静置后取出细胞瓶在显微镜下观察细胞贴壁情况和细胞汇合度，分别在200X和40X下各拍2个不同视野的细胞拍照记录。
如果汇合度达到80%以上的传代密度，可以进行传代操作，如果细胞汇合度没有达80%以上不够传代，可以将细胞瓶内的培养基吸出在50ml离心管中并标记该细胞专用培养基后备用，保留8-10ml继续培养至可传代。
注意：收到细胞后，活细胞首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否漏液、浑浊等现象。
冻存细胞若发现干冰已挥发完、冻存管瓶盖脱落、破损等异常情况，请务必拍照保留，并于收货24h内与我们联系（电话：400-688-9033；https://）。
细胞复苏1)准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30分钟，随后将冻存的细胞从液氮中取出，转移到-80℃冰箱，放置数分钟让残余液氮挥发；2)在超净台内用吸管吸取6-7mL完全培养液至15mL离心管中；3)将细胞从-80℃冰箱取出暂时放置于干冰里，复苏时稍稍甩动，去除残留的干冰和液氮，再迅速用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化；4)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，稍稍晾干。
用单道移液器将所有融化的细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，1100rpm室温离心4分钟收集细胞；5)超净台内小心吸弃上清，用单道移液器吸取1mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移至装有4mL完全培养液的T25cm2培养瓶中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。
细胞粘附实验报告
实验名称：细胞粘附实验实验目的：1. 了解细胞粘附的基本原理和过程。
2. 掌握细胞粘附实验的操作方法。
3. 分析细胞粘附的影响因素。
实验材料：1. 细胞：人肺上皮细胞（A549细胞）2. 培养基：DMEM培养基3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素、链霉素、透明质酸酶、细胞粘附抑制剂（如RGD肽）4. 仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、吸管、培养皿、移液器等实验方法：1. 细胞培养：将A549细胞接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%左右时进行实验。
2. 细胞分离：使用0.25%胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离，离心收集细胞沉淀。
3. 细胞浓度测定：将细胞沉淀重悬于DMEM培养基中，使用细胞计数仪测定细胞浓度。
4. 细胞粘附实验：a. 将细胞浓度调整为1×10^5个/mL。
b. 将培养皿分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的细胞粘附抑制剂，对照组不加。
c. 将细胞悬液加入培养皿中，置于细胞培养箱中培养。
d. 在不同时间点取出培养皿，观察细胞粘附情况，并拍照记录。
e. 使用显微镜观察细胞粘附情况，统计细胞粘附率。
实验结果：1. 实验组与对照组细胞粘附率比较：a. 在0小时时，实验组细胞粘附率为（±X）%，对照组细胞粘附率为（±Y）%。
b. 在1小时时，实验组细胞粘附率为（±X）%，对照组细胞粘附率为（±Y）%。
c. 在2小时时，实验组细胞粘附率为（±X）%，对照组细胞粘附率为（±Y）%。
2. 细胞粘附抑制剂对细胞粘附的影响：a. 在0小时时，加入RGD肽的实验组细胞粘附率为（±X）%，未加入RGD肽的对照组细胞粘附率为（±Y）%。
b. 在1小时时，加入RGD肽的实验组细胞粘附率为（±X）%，未加入RGD肽的对照组细胞粘附率为（±Y）%。
c. 在2小时时，加入RGD肽的实验组细胞粘附率为（±X）%，未加入RGD肽的对照组细胞粘附率为（±Y）%。
试验方案怎么写
试验方案怎么写试验方案是实验研究的基础，它详细描述了实验的目的、方法、步骤以及数据分析等内容。
下面是一份700字的试验方案写作参考：试验方案一、试验目的本试验的目的是研究某种药物对肿瘤细胞生长的抑制效果，探究其在肿瘤治疗中的潜力。
二、试验方法1. 材料准备：- 人体肿瘤细胞系（如A549细胞系）- 试验药物（如某种抗癌化合物）- PBST缓冲液- DMEM培养基- FBS- 0.25%胰酶-EDTA溶液- 96孔板- 显微镜2. 细胞培养：采用DMEM培养基加10% FBS对A549细胞系进行培养，将细胞移植进96孔板中，每孔2 × 104个细胞。
孔板放置在37℃恒温培养箱中孵育48小时，使细胞贴壁生长。
3. 药物处理：在细胞培养达到80%～90%的密度时，将试验药物通过稀释到不同浓度的PBST缓冲液中，并按照给定浓度进行处理。
控制组则使用纯PBST缓冲液进行处理。
4. 细胞活力检测：a. 用吸头从每孔去除培养基，加入200 μL新鲜的DMEM培养基。
b. 向每孔中加入20 μL M TT溶液，接着在37℃恒温箱中孵育4小时。
c. 4小时后，吸去溶液，每孔加入100 μL DMSO，轻轻摇动孔板以溶解结晶紫普尼，静置10分钟。
d. 用ELISA读板机检测每孔的吸光度，并记录数据。
5. 数据分析：根据吸光度数据绘制药物浓度与细胞存活率之间的曲线图。
使用适当的统计学方法分析数据，比较不同药物浓度下的细胞存活率差异。
三、预期结果通过本试验，我们预期观察到试验药物对A549细胞系具有明显的抑制作用。
绘制药物浓度与细胞存活率之间的曲线图后，我们希望发现药物浓度与细胞存活率呈现一定的剂量-效应关系。
四、安全措施在药物处理过程中，需要严格遵守实验室安全操作规程。
涉及有毒药物时，需佩戴防护手套和口罩，并避免直接接触药物和其溶液。
试验结束后，正确处置实验废弃物。
以上就是一份700字的试验方案写作参考，包括了试验目的、方法、步骤和数据分析等内容。
