真菌检验

真菌的微生物检验

§ 多细胞真菌由菌丝和孢子组成
菌丝分枝交织成团，形成菌丝体（Mycelium），并长有各种孢子，这类真菌即一般称为霉菌（Mold）。
§ 由于生活环境（如营养、温度、氧气等）的改变，有些真菌的孢子与菌丝两种形态可以
互变，这类真菌称为二相性真菌（dimorphic fungus），如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。
多见
无
单纯菌丝
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真菌的微生物检验
（二）检验方法：
§ 1．直接镜检：直接采取病变部位的标本，用显微镜检查有无菌丝及孢子的存在，本法迅速简便，是临床真菌检查最常用的方法
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真菌的微生物检验
2．分离培养：
取毛发、皮屑、甲屑等标本，用70％乙醇消毒，接种沙保氏琼脂斜面培养基，25℃培养 7～14天，根据菌落形态及颜色、并挑取菌落镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。
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真菌的微生物检验
（二）致病性和免疫性
§白色念珠菌可侵犯人体许多部位，可引起：
1. 皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处； 2. 粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。 3. 内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、心内膜
炎、脑膜炎、脑炎等。
§机体可产生一定免疫力。
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真菌的微生物检验
§ 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养；
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真菌的微生物检验
（三）免疫学试验
§用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。
§检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特异的诊断。
▪ 乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原 ▪ ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原 ▪ 免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原

检验科真菌检验流程PIM

常菌群，通常情况下不致病，只有在菌群失调、免疫力低下等一定条件下才会致病。是目前临床上深部真菌感染最常见的病原菌，且呈增长趋势。
深部感染分布于自然界，如土壤、腐败有机物、粮食和饲料等，有时也存在于正常人体的皮肤和粘膜表面。
（一）分类和命名
其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、丝孢菌纲、丝孢菌目、丛梗孢科，少数种具有性阶段归入子囊菌亚门、不整子囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科。其中对人致病的曲霉主要有烟曲霉
全国临床检验操作规程
真菌病原学检验程序
临床标本
直接检查
分子生物学检测直接镜检
经固定标本染色墨汁法法：亚甲蓝染色染色法法、革兰染色法、 P法A。S、荧光染色脑痰脓
脊液汁液
动
分离培养
物
实
沙氏培养基验
KOH法
25°C 37°C
毛发指甲皮屑脓汁痰液
观察菌落菌丝型酵母型
镜小生检培化
曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统，引起肺曲霉病。曲霉可局限在肺内感染也可播散到其他器官，甚至引起全身性感染。曲霉还可诱发超敏反应引起过敏性支气管肺曲霉病。
有些曲霉可产生毒素引起食物中毒，有的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作用，特别是黄曲霉毒素与人类原发性肝癌的发生密切有关。
深部感染真菌检验
养反应
病
检
检
理
测
测
组
抗
抗
织
原
体
标
本
葡聚糖
PAS
HE 甘露聚糖
全国临床检验操作规程（第四版） 783页图4-6-1
2015年3月第一版
真菌鉴定程序
标本的采集、运送和保存

