真菌标本检验标准操作规程

真菌标本检验标准操作规程

1.目的

规范真菌标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。

2. 适用范围

各类真菌检测的标本。

3. 标本采集及处理

3.1 标本类型痰、尿、粪、脓液、脑脊液、血、拭子、皮屑、甲屑、气管穿刺抽取的痰液等。

3.2 标本采集与处理

3.2.1 痰液、气管穿刺抽取的痰液。

3.2.2 尿液早晨中段尿10ml，离心取沉淀液1ml，作真菌涂片及培养。

3.2.3 口腔、咽喉、外耳道、阴道、和直肠粘膜的标本应迅速放入内装1-2ml无菌蒸馏水的试管送检。常规KOH 涂片及SDA培养。

3.2.4 粪便无菌盒送检，挑取黏液、脓血接种于含氯霉素培养基上。

3.2.5 脓液脓液标本应置无菌广口有盖玻璃瓶或小的无菌平皿中，立即送检。

3.2.6 脑脊液采集于无菌试管3-5ml，立刻送检。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养

（SDA）25°C及37°一周。

3.2.7 血液分别于左右两侧无菌抽血3-5ml，立即置于脑心浸出液肉汤。

3.2.8 体液支气管积液、关节腔积液、心包积液、腹水等10ml离心沉淀后取0.5ml沉淀液作直接镜检(注意颗粒)及培养。

3.2.9 组织标本置于无菌平皿中立即送检，置无菌研钵或组织匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或切成1-2mm3的小块作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。

3.2.10 皮屑皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑。取材前75%酒精棉球消毒取材处，标本作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。

3.2.11 甲屑用细锉或牙签研磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的SDA平皿，25°C-28°C培养3周，并同时作KOH涂片。

3.2.12 毛发取病发15根、75%酒精消毒，3-5根作直接镜检，5-10根种于SDA斜面（加氯霉素），稍划破斜面掩埋。

3.3 标本拒收标准及处理参见《标本拒收程序》

4.试剂、培养基及仪器

4.1 接种针、电热灼烧器、显微镜、恒温培养箱、冰箱、全排式生物安全柜等。

4.2 常用培养基及血培养瓶放置于2-8°C冰箱，并在有效期内使用。

4.3 沙氏葡萄糖琼脂（SDA），科玛嘉念珠菌显色培养基米粉吐温琼脂，察氏琼脂，马铃薯葡萄糖琼脂，七叶苷琼脂，咖啡酸琼脂，API20CAUX板条，10%KOH，正常人或羊血清。

5. 真菌鉴定的质控（略）

6. 检验步骤

接收标本后，立即对标本进行编号、登记。

6.1 涂片检查标本置于载玻片后加1滴10%KOH，覆上盖玻片，微加热后轻压盖玻片，驱逐气泡并压匀标本，再以滤纸条吸去周围溢液。先在低倍镜下寻找(遮去强光源)，发现真菌的菌丝或孢子后经高倍证实，报告“真菌直接镜检阳性”。

6.2 培养

6.2.1 粪、痰标本可用无菌棉签或接种针挑取带血、黏液的病理部分，接种于含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂及科玛嘉念珠菌显色培养基，置于37°C培养48小时。

6.2.2 支气管保护性毛刷标本悬液、肺泡灌洗液、体液及尿等液体标本，可以无菌吸管吸取离心沉淀物约0.5ml，接种于上述培养基，37°C孵育48小时后如未见菌落生长，可报告“无真菌生长”。

6.2.3 脑脊液取离心沉淀物约0.5ml接种于2管沙氏葡萄糖琼脂斜面，分别置25°C及37°C孵育一周。

6.2.4 血分别左右两侧无菌抽血3～5ml，立即置于脑心浸出液肉汤。

6.2.5 皮屑、毛发接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面，置25°C～38°C培养2周。

6.2.6 甲屑以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的沙氏平皿25°C～28°C

培养3周。

7.结果报告

所有的标本如分离出真菌，应尽可能鉴定至种，报告“ΧΧ菌生长”，尤其对于念珠菌中克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，光滑念珠菌对唑类药物也逐渐表现出不敏感倾向。

8.注意事项

真菌血培养每天检查完毕后需摇动培养基，37°C振荡培养可加速真菌的生长，提高检出率；不作直接镜检，因其直接镜检阳性率低。

9.临床意义

真菌根据感染部位不同分为浅部真菌和深部真菌两大类，前者主要累及皮肤、毛发及甲板，后者感染皮下组织及内脏器官。准确鉴定至种的水平可以为临床诊断及治疗提供重要依据，特别四部分种对抗真菌药物的敏感性存在差异。

制定真菌鉴定规范的操作程序是保证结果的准确性与可靠性的基础。

危急值报告

血培养阳性涂片确定真菌及脑脊液墨汁涂片发现新型隐球菌后，应及时向临床报告。

安全防护措施

12.1 操作人员在工作过程中要穿隔离衣、戴口罩和手套。

12.2 所有报告结果后的标本及污染物，必须经高压灭菌、焚烧或浸泡杀菌剂中。

12.3 若送检途中培养瓶不慎打破，应封锁现场，进行消毒处理。

11.4 标本运送应采用密封容器。

参考文献

[1]孙鹤龄主编.医学真菌鉴定初稿.北京:科学出版社,1987

[2]吴绍熙主编.现代医学真菌检验手册.第二版.北京:中国协和医科大学出版社,2005

[3]上海第一医院华山医院皮肤科真菌室.临床真菌检验.

上海:上海第一医院出版社.1975

[4]王家俊主编,临床真菌检验,上海:上海医科大学出版社,1995

[5]秦启贤主编.临床真菌学.上海:上海医科大学出版社,2001

[6]王端礼主编,医学真菌学—实验室检验指南，北京：人民卫生出版社，2004

[7]Glenn S Bulmer，郑岳臣主编，汉英对照医学真菌学，上海：上海科学技术出版社，2005