A549肺癌细胞条件培养液促进人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移
CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.44 No.1 2021 解剖学杂志 2021年第44卷第1期A549肺癌细胞条件培养液促进人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移*姜杨1王璐璐1金海峰1姚立杰1张嵩2刘丹阳3李永涛1张善强1沈雷1△（齐齐哈尔医学院，1 解剖学教研室，2 细胞生物学教研室，3 组织学胚胎学教研室，齐齐哈尔 161006）摘要目的：探讨A549肺癌细胞对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖和运动的影响。
方法：以提取A549肺癌细胞和BEAS-2B正常人肺上皮细胞上清液制备条件培养基，培养的hBMSCs分别为A549组和BEAS-2B组；2组均添50 nmol/L趋化因子-8（CXCL-8），分别为A549 C组和BEAS-2B C组，若同时添加100 nmol/L triciribine （Akt抑制剂）分别为A549 CT组和BEAS-2B CT组；A549组加入100 nmol/L triciribine为A549 T组。
正常条件下培养的hBMSCs为对照组。
ELISA检测细胞上清液中CXCL-8含量和hBMSCs裂解液Akt、P-Akt蛋白的表达。
MTT实验、流式细胞仪和transwell细胞小室实验分别检测各组hBMSCs吸光度值（A490值）、细胞凋亡率和细胞迁移数目。
结果：与BEAS-2B上清液相比，A549上清液中CXCL-8含量明显升高。
各组hBMSCs的A490值、细胞凋亡率、细胞迁移数目、Akt和P-Akt蛋白表达等均具有显著差异，尤以A549 C组hBMSCs最明显。
与A549 C 组相比，A549 CT组hBMSCs的A490值和细胞迁移数目、Akt和P-Akt蛋白表达均降低，细胞凋亡率升高较显著。
结论：A549细胞表达的CXCL-8能激活Akt通路，促进hBMSCs增殖和运动。
关键词趋化因子-8；人骨髓间充质干细胞；Akt信号通路；细胞迁移Conditioned media prepared from A549 lung carcinoma cells promotes the proliferation and migration of human bone marrow mesenchymal stem cells*Jiang Yang1， Wang Lulu1， Jin Haifeng1， Yao Lijie1， Zhang Song2， Liu Danyang3，Li Yongtao1， Zhang Shanqiang1， Shen Lei1△（1. Department of Anatomy，2. Department of Cell Biology，3. Department of Histology and Embryology， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006， China）Abstract Objective：To investigate the effect of A549 cells （lung carcinoma cells） on the proliferation and migration of human bone marrow mesenchymal stem cells （hBMSCs）. Methods： The supernatants of A549 cells and BEAS-2B cells （the normal human bronchial epithelial cell line）were extracted. hBMSCs cultured with the supernatants were called A549 group and BEAS-2B group respectively； 50 nmol/L chemokine-8 （CXCL-8）was added to both groups to form A549 C group and BEAS-2B C group； 100 nmol/L triciribine （Akt inhibitor） was added at the same time to form A549 CT group and BEAS-2B CT group； 100 nmol/L triciribine was added to A549 group to form A549 T group. hBMSCs incubated in the conventional condition were served as the control group. The CXCL-8 in the cell culture supernatants and the expression of Akt and P-Akt in hBMSCs lysates were tested by ELISA. MTT assay， flow cytometry and transwell assay were used to detect the absorbance （A490）， apoptosis rate and the number of migrating cells in each group respectively. Results： Compared with the BEAS-2B supernatant， the CXCL-8 in the A549 supernatant was significantly increased. There were significant differences in A490， apoptosis rate， the number of migrating cells， and Akt and P-Akt expressions of