标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

一、标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法

1、凯氏定氮法

2、双缩脲法

3、Folin-酚试剂法

4、紫外吸收法

5、考马斯亮蓝法

三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

（一）、试剂：

1、考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2、标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：

1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：

1、

2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、

40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：

1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

药品的配制（磷酸缓冲液的配制）

一、药品的配制步骤

（一）、实验准备：

1、准备所需的药品和玻璃仪器。

2、洗涤。（怎样洗涤算干净？）

（二）、计算：

1、百分比浓度计算：

1)、G/V比

例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。

2）、V/V比：

例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。

乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。

2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。

1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。

M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100ml

mM=毫摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g

毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量

3）、0.1uNaCl配100ml

mM=微摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg

微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug

3、混合溶液配制的计算：

如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。

注意：1、分别标定体积计算

2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml

（三）、标量：

1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液

管。

2、电子分析天平的使用。

（四）、溶解：

1、根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水，双蒸水，无离子水等。

2、只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤

烧杯三次左右，直到洗涤干净。

小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。

如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。

3、加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如:

配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90。C），过量会糊化。

（五）、定容：

1、用容量瓶定容；

2、用玻璃棒引流或用小漏斗；

3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切

为止（眼睛可视）；

4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。(注意不再定容了，防止溶液漏掉。) （六）、装入试剂瓶，贴上标签。

标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。

（七）、清理实验场所。

二、磷酸缓冲液的配制。

（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液。

选用药品：Na2HPO4·12H2O（碱）和NaH2PO4·12H2O（酸）配缓冲液100ml。书中说明。

（二）、计算：

1、注：书中有注明配置的量。

2、计算：Na2HPO4·12H2O称取71.64×0.1=7.164g

NaH2PO4·12H2O称取31.21×0.1=3.121g

3、含有不同结晶水的换算。

书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na2HPO4·2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？

11.87=（178/358）×X，X=23.87g。

（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）。

即：0.2M Na2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml。

（四）、按书中的量配制取量再混合。

如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。

（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。

（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可。

计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；

取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。