分离植物内生真菌操作流程
植物内生菌分离处理方法汇总
d植物内生菌分离处理方法刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2?3 d。
取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
6实验六内生菌的分离
表面消毒效果的常用检验方法：有两种。
(1) 漂洗液检验法，即把最后一次漂洗灭菌材料的漂洗液吸取0.2～0.3ml涂布 于固体平板上。每个处理重复3次，培养48h，观察有无菌落产生。 (2) 组织印迹法，即把经灭菌、无菌水漂洗过的材料置于固体平板上保留几分 钟，然后移去样品。于28℃培养48小时，检查表面消毒是否彻底。据此验证此 消毒方法是否能全部杀死供试材料。表面消毒检验方法的评价标准为表面消毒 检验培养皿中菌落数量越多菌落出现的时间越早说明该表面消毒检验方法的灵 敏度越高 c.分离培养。组织块培养法表面消毒后的植物组织根或茎在无菌条件下用手术 刀纵 向或横向切割将切口紧贴于分离培养基上。研磨液法表面消毒后的植物组织部 位无菌条件下用PBS 缓冲液研磨研磨液8 层无菌纱布过滤取200 L 直接涂布于 各分离培养基28 下培养36 天。 酵母液处理取0.5mL 研磨液和2mL 含6 酵母粉和0.05 SDS 的PBS 缓冲液混和 160rpm 40 振荡20min 同时将该液稀释10 倍和100 倍后分别取三个梯度的研 磨处理液200 L 涂布于各分离培养基28 下培养36 天。
2．分离方法: ⑴内生细菌 表面灭菌: 将块茎用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用 75%的乙醇和次氯酸钠（有效cl-10%）分别进行表面消毒五分钟， 再用无菌水漂洗块茎三次。为了检验表面灭菌的效果，用灭菌过的 镊子夹住块茎,使其表面与固体平板接触3～5 min，然后将培养皿 放在22℃～25℃的温箱中培养3～5d。若发现皿中无菌落出现，证 明该块茎表明灭菌彻底，否则，该分离结果不能使用。 ⑵取样: 用打孔器（d＝10 mm）从茎基部插入薯块，取出样品， 用灭菌的手术刀切取10 mm（包括维管束环），置于研钵中(De Boer,1974)。 ⑶样品处理: 研磨样品，加无菌水定容至10ｍl，静置30 min后，梯 度稀释到浓度为10-1～10-4，取0.2ml涂布于BPA平板上，每浓度 涂平皿一个，重复三次，置于２２℃～２５℃温箱中培养。 ⑷纯化和保存: 培养3～5d后，挑取不同形态的菌落重新于固体平 板上划线纯化，然后，真空冷冻干燥保存，备用。
植物内生菌分离处理方法
刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA 固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的V A培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8−13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次, 平放于NA 平板上, 28 °C培养2−3 d。
取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
植物病原菌分离方法
植物病原菌分离方法第四章植物病原菌分离与纯化植物病原菌一、植物病原菌分离流程二、分离的准备分离的准备工作无菌室操作前保持清洁无菌接种工作准备培养基的准备分离材料选择以收获的材料从病健交界处采样果实腐烂从开始腐烂处分离根腐和枯萎层可能从离土较远处分离有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等发病后分离组织表面消毒⑴升汞：1‰◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl能增强杀菌能力。
◆处理时间：30’S-30min不等，常3－5min；所需时间因材料不同而异，消毒后灭菌水3－5次附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒效果，除气泡抽气、70％酒精浸2－3秒⑵漂白粉◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消毒，也可处理种子◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使用。
◆最好现配现用，放久失效，有效成分CaClO次氯酸钙◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯气有强烈臭味。
◆一般3－5min，时间长短因材料不同而不同。
处理种子5－10min，长的可达20－30min。
优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。
（3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。
◆较大的材料在酒精中浸或棉花擦，然后在火焰烧去。
◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。
比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水换洗八九次。
培养基的准备●分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。
寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。
一种适宜于纯培养的培养基不一定适宜于分离（杂菌太多）●有时分离失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当或存放的时间太长。
【精品】植物病原真菌的分离培养
【精品】植物病原真菌的分离培养植物病原真菌的分离培养是植物病害学研究中的常规技术，它是诊断病原微生物的重要手段。
通过环境、罹病组织或病株上的真菌分离，可以准确地确定病原物种，病害发生的原因和病害防治的策略。
本文将介绍植物病原真菌的分离培养方法及其注意事项。
一、实验材料1. 植物体、果实或病株。
2. 无菌匀质培养基：具备营养丰富，pH约为7.0，含有适量的蔗糖、氨基酸、维生素和矿物质元素。
3. 无菌器具：试管、培养皿、匀质棒、无菌酒精灯、注射器等。
二、分离方法1. 选材：选择患病植物或病株，减少环境污染的干扰，以便于真菌分离和培养。
2. 分离：在实验室中进行无菌操作，将病株或罹病组织的表皮割去，注意不要带皮层或子叶，然后用30%的酒精或75%的酒精消毒5-10秒，沥干后放入无菌盘中。
3. 培养：将培养基煮沸，冷却后加入抗生素，避免杂菌污染，用培养皿接种盘，置于26℃左右的恒温箱中孵育。
初次孵育检查时间视病原真菌的生长速度而定，通常在1-2周内可见初生菌丝和菌落。
如果没有生长或生长极为缓慢，可能需要增加孵育时间或重新分离。
4. 子培养：将孵育的菌落通过匀质棒挑选到其他含有抗生素的培养基中，进行子培养，以保证分离出的真菌种属的准确性。
如培养子菌落中有杂菌或真菌菌落与初步分离的不一致，应重新分离。