hBMSCs in each group， especially in A549 C group. Compared with the A549 C group， the A490 and the number of migrating cells， Akt and P-Akt expression of hBMSCs in the A549 CT group were reduced， but the apoptosis rate was increased significantly. Conclusion： CXCL-8 expressed by A549 cells can activate the Akt pathway and promote the proliferation and migration of hBMSCs.Key words C-X-C motif chemokine ligand-8；human bone marrow mesenchymal stem cell； Akt signaling pathway； cell migrationdoi： 10.3969/j.issn.1001-1633.2021.01.003·论 著·* 黑龙江省卫生健康委员会科研课题（2018470）第1作者 E-mail：*****************.cn△通信作者，E-mail：******************.cn收稿日期：2020-04-09；修回日期：2020-09-09间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是促成肺癌发生的因素之一[1]。
细胞凋亡实验报告
细胞凋亡实验报告细胞凋亡实验报告引言：细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持生物体内部平衡和发育过程中起着关键作用。
本次实验旨在通过细胞凋亡实验，探究不同因素对细胞凋亡的影响，从而进一步了解细胞凋亡的机制和调控。
材料与方法：1. 细胞系：使用人类肺癌细胞系A549作为实验对象。
2. 药物：选择化学药物紫杉醇（Paclitaxel）作为细胞凋亡诱导剂。
3. 细胞培养条件：将A549细胞系在含有DMEM培养基和10%胎牛血清的培养皿中培养，保持在37℃、5% CO2的恒温培养箱中。
实验步骤：1. 细胞培养：将A549细胞系接种于培养皿中，培养至细胞密度达到80%左右。
2. 细胞处理：将培养皿中的培养基抽取，加入不同浓度的紫杉醇处理液，分为高、中、低三个浓度组，每组设置相应的对照组。
3. 细胞观察：将处理后的细胞培养皿放回恒温培养箱中，培养24小时后观察细胞形态和数量的变化。
4. 细胞计数：使用显微镜观察细胞数目，并通过计数室内的细胞数目，计算细胞存活率。
5. 细胞凋亡检测：使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，采用荧光染料标记细胞并进行分析。
结果与讨论：在本次实验中，我们观察到不同浓度的紫杉醇处理后，A549细胞的形态和数量发生了明显变化。
在高浓度组，细胞数量明显减少，细胞形态发生变化，出现细胞收缩和凋亡体的形成。
而在低浓度组，细胞数量减少较少，细胞形态变化不明显。
对照组中，细胞数量和形态均与处理组相似。
通过细胞计数的结果，我们计算出了细胞存活率，并发现随着紫杉醇浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这说明紫杉醇可以诱导A549细胞发生凋亡，并且凋亡率与药物浓度呈正相关。
进一步使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，我们发现在高浓度组中，细胞凋亡率明显增加，而在低浓度组和对照组中，细胞凋亡率相对较低。
这与细胞存活率的结果相一致，进一步验证了紫杉醇可以诱导A549细胞发生凋亡的能力。
细胞凋亡是一种高度调控的细胞死亡过程，它在生物体内部平衡和发育过程中发挥着重要作用。
A549细胞
A549人肺癌细胞系A549 细胞正常状态下都呈长梭形.从你提供的细胞图片看,圆形细胞较多,可能是细胞生长过密,相互挤压所致!还有许多突起,估计是有其他细胞污染,或是培养液使用时间过长，有污染所致，建议更换新鲜培养液，用新瓶传代,密度不要过高!近来关于细胞过度传代的问题也引起了较为普遍的关注，由于过度传代造成遗传性状的不稳定性和一些表型的丧失使得体外生物学效应的偏差也日益增大，因此尽量在购买或者引进细胞株的时候尽量多多冻存低代次的细胞，以获得最接近原始建株细胞的生物学特性。
细胞冻存１．将细胞消化下来，移入离心管离心，弃上清２．准备冻存液比例：５０％ＦＢＳ＋４０％培养基＋１０％ＤＭＳＯ（现用现配）３．加１．５冻存液在离心管中，将细胞吹打均匀，移入冻存管内．放入－２０度冰箱２－４小时后．再放入－８０度冰箱过ye，第二天放入液氮罐保存.A549细胞,人肺癌细胞系常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。
5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。
A549细胞的培养
A549细胞的培养一、实验准备DMEM高糖培养基、胰酶—EDTA、15ml 离心管、PBS、75%的乙醇、DMSO、胎牛血清、烧杯、镊子、1ml/5ml移液枪、培养瓶、倒置显微镜1、细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、MgNACL 8.00g；KCL 0.20g;KH2PO4 0.20g;Na2HPO4 .。
12H2O 1.15g加水至1 000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。
2、胰酶—EDTA:结晶胰酶0.5g;EDTA盐溶液0.2g无Ca、Mg PBS 1 000ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。
3、DMEM高塘培养基（1）制备新鲜Millipore超纯水。
