一植物病原真菌的分离培养及纯化技术说课讲解
病原物的分离培养与纯化(讲解)
（三）真菌、细菌培养性状
实训内容与步骤
1、真菌培养性状观察
记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有
色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时
要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
2、细菌培养性状观察
记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮
还是粗糙或有皱折、、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养
*****
3
*****
75%酒精
0.1%升汞
采集病组织
消毒
洗涤
玻棒挤压
实训内容与步骤
★病原细菌的纯化（划线法） ——这个要求操作
将培养后长出较为整齐一致的单个菌 落分别挑取，接种到斜面培养基上，置 25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是 否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次 进行分离纯化，直到获得纯培养。
4、取灭菌培养皿三个，编好序号，并注明班级、操作人 姓名。
5、用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入3～4滴。
实训内容与步骤
★病原细菌的分离——稀释分离法 6、用接种环移三环细菌液，与第一个培养皿中的灭菌水
混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后 再移三环到第三个培养皿中。
7、 将熔化并冷却到50℃左右的培养基，分别倒在三个培 养皿中，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
分离的病原菌。
提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要 在显徽镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要 将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。
真菌组织分离法操作流程图
取灭菌器皿
标记
培养皿里 滴入1-2滴
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
病原物的分离培养和纯化
病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。
该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。
设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。
长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。
在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。
关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。
通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。
1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。
1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
病原物的分离与及培养
病原物的分离与及培养病原物的分离与培养一、实验目的1．学会制作普通的培养基。
2．掌握病原物分离、培养和纯化的一般方法。
二、讲解要点柯赫氏法则（Koch's Postulate）是通过一系列步骤确定引起病害的病原物的原则和方法，是诊断病害中的证病律。
其基本步骤如下：1．在染病组织上用显微镜经常检查到某种微生物；2．从病组织中分离得到该微生物，并获得纯培养；3．将纯培养的微生物接种到健康的感病寄主植物后，发生原先观察到的症状；4．从接种发病的组织中，再分离，又得到相同的微生物。
全过程拟分两次实验完成，本次完成第一和第二步。
包括培养基的制作和病原物的分离、培养及纯化。
（一）培养基的制作真菌和细菌等微生物与其他生物一样，生长和发育都需要一定的营养条件。
不同类群的微生物对营养条件的要求不同。
因此，在人工培养微生物时，就必须考虑它们的营养要求。
培养基就是按照微生物生长，繁殖所需的各种营养物质，用人工的方法配制的基质。
1．常用培养基的配制植物病理实验室所用的培养基与一般微生物培养基大致相同，只是植物质培养基用得多些。
（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基这是使用最频繁的培养基，简称PDA，主要用于真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌的培养。
配方为：马铃薯200g 葡萄糖（蔗糖）10～20g 琼脂17～20g 水1000mL配制方法：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。
）切成薄片或蚕豆大小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒不断搅拌，以免烧焦锅底。
再加入事先用温水溶化的糖溶液，用二层纱布过滤。
测定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。
实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
植物病原真菌的分离培养(参考模板)
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒2．分离用具的消毒凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。
再次使用时必须重复灭菌。
培养皿、试验等要经过干热灭菌。
培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。
3．分离材料的选择用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。
任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。
【精品】植物病原真菌的分离培养
【精品】植物病原真菌的分离培养植物病原真菌的分离培养是植物病害学研究中的常规技术，它是诊断病原微生物的重要手段。
通过环境、罹病组织或病株上的真菌分离，可以准确地确定病原物种，病害发生的原因和病害防治的策略。
本文将介绍植物病原真菌的分离培养方法及其注意事项。
一、实验材料1. 植物体、果实或病株。
2. 无菌匀质培养基：具备营养丰富，pH约为7.0，含有适量的蔗糖、氨基酸、维生素和矿物质元素。
3. 无菌器具：试管、培养皿、匀质棒、无菌酒精灯、注射器等。
二、分离方法1. 选材：选择患病植物或病株，减少环境污染的干扰，以便于真菌分离和培养。
2. 分离：在实验室中进行无菌操作，将病株或罹病组织的表皮割去，注意不要带皮层或子叶，然后用30%的酒精或75%的酒精消毒5-10秒，沥干后放入无菌盘中。
3. 培养：将培养基煮沸，冷却后加入抗生素，避免杂菌污染，用培养皿接种盘，置于26℃左右的恒温箱中孵育。
初次孵育检查时间视病原真菌的生长速度而定，通常在1-2周内可见初生菌丝和菌落。
如果没有生长或生长极为缓慢，可能需要增加孵育时间或重新分离。
4. 子培养：将孵育的菌落通过匀质棒挑选到其他含有抗生素的培养基中，进行子培养，以保证分离出的真菌种属的准确性。
如培养子菌落中有杂菌或真菌菌落与初步分离的不一致，应重新分离。
5. 稳定培养：对于经过检查并确认是病原真菌的菌株，应进行深层冻存或贮存，以免失掉纯度，同时要做好鉴定记录。
三、注意事项1. 操作要无菌，防止环境污染，避免误诊。
2. 病株样品与周围环境隔离，减少环境干扰。
3. 选用适当的培养基，保证真菌菌落的生长和营养。
4. 操作时注意安全，避免接触真菌孢子、毒素等对人体有害的物质。
5. 菌落的检查应在暗的环境下进行，以免光照影响观察结果。
四、结语植物病原真菌的分离培养是诊断和定位植物病害的一个重要工具。
通过正确的操作方法和注意事项，可以准确地分离出病原菌，并对其性质和特征进行鉴定和确认。
植物病原真菌的分离培养精编版
植物病原真菌的分离培养精编版MQS system office room 【MQS16H-TTMS2A-MQSS8Q8-MQSH16898】实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
植物病原菌的分离和培养
实验三植物病原菌的分离和培养一、实验目的在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。
通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。
二、内容、材料和方法(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
(二)分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
分别以玉米大斑病、小麦根腐病和梨褐腐病为试材进行。
(1)叶斑病类病原菌的分离（玉米大斑病病菌的分离）取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。