5. 稳定培养：对于经过检查并确认是病原真菌的菌株，应进行深层冻存或贮存，以免失掉纯度，同时要做好鉴定记录。
三、注意事项1. 操作要无菌，防止环境污染，避免误诊。
2. 病株样品与周围环境隔离，减少环境干扰。
3. 选用适当的培养基，保证真菌菌落的生长和营养。
4. 操作时注意安全，避免接触真菌孢子、毒素等对人体有害的物质。
5. 菌落的检查应在暗的环境下进行，以免光照影响观察结果。
四、结语植物病原真菌的分离培养是诊断和定位植物病害的一个重要工具。
通过正确的操作方法和注意事项，可以准确地分离出病原菌，并对其性质和特征进行鉴定和确认。
(整理)植物内生菌分离处理方法
d植物内生菌分离处理方法文献材料前处理第一次消毒第二次消毒（含三消）处理对照培养基刘明志，2011 南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶截成2～3 cm长的小段，去除树皮层75%酒精中浸泡30s0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次研磨成匀浆液，倾倒于PDA上切成0．5 cm左右的块，接种于有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿10块刘金花2011 黄花蒿的根，茎，叶叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次置于含双抗的V A培养基平板培养待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离宋培勇2011 珙桐茎、叶和叶柄将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次75%酒精浸泡 1min再用2%NaClO 溶液中浸泡3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次,取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照平放于NA 平板上,28 °C培养2−3 d孙传伯2011 台湾7303毛豆全株采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm长的小段, 须根切成115 cm的小块用75% 酒精浸泡5m in、7m in、10min分别用0.1% 升汞溶液处理4 m in、6m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复3次。
最后用无菌水冲洗4次,。
最后用无菌水冲洗4次将组织块在研钵中充分研磨成匀浆最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板, 26~ 28e下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。
以无菌水冲洗为对照试验。
取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态精品文档张鑫2011 植物圣罗勒的健康叶子将叶子用流水冲洗10 min1% 的次氯酸钠中浸泡10min0．02 mol / L、pH7．0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次加无菌水将材料研磨涂布培养李铭, 2011 石耳目地衣为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗( 12 h∶12h) 条件下，于2%的PDA培养基上，18℃下培养 3 个月刘杰凤2011 健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶流水冲洗干净，剪成小段75％酒精中浸泡3min10％次氯酸钠浸泡茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行精品文档朱士茂2011 新采集的银杏枝条，叶子和根在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成 3 －4cm长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中（一），根的表面灭菌: 0. 1%的土温20 消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2次。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。
（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物拍照留用于鉴定，并做好相关记录。
（2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。
2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。
（3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。
（4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4.表面灭菌：在无菌操作台中进行（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。
（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本倒出，倒出的样本不要再放入其中，也不要用手碰到样本，样本不可以接触到除了离心管以外的东西。
土壤和植物中真菌的分离培养方法
土壤和植物中真菌的分离培养方法土壤和植物中的真菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，它们在生态系统中发挥着重要的作用。
了解土壤和植物中真菌的分离培养方法对于研究真菌的多样性、功能以及与植物的互作关系具有重要意义。
本文将介绍一种常用的真菌分离培养方法——基于菌丝体的分离培养方法。
一、准备工作1. 备好培养基：选择适合真菌生长的培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）或玉米葡萄糖琼脂培养基（CZ）等。
2. 采集样品：在需要研究的土壤样品或植物根际中采集菌丝体，避免太多土壤或根部残留物的混入。
3. 消毒工具：将培养皿、培养瓶、锥形瓶等工具用高温或酒精等消毒，避免细菌或其他真菌的污染。
二、分离培养方法1. 样品处理：将采集到的土壤样品或植物根际样品放入无菌研钵中，加入适量的无菌蒸馏水或生理盐水，用力搅拌均匀使菌丝体分散。
2. 稀释处理：将悬浮液进行稀释，取适量悬浮液分别接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中，用无菌铁环均匀涂布在培养基表面。
3. 培养条件：将培养皿或培养瓶放入恒温培养箱中，温度一般控制在25-28℃，光照条件视具体真菌而定，一些真菌需要暗培养。
4. 纯化菌株：观察培养皿或培养瓶中的菌落形态，选取单独的菌落进行传代培养，直至获得纯化的真菌菌株。