（2）称取所需量的干粉培养基，加入约终体积一半的三蒸水中；若配制一个包装的培养液，在将整个包装的干粉倒入三蒸水后，需用水洗包装袋内面2次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。
磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解。
（3）根据包装袋上的要求补加所需量的碳酸氢钠；（4）加水定容到终体积。
（5）调节pH至7.4。
（6）用无菌0.22um滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。
（7）用前加入10%的胚牛血清二、实验步骤1、A549细胞的复苏与培养（1）准备一个盛有37℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有A549细胞的冻存管，放于37℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化（1min 防护冻存管爆炸）。
（2）在超净工作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔，用移液枪吸取细胞液，转移到装有一定量的培养基的15ml的离心管中（3）1000~2000r,离心5min（4）取一个新的培养瓶，加入10ml预热新鲜培养基（5）离心完后，吸走上清液，吸取1ml预热的新鲜培养基将离心管中的细胞吹散开，转移到培养瓶中（6）放于倒置显微镜下观察，做好标记，于37℃、5%CO2下培养（7）24h后，更换新培养基（8）在超净工作台打开培养瓶瓶盖，吸走培养液（9）用PBS反复冲洗细胞2~3遍（10）加入预热好的培养基（11）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养2、A549细胞的传代（1）当细胞长到80%时，在超净工作台中打开培养瓶瓶盖，吸走培养液（2）用PBS清洗细胞2-3次（3）加入胰酶-EDTA，水平摇晃，使胰酶-EDTA布满细胞层，放于37℃下消化2min（4）取出，在倒置显微镜中观察细胞消化情况（细胞圆缩，轻轻敲细胞瓶时细胞脱落即止）（5）加入10ml预热新鲜培养基终止消化，将瓶底细胞吹打下来（吹打按顺序进行，从培养养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到），充分吹打细胞液，使其分散开来（6）吸走一半的细胞悬液，接种到新的培养瓶中，补足培养液（7）倒置显微镜下观察，做好标记，与37℃、5%CO2培养3、细胞的冻存（1）预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存预冷（2）用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，PBS冲洗两次，用胰酶消化细胞（尽可能温和）（3）再次用完全培养液悬浮细胞，将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中，用滴管轻轻吹打混匀（4）在每支冻存管中加入1ml细胞液，密封后标记冻存细胞名称和冻存日期（5）包好冻存管，放在-80℃冰箱过夜（6）放入液氮中冻存。
细胞毒性实验报告
细胞毒性实验报告细胞毒性实验报告细胞毒性实验是一种常见的科学实验方法，用于评估化合物对细胞的毒性作用。
本实验旨在研究不同浓度的化学物质对细胞的影响，并探讨其可能的毒性机制。
实验材料与方法：1. 细胞系：本实验选择了人类肺癌细胞系A549作为研究对象。
这是一种常用的细胞系，具有较高的增殖活性和易于培养的特点。
2. 化学物质：选择了化学品A、B和C作为实验物质，分别为已知对细胞具有不同程度毒性的化合物。
3. 细胞培养：将A549细胞系培养在含有适宜营养物质和生长因子的培养基中，保持在37摄氏度、5%二氧化碳的恒温培养箱中。
4. 细胞处理：将A549细胞分成不同组，每组细胞分别加入不同浓度的化学物质A、B和C，同时设置一个对照组，不加入任何化学物质。
5. 细胞存活率检测：使用MTT法检测细胞的存活率。
MTT是一种黄色的化学试剂，它能够被活细胞内的线粒体酶还原为紫色的产物。
通过测量产物的光密度，可以反映细胞的存活率。
实验结果与讨论：经过一定时间的培养和处理后，我们观察到不同浓度的化学物质对A549细胞的影响。
通过MTT法测定细胞存活率，我们得到了以下结果：在化学物质A的处理下，细胞存活率呈现浓度依赖性的下降趋势。
随着化学物质A浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这表明化学物质A对A549细胞具有明显的毒性作用。
进一步的研究发现，化学物质A可能通过抑制细胞的DNA合成和蛋白质合成来导致细胞死亡。
与化学物质A相比，化学物质B对A549细胞的毒性作用较弱。
在较低浓度下，细胞存活率相对较高，但随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这可能是因为化学物质B对细胞的毒性作用与其浓度成正相关。
进一步的研究发现，化学物质B可能通过干扰细胞的氧化还原平衡和细胞膜的完整性来导致细胞死亡。
化学物质C对A549细胞的毒性作用相对较弱。
在较低浓度下，细胞存活率接近对照组水平，但随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
进一步的研究发现，化学物质C可能通过干扰细胞的代谢过程和细胞凋亡通路来导致细胞死亡。
细胞转染实验报告
细胞转染实验报告细胞转染实验报告引言细胞转染是现代生物学研究中常用的技术手段之一，通过将外源基因或分子导入目标细胞，可以实现基因表达、蛋白质功能研究等多种目的。
本文将介绍一次细胞转染实验的设计、操作步骤和结果分析。
实验设计本实验旨在研究细胞内特定基因的表达情况，并通过观察细胞形态和功能变化，探究该基因在细胞生理过程中的作用。
我们选择了人类肺癌细胞株A549作为实验对象，并选取了目标基因X作为转染载体。
实验步骤1. 细胞培养：将A549细胞培养在含有适宜培养基的培养皿中，保持在37°C恒温培养箱中，供给适当的CO2和湿度。
2. 转染载体构建：将目标基因X克隆到适当的转染载体中，确保载体的稳定性和表达效率。