检验真菌的方法

检验真菌的方法
1. 直接镜检法：将短柄棉签蘸取患部分泌物、皮屑、毛发等样本，涂于玻璃片上，用40倍至100倍的显微镜下观察，检测真菌的形态和数量。

2. 细胞学检查法：可采用细胞学方法检查骨髓、淋巴结等组织样本中是否存在真菌，包括涂片法、细胞学初筛法、细胞学制片法等。

3. 培养法：将样本接种于含有丰富营养成分的培养基上，利用真菌的生长特点判定是否存在真菌的培养。

4. 核酸检测法：查找真菌的DNA或RNA序列，并使用PCR 技术的手段拓展浓度，最后用电泳技术侦察出真菌的情况。

5. 基于免疫学的检测：包括诸如ELISA和荧光法等方法，主要检测真菌产生的免疫球蛋白或抗原，以用于检测真菌是否存在。

真菌感染检验

浅部感染真菌检验-皮肤癣菌
❖ （三）真菌检验
❖ 1.标本的采集、运送和保存
❖ 1）甲标本采集标本前用75%乙醇彻底清洁病甲，以减少培养时的细菌污染，提高镜检的阳性率。钝刀用高压或者火焰灭菌，从甲的变色、萎缩或变脆部位、健甲与病甲的交界处取材，保证一定量与一定深度标本。甲标本建议取材后立刻进行真菌镜检及培养，甲标本应尽量剪碎后接种。对于伴有甲沟炎患者的取材，应采用棉拭子，75%乙醇清洁局部后沾取损害分泌物，每位患者至少应取两个拭子，放入无菌试管中以备镜检和培养。
❖ 侵入表皮后，在皮肤角质层外2/3处生长、繁殖，引起一种慢性、无症状或轻微症状的皮肤斑疹，呈灰白色、褐色或淡黄色，上面附着细小糠皮样鳞屑，有时可融合成片，似汗渍斑点，俗称汗斑即花斑癣（tinea versicolor）。皮损最常见于胸、背、臂的上半部皮脂腺丰富部位。病程缓慢，多年不愈，对健康无碍，但影响美观。油性皮肤易感，而且与遗传、免疫缺陷等因素有关，诱发因素为高温多汗。近年大量研究显示，糠秕马拉癣菌还可引起毛囊炎，可能为脂溢性皮炎的重要发病原因之一。
浅部感染真菌检验-皮肤癣菌鉴定
❖ 1.毛癣菌属在SDA（加CCG）上27+1℃培养，毛癣菌属菌落生长速度慢到中等；质地光滑到毛状；表面呈白色、黄色、米黄色或红紫色，背面呈苍白色、黄色、褐色或红褐色。显微镜下大分生孢子呈多细胞、圆柱状、棒状或香烟形，壁光滑，常缺乏。小分生孢子呈单细胞、圆形、梨形或棒形，孤立或像葡萄状群生。有时存在关节型孢子和厚膜孢子。
浅部感染真菌检验-皮肤癣菌
❖ （三）真菌检验
❖ 1.标本的采集、运送和保存
❖ 2）皮屑标本采集标本前用75%乙醇清洁取材区域。用高压或者火焰灭菌钝刀，从损害的边缘向外刮取或用剪刀剪去疱顶。如果鳞屑量较少或婴幼儿患者，可采用粘着透明胶带或粘着皮肤采样送检，将透明胶带粘着面紧压于损害之上，然后剥下，将粘着面向下贴在透明载玻片上送检。皮屑标本建议取材后立刻进行真菌镜检及培养。

蒸馏水100 ml配制：用蒸馏水将氯化钠溶解即可。 25、观察菌落形态时应注意什么？观察菌落形态时应注意：（1）菌落性质，是酵母菌还是霉菌；（2）菌落大小，一般病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；（3）菌落颜色，一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深。（4）致病性真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉；致病性真菌有时使培养基开列，但污染霉菌很少引起培养基开列。 26、分离皮肤真菌的皮肤真菌实验培养基是什么？培养基是：（DTM）含蛋白胨、葡萄糖、酚红、放线菌酮、庆大霉素、四环素等成分。由于皮肤真菌的代谢产物呈碱性，以致其生长周围的培养基呈红色。 27、分离新生隐球菌的选择培养基是什么？分离新生隐球菌的选择培养基是左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养基，因新生隐球菌有酚氧化霉（Plrno oxidase）活性，此霉与左旋多巴和枸橼算铁反映时，能氧化O-联苯酚形成黑素而呈褐色至黑色，或酚氧化霉和咖啡酸作用而显棕色菌落。 28、真菌培养的方法有几种？各自优缺点是什么？培养方法有平皿培养、大试管培养和玻片培养等。平皿培养的优点是表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。大试管培养的优点是水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存。玻片培养（为量培养、小培养）是将培养皿的真菌培养切成一个1cm*1cm的小方块在无菌载玻片中央，然后将真菌点种于小方块培养基的一侧，再盖上无菌盖玻片后培养，培养后将其盖玻片放入另一载玻片上于显微镜下观察菌丝和孢子，可用于真菌菌种的鉴定。 29、真菌的生化反映有哪些？检验真菌常用的生化反映有糖（酵）类发酵试验、同化碳源试验、同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、明胶液化试验和脲酶试验等。主要用于检验深部感染的真菌。 30、配置培养基的一般步骤是什么？（1）按要求称取脱水培养基，倒入所要求量的蒸馏水中，反复搅拌使各成分混合成均匀混悬液。（2）各成分混合均匀后以文火缓慢加热并不断搅拌，煮沸1 min，不能过热，以免破坏有效成分。（3）分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后，均待培养基冷却至45-50度时分装。（4）高压灭菌一般为118-121度，6.81kg

