一植物病原真菌的分离培养及纯化技术说课讲解
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分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好， 将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草 病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基 平板上，病菌即生长而得到纯培养。
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3．组织的表面消毒剂
（1）酒精 用酒精（70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟 到1分钟），然后用灭菌水冲洗； 较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞 蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧 去。
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（一）目的意义
➢ 观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出诊断。 ➢ 同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能 断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生 长的腐生性真菌。
因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养 工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。
•1.5 无菌操作前还要用70％酒精擦手；
•1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不 要说话等。
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2．分离材料的选择
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。 • 病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、器 官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。
• 最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料 新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃 ，容易分离成功。
或三角瓶中。
➢试管分装时，使用玻璃漏斗。
➢装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的
分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时， 容量不宜超过容积的1/3----1/2。
注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾 湿棉塞而引起污染。
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4、灭菌 制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。
分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干/ 烘干、包装好，进行干热灭菌。
1.2 若限于条件实验只能在普通房间进行时，必须 对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地 上多洒些水，以消除室内尘埃，工作台上铺好湿 毛巾，点燃酒精灯。
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•1.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好， 放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程 中频繁走动，破坏环境带来杂菌；
•1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；
➢ 此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生 态，或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培 养物是必要的。
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（二）、真菌分离的程序 1．分离前的准备工作 分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下 进行。
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为了保证无菌操作，应注意下面几点：
1.1 清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行，无 菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。
灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。
高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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滤膜孔径主要有0.22 µm和0.45µm两种。过 滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。
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5、斜面、平板培养基的制作
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从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部 分病害都是适用的。
例如： •果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。 •根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较 远的部分分离。 •值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌 局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到 病菌的。当然，这类病害是比较少的。
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自然pH； 调pH值， 也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH 为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。
Tips: 实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，
只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水） 含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避 免使用。
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2、植物组织和煎汁
一植物病原真菌的分离培养及纯 化技术2011
பைடு நூலகம்
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2）制作步骤 •马铃薯洗净，去皮称200g切块/条， •1000ml水煮沸30min， •用双层纱布滤去薯块， •加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖， •待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤， •补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中， •塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。
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采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可以 采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织作 为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发 病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得 较多的是植物病原细菌的分离。
引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属 (Phytophthora) 的真菌，用这种方法分离的效果也很好。
试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条， 然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5， 冷凝后即成斜面培养基。
三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板 培养基。
方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应 在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部， 用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼 烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正 好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。
注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
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二、真菌分离
植物病原菌的分 离培养，是植物病 理实验室工作中的 基本技能。
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真菌的分离---就是将所需要的真菌与其它杂菌 分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯 培养。
一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气 等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件， 即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种 抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长 的环境，从而得到纯菌株。
许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以 放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即 能做培养基使用。
植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微 生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养 液，如加琼脂即能制成固体培养基。
当然，必须灭菌后才能使用。
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3、培养基的分装
➢根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管
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3．组织的表面消毒剂
（1）酒精 用酒精（70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟 到1分钟），然后用灭菌水冲洗； 较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞 蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧 去。
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（一）目的意义
➢ 观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出诊断。 ➢ 同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能 断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生 长的腐生性真菌。
因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养 工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。
•1.5 无菌操作前还要用70％酒精擦手；
•1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不 要说话等。
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2．分离材料的选择
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。 • 病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、器 官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。
• 最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料 新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃 ，容易分离成功。
或三角瓶中。
➢试管分装时，使用玻璃漏斗。
➢装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的
分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时， 容量不宜超过容积的1/3----1/2。
注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾 湿棉塞而引起污染。
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4、灭菌 制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。
分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干/ 烘干、包装好，进行干热灭菌。
1.2 若限于条件实验只能在普通房间进行时，必须 对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地 上多洒些水，以消除室内尘埃，工作台上铺好湿 毛巾，点燃酒精灯。
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•1.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好， 放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程 中频繁走动，破坏环境带来杂菌；
•1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；
➢ 此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生 态，或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培 养物是必要的。
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（二）、真菌分离的程序 1．分离前的准备工作 分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下 进行。
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为了保证无菌操作，应注意下面几点：
1.1 清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行，无 菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。
灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。
高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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滤膜孔径主要有0.22 µm和0.45µm两种。过 滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。
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5、斜面、平板培养基的制作
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从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部 分病害都是适用的。
例如： •果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。 •根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较 远的部分分离。 •值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌 局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到 病菌的。当然，这类病害是比较少的。
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自然pH； 调pH值， 也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH 为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。
Tips: 实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，
只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水） 含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避 免使用。
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2、植物组织和煎汁
一植物病原真菌的分离培养及纯 化技术2011
பைடு நூலகம்
2
2）制作步骤 •马铃薯洗净，去皮称200g切块/条， •1000ml水煮沸30min， •用双层纱布滤去薯块， •加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖， •待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤， •补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中， •塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。
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采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可以 采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织作 为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发 病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得 较多的是植物病原细菌的分离。
引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属 (Phytophthora) 的真菌，用这种方法分离的效果也很好。
试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条， 然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5， 冷凝后即成斜面培养基。
三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板 培养基。
方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应 在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部， 用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼 烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正 好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。
注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
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二、真菌分离
植物病原菌的分 离培养，是植物病 理实验室工作中的 基本技能。
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真菌的分离---就是将所需要的真菌与其它杂菌 分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯 培养。
一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气 等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件， 即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种 抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长 的环境，从而得到纯菌株。
许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以 放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即 能做培养基使用。
植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微 生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养 液，如加琼脂即能制成固体培养基。
当然，必须灭菌后才能使用。
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3、培养基的分装
➢根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管