3. 细胞转染：将构建好的转染载体与转染试剂混合，加入到培养皿中的细胞上，进行转染操作。
注意控制转染试剂的浓度和处理时间，以避免对细胞产生过多的毒性。
4. 转染后处理：根据实验设计，对转染后的细胞进行适当的处理，例如培养在特定的培养基中，或添加特定的诱导剂。
5. 细胞采集：根据实验需要，在适当的时间点采集细胞样品，用于后续的分析。
实验结果1. 细胞形态观察：在转染后的细胞中，我们观察到了明显的形态变化。
与未转染的细胞相比，转染后的细胞出现了增殖减缓、形态不规则等现象，这可能与目标基因X的表达和功能变化有关。
2. 蛋白质表达分析：通过Western blot等蛋白质分析技术，我们检测到了目标基因X在转染后的细胞中的表达情况。
结果显示，与对照组相比，转染组中目标基因X的表达水平明显增加，这进一步验证了转染的有效性。
3. 功能实验：通过细胞增殖、凋亡、迁移等功能实验，我们发现转染后的细胞在这些生理过程中表现出明显的差异。
这表明目标基因X可能参与了这些功能的调控。
结果分析通过以上实验结果，我们初步得出了目标基因X在细胞中的表达和功能变化的结论。
然而，由于实验设计的局限性和实验条件的限制，我们还需要进一步的研究来验证和深入探究这些发现。
细胞培养的实验报告
细胞培养的实验报告细胞培养的实验报告引言：细胞培养是现代生物学研究中非常重要的一项技术，它能够使科研人员对细胞的生长、分化、增殖等过程进行深入研究。
本实验旨在通过细胞培养技术，观察和分析细胞在不同条件下的生长变化，以期对细胞生物学有更深入的了解。
实验材料与方法：1. 细胞培养基：含有营养物质、生长因子和抗生素的培养基。
2. 细胞培养器具：培养皿、培养瓶、离心管等。
3. 细胞：选择合适的细胞系进行培养，本实验选取了人类肺癌细胞系A549。
4. 细胞培养条件：细胞培养箱、恒温恒湿箱等。
实验步骤：1. 细胞的分离和传代：将细胞移植到含有培养基的培养皿中，使细胞附着并生长。
当细胞达到一定密度时，用胰酶等酶类将细胞从培养皿上剥离，然后将细胞转移到新的培养皿中，完成细胞的传代。
2. 细胞的培养和观察：将细胞培养在恒温恒湿箱中，定期观察细胞的生长情况，记录细胞数量、形态和颜色等变化。
3. 细胞的处理和实验操作：根据实验设计的需要，对细胞进行不同处理，如添加药物、改变培养条件等，然后进行相关实验操作，如细胞增殖实验、细胞凋亡检测等。
实验结果与分析：在本实验中，我们观察了A549细胞在不同培养条件下的生长变化。
首先，我们将细胞培养在常规培养基中，观察到细胞呈现出典型的贴壁生长方式，细胞数量逐渐增加，形态呈现出多角形。
随着培养时间的延长，细胞形态逐渐变得规则，细胞数量也逐渐增加。
接下来，我们改变了培养条件，将细胞培养在含有不同浓度药物的培养基中。
结果显示，随着药物浓度的增加，细胞数量逐渐减少，细胞形态也发生了明显的变化。
这表明该药物对细胞的生长和增殖产生了抑制作用。
此外，我们还进行了细胞凋亡检测实验。
通过染色和显微镜观察，我们发现在药物处理组中，细胞出现了明显的凋亡现象，如细胞核的碎裂和细胞体的收缩等。
而在对照组中，细胞呈现出正常的形态和结构。
讨论与结论：通过本实验，我们成功地进行了细胞培养并观察了细胞在不同条件下的生长变化。
支气管抑制实验报告
一、实验目的本研究旨在探讨香烟烟雾对支气管上皮细胞的影响，并探究MFG-E8在其中的作用机制。
二、实验材料1. 试剂：MFG-E8抗体、USP14抗体、小鼠抗人β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗、DAB显色剂、香烟烟雾提取物（CSE）等。
2. 细胞：人支气管上皮细胞系（A549）。
3. 仪器：细胞培养箱、显微镜、凝胶成像系统、酶标仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将A549细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于细胞培养箱中培养。
2. 香烟烟雾提取物处理：将细胞分为对照组、CSE处理组、MFG-E8过表达组、USP14敲低组。
对照组细胞不进行特殊处理，CSE处理组细胞用CSE处理，MFG-E8过表达组细胞转染MFG-E8过表达质粒，USP14敲低组细胞转染USP14敲低质粒。
3. MFG-E8蛋白检测：采用Western blot法检测细胞中MFG-E8蛋白的表达水平。
4. 铁死亡检测：采用细胞活性检测法检测细胞铁死亡情况。
5. 数据分析：采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。
四、实验结果1. MFG-E8蛋白表达水平：与对照组相比，CSE处理组细胞MFG-E8蛋白表达水平明显降低；与CSE处理组相比，MFG-E8过表达组细胞MFG-E8蛋白表达水平明显升高；与CSE处理组相比，USP14敲低组细胞MFG-E8蛋白表达水平明显降低。
2. 铁死亡检测：与对照组相比，CSE处理组细胞铁死亡程度明显升高；与CSE处理组相比，MFG-E8过表达组细胞铁死亡程度明显降低；与CSE处理组相比，USP14敲低组细胞铁死亡程度明显升高。
五、实验结论本研究发现，香烟烟雾降低了MFG-E8蛋白水平，导致细胞铁死亡程度升高。
MFG-E8过表达可抑制香烟烟雾诱导的铁死亡，而USP14敲低可减弱MFG-E8的抗铁死亡作用。
这表明MFG-E8在香烟烟雾诱导的支气管上皮细胞铁死亡中发挥重要作用，USP14可能是MFG-E8的重要调节因子。
A549细胞转染
A549细胞转染步骤
A.细胞接种:
1.转染前24小时左右对细胞进行转接，接种密度约为每孔0.3~1×105个细胞；
2.过夜培养。
B.RFect/DNA复合物包装(该步完成后应立即转染):
1.在1.5ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基，并添加适量的RFec(2~5µl/µg
DNA)。
用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。
2.在1.5ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基，并添加适量的DNA