真菌临床检验技术

真菌临床检验技术真菌临床检验在诊断和治疗真菌疾病中扮演着至关重要的角色。

由于真菌感染菌种构成的变化，新的条件致病真菌的出现，以及真菌感染率的提高，我们需要更为精细和深入的检测工作，以便确定真菌种类和其对抗真菌药物的耐药性。

对真菌进行精确的识别和耐药性分析，可以为临床治疗提供重要依据，从而有助于患者的快速恢复。

这里就带大家一起来了解常见的真菌临床检验技术。

1.标本采集标本采集是检验的基础，需根据病人的具体情况和疾病种类，选择合适的采集方法。

如果疑似浅表真菌感染，例如体癣，可刮取病变部位的边缘痂皮。

对于疑似深部真菌感染，需要采集的标本包括脓液、痰液、脑脊液、血液等。

无论何种情况，标本的采集都需要在尚未使用药物治疗前完成。

如果已经用药，需要停药一周后才能再次采集标本。

另外，标本的采集必须足量，一般情况下，活体组织需要两份（一份用于显微检查和培养，一份送给病理科进行检查），皮屑需要两块，胸腔液为20毫升，脑脊液和血液为5毫升。

在操作过程中，需要保证无菌，避免二次感染。

采集完成后的标本要尽快送检，保存时间不超过两小时，特别是对于深部真菌标本。

2.直接检查法真菌直接检验主要在显微镜下进行。

首先，取一部分患者的标本，放置在玻璃载片上，加入适量的载液。

在平均分布标本后，用另一块玻片覆盖。

待片刻，利用火焰迅速烘烤载玻片，但不可持续加热以避免结晶。

随后，轻压盖玻片，除去气泡的同时使标本尽可能压薄。

清理周围的溢液后，可以用显微镜观察。

初步选择低倍镜，观察是否存在孢子或菌丝。

确定存在后，使用高倍镜进行细致观察，描绘出孢子和菌丝的排列、大小、位置、特征和形态等。

真菌直接检查是一种较为快速和直接的检测方法，其结果可以明确患者是否被真菌感染。

如果结果为阳性，可以确诊患者的真菌感染；如果结果为阴性，仍不能排除真菌感染的可能性。

通过显微镜，我们可以明确部分病原菌种，如花斑癣菌、新型隐球菌等，也能够确定某些特定的菌属，如念珠菌属。

真菌检验操作生物安全要求

真菌检验操作生物安全要求真菌检验是一项涉及到生命科学和生物安全的重要实验。

在进行真菌检验操作时，实验人员需要遵守一定的生物安全要求，以保障自身安全并避免对环境造成负面影响。

实验人员生物安全要求1. 培训在进行真菌检验操作之前，实验人员应接受培训，掌握真菌实验操作、生物安全基本知识以及应急处理措施。

2. 个人防护实验人员在进行真菌检验操作时，应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套、口罩等。

更换实验服、洗手、戴好手套等操作时都应注意生物安全。

3. 安全操作实验人员在进行真菌检验操作时，应遵循规范的实验操作流程，如操作要求仔细阅读实验手册，操作前应先确认所需试剂和设备齐全。

4. 废弃物处理实验人员在进行真菌检验操作后，应妥善处置废弃物，并避免将实验室中的废弃物外带，避免对环境造成污染。

实验室生物安全要求1. 实验室设置真菌检验的实验室应配备通风设备、安全柜等设备，保证室内循环空气。

实验室的温度、湿度等也需要严格控制，符合实验要求。

2. 实验室管理实验室管理人员需要对实验人员进行生物安全及实验操作规范知识培训，监督实验人员的操作，保证实验室安全、卫生环境良好。

3. 实验室清洁实验室应每日定期清洁，特别是实验室表面、设备表面、实验台等需要定期清洁、消毒，遵循规范的操作流程。

4. 实验室设备维护实验室里的设备应在定期进行维护，保证设备的完好性，避免操作中出现设备失效等问题，影响实验过程。

总结实验人员在进行真菌检验操作时，应注意生物安全要求，遵循规范的实验操作流程，保障自身安全并避免对环境造成负面影响。

实验室管理人员需要对实验室进行管理，定期进行清洁、维护、培训等，确保实验室环境安全、卫生、稳定。

真菌感染的常规检验方法

真菌感染的常规检验方法真菌的临床实验室检查一般包括标本采集、直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应及免疫学试验等。