用10%漂白粉（次氯酸钙）溶液消毒（漂白粉溶液现用现配）3-5min，时间长短依病组织不同而异，然后直接移至PSA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，倒置于20—25℃室温下，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PSA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，弱仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
(2)种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟（处理时间可自30秒至30分钟不等），然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学实验十七、病原菌得分离培养与纯化一、目得要求(1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。
(２)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。
二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。
为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株。
植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。
最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。
病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化,纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。
三、材料、仪器与用具1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricｕｌaｒia orycａe)。
（２)玉米大斑病叶(exserohilum ｔurcicuｍ)。
(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(cｕｒvｕlarｉa lｕｎａtａ)。
(４)玉米小斑病叶(bipoｌaris mayｄiｓ)。
(5)番茄灰霉病果（botrytｉs cinefcａ)。
(６)黄瓜菌核病果（sclerotinia sｃｌerotioｒum）。
(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseuｄomoｎas syringaｅｐｖ.1acｈｒｙmans)。
（8)水稻白叶枯病叶(xantｈｏmoｎas campeｓｔms pv、ｏｒｙeue)。
(9)大豆细菌性斑点病叶(pseｕdomonas syringaepv.ｇlyｃiｎea)。
(10)白菜软腐病叶（eｒｕdnia cａｒｏtovｏra suｂsp.cａrotovora)。
病原物的分离与及培养
病原物的分离与及培养病原物的分离与及培养病原物的分离与培养一、实验目的1．学会制作普通的培养基。
2．掌握病原物分离、培养和纯化的一般方法。
二、讲解要点柯赫氏法则（Koch's Postulate）是通过一系列步骤确定引起病害的病原物的原则和方法，是诊断病害中的证病律。
其基本步骤如下：1．在染病组织上用显微镜经常检查到某种微生物；2．从病组织中分离得到该微生物，并获得纯培养；3．将纯培养的微生物接种到健康的感病寄主植物后，发生原先观察到的症状；4．从接种发病的组织中，再分离，又得到相同的微生物。
全过程拟分两次实验完成，本次完成第一和第二步。
包括培养基的制作和病原物的分离、培养及纯化。
（一）培养基的制作真菌和细菌等微生物与其他生物一样，生长和发育都需要一定的营养条件。
不同类群的微生物对营养条件的要求不同。
因此，在人工培养微生物时，就必须考虑它们的营养要求。
培养基就是按照微生物生长，繁殖所需的各种营养物质，用人工的方法配制的基质。
1．常用培养基的配制植物病理实验室所用的培养基与一般微生物培养基大致相同，只是植物质培养基用得多些。
（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基这是使用最频繁的培养基，简称PDA，主要用于真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌的培养。
配方为：马铃薯200g 葡萄糖（蔗糖）10～20g 琼脂17～20g 水1000mL配制方法：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。
）切成薄片或蚕豆大小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒不断搅拌，以免烧焦锅底。
再加入事先用温水溶化的糖溶液，用二层纱布过滤。
测定pH值，用1mol/L的NaOH 或HCl调至pH为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。
实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。
植物病原菌的分离和培养
实验三植物病原菌的分离和培养一、实验目的在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。
通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。
二、内容、材料和方法(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
(二)分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
分别以玉米大斑病、小麦根腐病和梨褐腐病为试材进行。
(1)叶斑病类病原菌的分离（玉米大斑病病菌的分离）取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。
用10%漂白粉（次氯酸钙）溶液消毒（漂白粉溶液现用现配）3-5min，时间长短依病组织不同而异，然后直接移至PSA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，倒置于20—25℃室温下，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PSA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，弱仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
(2)种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟（处理时间可自30秒至30分钟不等），然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。
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➢试管分装时，使用玻璃漏斗。
➢装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的
分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时， 容量不宜超过容积的1/3----1/2。
注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾 湿棉塞而引起污染。
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4、灭菌 制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。
分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干/ 烘干、包装好，进行干热灭菌。
•1.5 无菌操作前还要用70％酒精擦手；
•1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不 要说话等。
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2．分离材料的选择
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。 • 病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、器 官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。
• 最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料 新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃 ，容易分离成功。
许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以 放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即 能做培养基使用。
植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微 生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养 液，如加琼脂即能制成固体培养基。
当然，必须灭菌后才能使用。
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3、培养基的分装
➢根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管