(0.8~1µgDNA/孔)。
用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。
3.将RFect-培养基混合物滴加至DNA-培养基混合物中，用移液器轻轻混匀后在
室温静置15~20分钟后，立即转染。
注意：RFect-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要，切勿颠倒。
C.转染:
1.如特殊情况，可在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基，以防转染后孵育
阶段细胞密度太大、营养不足导致的细胞死亡。
2.将步骤B制备的复合物滴加至培养基中。
轻轻晃动培养皿以使复合物均匀分
布。
3.过夜培养24~48小时。
4.注意:如果转染后需要更换新鲜培养基，请于加入RFect/DNA复合物12~24小
时后进行。
培养基更换后，孵育24~48小时后再进行后续实验。
5.收获细胞，进行后续实验。
注意：RFect在完全培养基中(基础培养基中添加血清)具有最高的转染效率，因此转染前后不需要换成无血清培养基。
A549细胞培养方法
A549细胞培养方法1.培养基准备a. 选择适用于A549细胞的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）或RPMI-1640培养基。
b.将培养基加热至37℃，并过滤灭菌。
2.培养皿涂覆a. 取一定数量的25cm^2或75cm^2的培养皿，将足够的含有0.1%胶原酶（Collagenase）的PBS（磷酸缓冲盐溶液）加入培养皿中。
b.将培养皿放入无菌环境中，室温下静置1小时，使胶原酶充分涂覆培养皿。
c.弃去PBS，并用无菌的PBS洗涤3次，去除多余的胶原酶。
3.细胞传代a.从细胞存储库中取出A549细胞，并加入适量的预暖的培养基中。
b.用于培养的细胞密度通常为60-80%。
c.将细胞培养皿放入无菌的培养箱中，培养温度通常为37℃。
d.每2-3天更换一次培养基，并严格控制细胞的密度，避免细胞过度生长。
4.细胞分离a.用1X的胰蛋白酶-EDTA溶液或胆酸-EDTA溶液将细胞从培养皿上分离。
b.加入足够的胰蛋白酶-EDTA溶液或胆酸-EDTA溶液覆盖培养皿，静置5-10分钟。
c.观察细胞的离解情况，如果大部分细胞已经离解，使用移液器小心地将细胞转移到新的培养皿中。
d.加入足够的预暖培养基，使细胞达到适当的密度。
5.细胞冻存a.使用含有10%DMSO（二甲基亚砜）的冻存液处理细胞。
b.将细胞悬浮在培养基和冻存液中的比例为1:1c.将混合液加入冻存管中，缓慢冷冻，最后存储在液氮中。
6.实验前细胞恢复a.从液氮中取出冻存管，并立即放入37℃预暖的水浴中，快速解冻。
b.将细胞悬浮于预暖的培养基中。
c.将细胞放入无菌的培养皿，并按照细胞传代的步骤进行培养和分离。
7.注意事项a.保持无菌操作，避免细胞污染。
b.控制细胞密度，避免过度生长。
c.定期更换培养基，保持细胞健康生长。
d.定期检查细胞的形态和生长情况。
A549细胞培养方法
A549细胞培养方法1.A549细胞的传代：A.在细胞培养器中用无菌吸管吸取培养器中的A549细胞悬液；B.将吸取的细胞悬液转入离心管中，以200xg的速度离心5分钟；C.弃去上清液，用细胞培养基轻轻悬浮细胞沉淀，避免细胞的受伤；D.将细胞悬浮液分装到新的培养器中，加入足够的培养基；E.将培养器放入细胞培养箱中，以37°C和5%CO2条件下培养。
2.A549细胞的培养基配制：A.常用的A549细胞培养基配方为DMEM/F12，含有10%胎牛血清（FBS）；B.在无菌条件下，将DMEM/F12培养基倒入无菌培养瓶中；C. 加入10% FBS、1%青霉素/链霉素溶液（100倍浓度），最终体积稀释为100 ml；D.在细胞培养箱中保持4°C保存培养基。
3.细胞分裂周期的控制：A.A549细胞的最佳生长条件为37°C和5%CO2；B.细胞密度达到80-90%时，可以进行细胞分裂周期的控制；C.使用无菌吸管将培养器中的培养基离心，去除上清液；D. 加入足够的预温PBS或EDTA-Trypsin溶液，使细胞与其接触；E.将培养器放入孵化器中，以37°C孵育5-10分钟，直到细胞完全分离；F.加入足够的培养基终止胰蛋白酶切割细胞，离心沉淀，去除上清液；G.加入足够的新鲜培养基，将细胞悬浮液分装到新的培养器中，继续培养。
4.细胞的处理和保存：A.停止细胞培养前，将培养器中的细胞悬液用无菌吸管取出；B.离心培养物，去除上清液；C.加入足够的预冷无血清培养基，将细胞悬浮液分装到新的培养器中，即可保存；D.将培养器放入液氮保存。
通过遵循以上措施，可以有效地进行A549细胞的培养。
在实验中，一定要注意细胞的无菌操作，并且保持合适的温度、湿度和气体条件，以最大限度地维持细胞的健康和生长。
同时，及时进行细胞的传代和处理，确保实验的可靠和准确。
有了合适的培养方法，A549细胞可以在不同研究领域中广泛应用，如肺癌研究、药物筛选和基因表达分析等。
转染实验报告
一、实验背景siRNA（小干扰RNA）是一种具有高度特异性和高效性的RNA干扰（RNAi）技术，可以抑制特定基因的表达。
近年来，siRNA技术在基因功能研究、疾病治疗等领域得到了广泛应用。
本实验旨在探究siRNA在细胞中的转染效果，为后续的基因功能研究奠定基础。
二、实验材料1. 细胞：A549细胞（人肺腺癌细胞系）2. siRNA：针对p65基因的三对siRNA及阴性对照（锐博生物）3. 转染试剂：riboFECT CP（锐博生物）4. 仪器设备：细胞培养箱、细胞计数仪、倒置显微镜、荧光显微镜、凝胶成像系统等三、实验方法1. 细胞培养：将A549细胞接种于培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养至对数生长期。
2. siRNA稀释：将siRNA用无血清DMEM培养基稀释至50nM终浓度。
3. 转染：将A549细胞以每孔1×10^5个细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，按以下步骤进行转染：a. 将siRNA稀释液与riboFECT CP转染试剂按说明书比例混合，室温放置5分钟；b. 将混合液加入细胞培养孔中，轻轻摇匀，使细胞均匀吸附；c. 将培养板放入细胞培养箱中培养，转染时间为6小时。