以直接镜检和分离培养最重要。

1标本采集不同真菌感染应采用不同的临床标本。

浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。

深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。

采集标本时应注意无菌操作。

采集标本后应及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2h，以免标本变质污染。

标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。

2检查方法2.1 直接检查法直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。

其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。

但是，除了少数真菌外，多数不能确定其种类。

由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进一步确定。

直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。

2.1.1 不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～200g／L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。

2.1.2 染色标本检查有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方法如下。

(1)革兰染色法：多用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌等。

所有真菌均为革兰阳性。

(2)乳酸酚棉蓝染色法：取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌被染成蓝色。

该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。

(3)荧光染色法：用0.1％吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌为红黄色，曲霉菌为绿色。

2.2 分离培养法真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。

检验科真菌学常见检测与分析方法

检验科真菌学常见检测与分析方法在检验科真菌学中，常见的检测与分析方法有多种，本文将详细介绍其中的几种方法。

一、直接镜检法直接镜检法是最常用的真菌检测方法之一。

该方法通过将待检样品直接放置在显微镜下观察，利用显微镜放大功能，检测并鉴定真菌的存在。

该方法操作简便，可以迅速获取初步结果，但其只能观察到菌丝、孢子等大型的真菌结构，对于微小的真菌可能存在漏检的情况。

二、培养法培养法是真菌学研究中较为常用的方法之一。

通过将待检样品放置于培养基上，促使真菌生长繁殖，从而观察和鉴定真菌的种类和数量。

培养法可以提供更多的细节信息，如真菌的形态、颜色、生长速度等，有助于进一步分析和鉴定。

然而，培养法需要较长的时间，一般需要数天至数周，且对于一些难以培养的真菌无法得到准确的结果。

三、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术。

在真菌学中，PCR技术可以用来检测和分析真菌DNA，从而确定真菌的存在和种类。

该方法的优势在于其高度敏感性和快速性，能够快速检测到微量真菌，并且可以对样品中的复杂菌群进行分析。

然而，PCR技术需要专门的实验设备和试剂，且对实验操作要求较高。

四、质谱分析质谱分析是一种基于质荷比的分析方法，可以用于真菌学中的检测和鉴定。

通过将待检样品进行质谱分析，可以得到真菌的分子质谱图谱，进一步进行真菌的鉴定和分类。

质谱分析具有高灵敏性和高分辨率的特点，可以准确地确定真菌的种类。

然而，质谱分析设备昂贵且操作复杂，需要专业的技术人员进行操作和解读结果。

综上所述，真菌学的常见检测与分析方法包括直接镜检法、培养法、PCR技术和质谱分析。

每种方法都有其优势和局限性，选择合适的方法需要根据具体情况和实验目的进行综合考虑。

在真菌学研究和检测过程中，通过运用这些方法，可以对真菌进行准确的检测和分析，为疾病的防控和治疗提供重要的科学依据。

食品中真菌的检验

霉菌酵母菌快速检验纸片使用方法
▪ 1．取样品25g（或mL）放入含有225mL无菌水的玻璃瓶内，经充分振摇做成1:10的稀释液，用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液 1mL，注入含有9mL灭菌水的试管内，用 1mL灭菌吸管反复吸吹50次做成1:100的稀释液，以此类推，每次换一支吸管。
▪ 2．一般食品选3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如食用纯水和矿泉水等）可直接用原液检测。将检验纸片水平放台面上，揭开上面的透明薄膜，用灭菌吸管吸取样品原液或稀释液1mL，均匀加到中央的滤纸片上，然后轻轻将上盖膜放下，静置5分钟。
霉菌酵母菌快速检验纸片
该检验纸片可用于各类食品及饮用水中霉菌和酵母菌的计数，由霉菌营养培养基、吸水凝胶和酶显色剂等组成。与上面的传统方法相比，省去了配制培养基、消毒和培养器皿的清洗处理等大量辅助性工作，随时可以开始进行抽样检测，而且操作简便，通过酶显色剂的放大作用，使菌落提前清晰地显现出来，培养时间由一周缩短为48-72小时，非常适合于食品卫生检验部门和食品生产企业使用。
二、操作要点
（一）、采样
▪ 2、海运进口粮的采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过10000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。
二、操作要点（一）、采样
3、谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。
▪ 3．用手指先沿方格区边缘刮一下，防止水外流，然后再在中间轻轻推刮，使水分在纸片方格区内均匀分布，并将气泡赶走。
▪ 4．将加了样的检验纸片每15片叠放在一起，放入自封袋中，平放在28－35℃ 培养箱内培养48-72小时。5．霉菌和酵母菌在纸片上生长后会显示蓝色斑点，霉菌菌落显示的斑点略大或有点扩散，酵母菌落则较小而圆滑，许多霉菌在培养后期全呈现其本身特有的颜色。选择菌落数适中（10-100个）的纸片进行计数，乘以稀释倍数后即为每克（或毫升）样品