分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好， 将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草 病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基 平板上，病菌即生长而得到纯培养。
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3．组织的表面消毒剂
（1）酒精 用酒精（70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟 到1分钟），然后用灭菌水冲洗； 较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞 蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧 去。
➢ 此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生 态，或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培 养物是必要的。
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（二）、真菌分离的程序 1．分离前的准备工作 分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下 进行。
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为了保证无菌操作，应注意下面几点：
1.1 清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行，无 室或无菌箱是分离不可缺少的设施。
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自然pH； 调pH值， 也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH 为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。
Tips: 实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，
只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水） 含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避 免使用。
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2、植物组织和煎汁
灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。
高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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滤膜孔径主要有0.22 µm和0.45µm两种。过 滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。
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5、斜面、平板培养基的制作
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从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部 分病害都是适用的。
例如： •果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。 •根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较 远的部分分离。 •值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌 局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到 病菌的。当然，这类病害是比较少的。
一植物病原真菌的分离培养及纯 化技术2011
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2）制作步骤 •马铃薯洗净，去皮称200g切块/条， •1000ml水煮沸30min， •用双层纱布滤去薯块， •加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖， •待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤， •补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中， •塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。
1.2 若限于条件实验只能在普通房间进行时，必须 对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地 上多洒些水，以消除室内尘埃，工作台上铺好湿 毛巾，点燃酒精灯。
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•1.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好， 放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程 中频繁走动，破坏环境带来杂菌；
•1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；
注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
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二、真菌分离
植物病原菌的分 离培养，是植物病 理实验室工作中的 基本技能。
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真菌的分离---就是将所需要的真菌与其它杂菌 分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯 培养。
一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气 等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件， 即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种 抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长 的环境，从而得到纯菌株。
试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条， 然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5， 冷凝后即成斜面培养基。
三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板 培养基。
方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应 在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部， 用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼 烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正 好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。
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采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可以 采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织作 为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发 病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得 较多的是植物病原细菌的分离。
引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属 (Phytophthora) 的真菌，用这种方法分离的效果也很好。
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（一）目的意义
➢ 观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出诊断。 ➢ 同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能 断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生 长的腐生性真菌。
因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养 工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。