4. 洗涤：转染结束后，用无血清DMEM培养基洗涤细胞2次，去除未吸附的siRNA。
5. 细胞培养：继续在细胞培养箱中培养细胞，收集转染后的细胞。
6. 检测siRNA转染效果：a. qRT-PCR检测：提取细胞总RNA，进行逆转录反应，扩增p65基因，检测siRNA对p65基因表达的抑制效果；b. Western blot检测：提取细胞总蛋白，进行蛋白电泳、转膜、抗体孵育等步骤，检测siRNA对p65蛋白表达的抑制效果；c. 流式细胞术检测：检测细胞凋亡情况，评估siRNA对细胞的影响。
四、实验结果1. qRT-PCR检测：与阴性对照组相比，三对siRNA均能有效抑制p65基因的表达，抑制率分别为78.6%、82.3%、85.1%。
A549细胞培养方法
A549细胞的培养A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。
一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1:2~1:3传代培养都是可行的。
一、[所需溶液]1、细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液（PBS）——无Ca2+、Mg2+NaCl 8.00 g；KCl 0.20 g;KH2PO4 0.20 g;Na2HPO4·12H2O 1.15 g加水至1000mL，将pH调至7.4，高压灭菌。
2、消化液（1）胰酶-PBS结晶胰酶 2.5 g;高压灭菌后的PBS 1000 ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置-20℃保存。
（2）胰酶—EDTA:结晶胰酶0.5 g;EDTA盐溶液0.2 g无Ca2+、Mg2+ PBS 1000 ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置-20℃保存。
3、细胞培养液：RPMI 1640培养液配制方法：（1）将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900 ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。
（2）加入丙酮酸钠0.1 g，NaHCO2 2 g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。
双抗的配置浓度为100 U/ml 青霉素和100 U/ml链霉素。
（一般市售的青霉素为80 万U/瓶，将其溶解于4 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml；市售的链霉素为100 万U/瓶，将其溶解于5 ml 三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml）。
（3）调整培养液的pH值，用pH精密试纸观察pH 7.2~7.4即可。
（4）过滤法除菌，所使用的滤器为O2加压过滤，0.22 μm滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。
（5）分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置-20℃保存。
二、［细胞的维持和培养］1、细胞的复苏（1）准备一个盛有37℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有A549细胞的冻存管，放于37℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。
贴壁细胞培养A549
北京索莱宝科技有限公司
贴壁细胞培养A549
细胞名称：人肺癌细胞；A549
形态特性：上皮样
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM/F12，10%FBS
传代方法：1:3-1:8传代
冻存条件：细胞冻存液
特征特性：该细胞系是1972年由Giard DJ通过肺癌组织移植培养建系的，源自一位58岁的白人男性。
A549能通过胞苷二磷脂酰胆碱途径合成富含不饱和脂肪酸的卵磷脂；角蛋白阳性。
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
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A549细胞培养法测定RCA实验报告
A549细胞培养法测定RCA实验报告
实验日期：
一、实验方法
1.取对数生长期的A549细胞，消化，计数。
2.用含10%FCS的DMEM培养基将细胞密度调整至4×105cells/mL，向12孔
板中加入1mL/well的细胞悬液，接种1块12孔板，37℃，5%CO2培养过夜。
3.弃去旧培养液，将2.5×109VP待测病毒样品稀释于10mL含10%FCS的DMEM
培养液中。
4.两孔为对照，其余10孔每孔加入1mL稀释好的待测病毒样品。
5.37℃，5%CO2培养14天，并在第5天和第10天换新鲜培养液，每孔加入1mL
培养液。
6.结果判断
加入待测病毒样品的10孔均无细胞病变效应(CPE)出现，同时，阴性对照的细胞正常，初步判断病毒样品的RCA检测合格。
二、实验结果
三、结果分析
注：该实验方法只用于实验过程中初步的病毒RCA检测，质控指标的检测按正式实验要求进行。
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A549细胞的培养
A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。
一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1:2~1:3传代培养都是可行的。
一、[所需溶液]
1、细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液（PBS）——无Ca2+、Mg2+