微生物实验室真菌检查质量控制流程

微生物实验室真菌检查质量控制流程1.设立实验室标准操作程序（SOP）在实验室进行真菌检查前，首先需要制定标准操作程序。

SOP应该包括实验的目的、所需材料和试剂、操作步骤、质量控制要求、仪器设备的校准和维护等详细信息。

制定SOP有助于确保实验的规范化和一致性。

2.确认标准菌株和对照菌株在真菌检查中，确定一些标准菌株和对照菌株对于质量控制至关重要。

标准菌株通常用于检验实验室技术的准确性和可重复性，而对照菌株则用于验证其中一实验的可靠性。

标准菌株和对照菌株的选择应根据实验的具体目的和要求来确定。

3.样品采集和处理4.质量控制样品准备5.实验室设备的校准和维护实验仪器和设备的精确度和可靠性对实验结果的准确性具有重要影响。

实验室应定期对仪器设备进行校准和维护，并记录校准和维护的结果。

这样可以确保仪器设备的正常工作和准确性。

6.检测方法的验证实验室进行真菌检查时，应验证所使用的检测方法的准确性和可靠性。

方法的验证包括可重复性和恢复率等。

验证的结果应记录并与实验室要求进行比较。

7.质量控制数据分析质量控制实验的数据分析是质量控制的最后一步。

通过对数据的分析，可以评估实验的准确性和可靠性。

如果质控数据不符合预期的结果，应重新检查实验过程，找出问题所在，并采取措施进行纠正。

8.质量管理体系的建立和维护在真菌检查质量控制流程中，建立和维护一个完善的质量管理体系是非常必要的。

质量管理体系应包括实验室SOP的建立和执行、质量控制记录的管理、人员培训和技能认证等。

定期对质量管理体系进行审核和评估，以确保体系的有效性和持续改进。

以上是一个典型的真菌检查质量控制流程。

质量控制流程的目的是确保实验结果的准确性和可靠性，以提高实验室的技术水平和服务质量。

实验室应根据自身的具体情况和实验需求，制定适合的质量控制流程，并根据实际情况不断改进和完善。

真菌常规检验相关问题讨论

热带念珠菌(C.tropicalis) 镰刀菌属(Fusarium spp) 荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum) 毛霉、根霉及其它接合菌科(Mucor,RhБайду номын сангаасzopus, and other fungiBelonging to the class
糖原染色（PAS）：孢子丝菌
沙黄染色法：糠秕孢子菌
嗜银染色（GMS））：卡氏肺孢子菌
真菌直接检验的材料方法
皮肤癣菌的取材
刮取
粘取
透明胶带法患处直接粘贴
培养物粘贴乳酸﹑苯酚和棉兰的作用
直接涂片的镜检及快诊意义
念珠菌镜下菌丝（+）孢子（+）
KOH压片
直接涂片的镜检及快诊意义
曲霉菌丝
真菌的常用接种方法
初代分离：划线接种
SDA液体增菌
点种
次代分离：包含以上
小培养：玉米吐温观察真假菌丝﹑厚壁孢子
丝状真菌的形态学观察
试管点种平板小培养
平板点种玻片小培养
二。真菌培养及鉴定
三）真菌的培养条件选择痰﹑体液等深部来源标本初分离35 ℃培养
24~48h后转25~30℃培养。（白色念珠菌毒力株和光滑念珠菌酶活性）皮屑毛发等癣菌类标本置25~30℃培养。马拉色菌分离置于35 ℃培养
真菌的各类孢子形态
常见临床丝状真菌孢子的发生方式
真菌孢子
有性孢子接合孢子子囊孢子
担孢子
无性孢子按产孢方式
芽生孢子
叶状孢子
按形态
大分生孢子小分生孢子
全壁芽生型
肉芽生型
关节孢子粉孢子厚壁孢子
瓶梗产孢
环痕产孢
孔出产孢
常见真菌的孢子特征

临床真菌学检验基本技术

二、真菌分类及存在形式
1、Ainsworth（1973）分类系统特点：成立菌物界，分2门，真菌门下分成5个亚门；取消藻状菌纲，依据鞭毛的有无划分成鞭毛菌亚门、接合菌亚门。
2、Alexopoulos & Mims （1979）分类系统
特点：成立菌物界，菌物界Myceteae、Fungi分3个门；真菌类依鞭毛的有无分2门。 3、菌物分别归属藻界、真菌界、和原生生物界的分类系统
三、真菌的一般检查
（1）、一般镜检
B、胶带粘贴法
用透明胶带直接贴于取材部位，数分钟后揭下，充分展平后，直接置贴于加有一滴浮液的载玻片上此液可以是10%~20%的KOH，也可以采用乳酸酚棉蓝染液（易于观察）。该法常用于花斑癣患处的直接检查。
三、真菌的一般检查
（2）、常规染色
▪ 乳酸酚棉蓝染色
特点：将藻界、真菌界、和原生生物界分开成三个独立的界属
➢与医学有关的真菌有四个亚门
接合亚门：毛霉、根霉等子囊霉亚门：酵母菌属、小孢子霉属等担子霉亚门：新生隐球菌、灵芝、食用菌等半知霉亚门：假丝酵母菌属、球孢子菌属等
➢最新的真菌分类
接合菌门子囊菌门担子菌门壶菌门
➢根据菌落形态分类：
酵母菌酵母样菌霉菌双相真菌
3、现代形态学技术，如自动成像分析、电子颗粒体积、分数几何学分析形态学的特点。
二、分子生物学鉴定
1、表型分类受限，生理生化技术在丝状真菌鉴定方面，或是费时费事或是结果不准。
2、PCR技术，可以分析少量真菌细胞，甚至单个真菌抱子。
3、选择通用寡核昔酸对真菌种特异性引物，测定其核昔酸序列。
菌丝和孢子
三、真菌的一般检查

真菌检验技术—真菌的培养技术(微生物检验课件)

染性真菌菌落不下沉,很少引起开裂。
❖ 通过培养可确定菌种，辅助直接检查的不足； ❖ 通常用沙保氏培养基（SDA）（22～28℃）； ❖ 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养；
❖ 温度 :22 ℃ ～ 28℃(深部真菌:28 ℃ / 37℃)需氧、湿度高;PH :4.0～6.0 (弱酸性)
真菌的分离培养
真菌培养是目前鉴定真菌的惟一方法。培养真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。菌落是鉴别真菌的方法。注意以下几点：
①菌落性质：酵母菌还是霉菌； ②菌落大小:病原性真菌菌落小，而条件致病性真
菌菌落大；
③菌落颜色:病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；
④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污
❖ 生长速度 : 慢(1～4周见典型菌落) ❖ 菌落特征 :酵母/酵母样菌 :光滑柔软、湿润;丝状
菌:疏松 (绒毛状、棉絮状、粉末状);颜色 (正 / 背面)

常用培养方法
❖ 试管法---初代培养、菌种保存 ❖ 大培养---纯种的培养、研究 ❖ 小培养---菌种鉴定 (玻片法钢圈法方块法)