NaCl 8.00 g；
KCl 0.20 g;
KH2PO4 0.20 g;
Na2HPO4·12H2O 1.15 g
加水至1000mL，将pH调至7.4，高压灭菌。
2、消化液
（1）胰酶-PBS
结晶胰酶 2.5 g;
高压灭菌后的PBS 1000 ml
用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置-20℃保存。
（2）胰酶—EDTA:
结晶胰酶0.5 g;
EDTA盐溶液0.2 g
无Ca2+、Mg2+ PBS 1000 ml
用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置-20℃保存。
3、细胞培养液：RPMI 1640培养液
配制方法：
（1）将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900 ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。
（2）加入丙酮酸钠0.1 g，NaHCO2 2 g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。
双抗的配置浓度为100 U/ml 青霉素和100 U/ml链霉素。
（一般市售的青霉素为80 万U/瓶，将其溶解于4 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml；市售的链霉素为100 万U/瓶，将其溶解于5 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml）。
（3）调整培养液的pH值，用pH精密试纸观察pH 7.2~7.4即可。
（4）过滤法除菌，所使用的滤器为O2加压过滤，0.22 μm滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。
（5）分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置-20℃保存。
二、［细胞的维持和培养］
1、细胞的复苏
（1）准备一个盛有37℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有A549细胞的冻存管，放于37℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。
（2）1000~2000 r，3~5 min离心。
（3）在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。
（4）用1 ml枪头将上清液去除，加入1 ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。
（5）补充4 ml的RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。
（6）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。
（7）24h后，更换新的培养液。
（8）常规传代培养。
2、A549细胞更换新的培养液
（1）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
（2）用PBS反复冲洗细胞2~3遍。
（3）加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。
各种液体需要量（ml）
表面积25 cm275 cm2150 cm2
洗涤 3 5 10
胰酶1~2 1~3 2~5
培养液 5 10 20
（4）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。
3、A549细胞的传代
（1）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
（2）向已经长满的细胞中加入消化液1 ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2~3遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。
（3）加入1 ml消化液，在37℃培养箱中孵育5~8 min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。
（4）加入5 ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。
吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。
（5）吸取一半的细胞悬液，接种到新的25 cm2培养瓶中，补足培养液，并且添
加10%~20%的胎牛血清。
通常每瓶液体量为5~10 ml。
（6）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。
注意事项：
（1）所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。
所有液体均应调整pH至7.2左右，均不能超过7.4。
（2）细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。
（3）严格执行无菌操作的要求。
（4）尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。
（5）培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。
4、A549细胞的冻存
（1）消化已生长融合的单层细胞。
（2）用生长液悬浮细胞，并且添加10%的FCS和10%DMSO（二甲基亚砜）。
分装在2 ml容积的冻存管中。
（3）用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70℃冰箱中过夜。
（4）放入液氮中冻存。