真菌鉴定方法

真菌鉴定的方法主要有直接涂片、墨汁涂片、涂片或组织切片染色和培养检查12。

1.直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。

取标本置玻片
上，加一滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火
焰上稍加热溶解角质后，轻轻加压盖玻片使标本透明即
可镜检。

可用于检查有无菌丝或孢子，但不能确定菌种。

2.墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。

取一
小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片后直接
镜检。

3.涂片或组织切片染色：染色可更好地显示真菌形态和结
构。

革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等。

4.培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。

标本接
种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上，置室温或37℃培养
1-3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。

临床常见真菌检验—浅部感染真菌(微生物检验课件)

第十五章
真菌及检验
真菌形态检验技术
一、标本采集
常见标本类别
◆浅部感染：毛发、皮屑、指甲等 ◆深部感染：脓、痰、血液、脑脊液、宫颈分泌物等
一、标本采集
注意事项 ◆标本来源适宜 ◆用药前采集标本 ◆严格无菌操作 ◆标本量充足 ◆立即送检
一、标本采集检验程序
二、直接镜检
镜检的意义： ①有诊断意义，如浅部真菌病等； ②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌
一、浅部感染真菌
标本：病变部位标本。检验方法：
直接镜检分离培养荧光检查
微生物检验
心脑浸液葡萄糖血琼脂
培养基用途
真菌的常规培养真菌的常规培养观察白假丝酵母菌的厚膜孢子观察真菌菌落色素，用于鉴别生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌）深部真菌培养
二、培养方法
分离培养
平皿培养法
分离培养；观察菌落
斜面培养法
保存菌种
小培养法观察结构、生长发育过程
二、培养方法小培养法：
的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等。
镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用
其他检验方法鉴定。
菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。
常用方法：
标本
加热
KOH溶液
菌丝
镜检
孢子
鉴定
1. 生化反应鉴定
糖(醇)类发酵试验同化碳源试验同化氮源试验明胶液化试验尿素分解试验
2. 免疫学检查
3. 其他鉴定试验
鉴定
芽管形成试验 : 待检菌 → 动物血清 → 37 ℃、2~4h → 镜检观察芽管
厚膜孢子形成试验：待检菌 → 吐温-80玉米粉琼脂 → 37 ℃→ 观察厚膜孢子

真菌检验【送检】SOP--标本采集及处理课件

2h 内常温送检
4°C保存
24
眼(角膜刮片、玻璃体液等)标本采集及处理
. 角膜刮片或针吸玻璃体液。 . 15 分钟内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。角膜刮片直接接种
至不含抑制剂的培养皿中，采用 X 或 C 型涂菌方式，玻璃体液离心后取
沉淀物接种。
15min 内常温送检
不含抑制剂的培养皿接种培养
不能送检时，常温保存
19
无菌体液 (脑脊液、心包液、腹水和关节液) 标本处理二
. 标本大于 2ml，则 2000g 离心10 分钟，取沉渣接种。 . 若标本量少于 2ml，则将标本直接接种于培养基。
. 推荐使用细胞离心机对无菌体液进行涂片镜检。脑脊液可直接接种于血培养瓶。
离心10min
接种培养
涂片镜检
3
2. 最小抑菌浓度 MIC
按照标准操作规程进行体外真菌稀释法或连续浓度梯度稀释法药物敏感性试验时，在特定培养时间及温度的条件下，能导致特定程度肉眼可见真菌生长抑制的最低药物浓度。
4
3. 剂量依赖敏感 S-DD
. 给予高于常规给药剂量，且达到最大血药浓度时，临床有效。
4. 最低有效浓度 MEC
9
血液标本采集
. 推荐在抗真菌药物使用前，发热初期或寒颤期、采静脉血或骨髓液。 . 立即注入血培养瓶内并轻轻摇匀。至少采集 2 套。 . 标本与培养基比例为 1/10-1/5 (成人每瓶 8-10ml)、必须包括需氧瓶或
真菌瓶。
10
血液标本处理
. 2h 内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。
2h 内常温送检
6
6. 消化液 lysis solution
. 粘液溶解作用，用于呼吸道标本等的前处理，常用N-乙酰-L-半胱氨酸、 5%草酸或二巯基苏糖醇等。