5. 储存菌株：将纯化的真菌菌株进行冷冻保存或液氮保存，以备进一步研究使用。
三、注意事项1. 避免污染：在整个分离培养过程中，要注意无菌操作，避免其他微生物的污染，尤其是细菌和其他真菌的干扰。
2. 培养基选择：不同真菌对培养基的要求不同，可以根据具体需要选择不同的培养基，也可以尝试不同的培养基，以寻找最适合目标真菌生长的培养基。
3. 培养条件调节：真菌的生长受到温度、光照、湿度等环境因素的影响，可以根据具体研究需要对培养条件进行调节，以促进或抑制真菌的生长。
4. 观察与记录：在培养过程中，要及时观察并记录菌落的形态、颜色等特征，以及菌丝的生长情况，为进一步研究提供参考。
(完整word版)植物内生菌DNA提取方法
在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。
根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。
为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。
表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。
植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。
东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。
用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。
将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。
1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。
2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。
3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。
4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。
5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。
6. 加入200μL 5 M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。
植物病原微生物的分离与纯化精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版植物病原微生物的分离与纯化一、实验目的1、掌握培养基的制备方法，学习灭菌与消毒的操作方法2、掌握分离与纯化病原微生物的基本原理与方法二、实验原理植物病原微生物的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
植物患病组织内的微生物，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原微生物的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真微生物与其它微生物相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原微生物于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病微生物的分离培养。
植物病原真微生物的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
三、实验材料、试剂芒果炭疽病叶、酒精灯，剪子，镊子，牛肉膏蛋白胨，培养皿，小烧杯，大烧杯，灭菌水，75%酒精瓶、0.1%升汞瓶四、实验步骤1、培养基的配置取无菌平皿，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。
2、植株挑选用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。
任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。
3、分离①病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下②取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟。
③消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。
④用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组织均应为病健相间组织。
用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。
每皿4——5块，排放均匀。
⑤将培养皿倒置，于23—25℃培养⑥3——4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。
一株紫杉醇内生真菌的分离和鉴定
实验：一株紫杉醇内生真菌的分离与鉴定不同的表面消毒方法和不同的培养基使得红豆杉内分离出来的内生真菌有其多样性，另外，由于红豆杉品种的不同，也可能使得实验结果出现一定的差异性．以下结合了中国红豆杉、南方红豆杉以及三尖杉的处理方法，来探讨从红豆杉内分离纯化内生真菌的方案，从而应用于实验室具体操作和取得最佳结果．如：采用化学法进行表面灭菌处理,运用平板涂布法及平板划线法得到内生真菌，然后利用分子鉴定法来鉴定菌种。
一．材料及试剂１.１材料：百年红豆杉的树皮样品，某年某月采于_______１.２试剂：无菌水，蒸馏水，７５％乙醇溶液，０.１％升汞溶液,马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15-20g,蒸馏水100ml,lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液0.1g/l氯霉素或土霉素，0.05%吕氏碱性美蓝染色液,乙酸乙酯-丙酮，二甲醇，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，浓硫酸，香草醛，紫杉醇标准品, １.３仪器设备：无菌容器，培养皿，高温蒸汽灭菌锅，无菌剪刀或手术刀，无菌滤纸，细毛刷，恒温箱，电子分析天平，玻璃棒，纱布，试管或者锥形瓶，pH试纸，恒温箱，研钵，移液管，平板，接种环，超净台，酒精灯，胶头滴管，盖玻片，载玻片，镊子，光学显微镜，三角瓶，抽滤器，蒸发皿，分液漏斗，UF254硅胶板，电热鼓风干燥箱，喷壶，铅笔，直尺，毛细管，薄层板，层析缸，电吹风，酒精灯，镊子，紫外光灯，磨砂纸二．实验操作２.１内生真菌的分离２.１.1方法一：将树皮在洗衣溶液中浸泡３０min,并用细毛刷刷去表面污垢，然后在自然水中冲洗２０min.冲洗完成后转移至超净工作台上，用无菌滤纸吸干，放入７５％的乙醇中消毒３０s,然后用无菌水漂洗３次，再放入０.１％的升汞溶液中浸泡8min，取出后用无菌水漂洗４次．最后，用手术刀将树皮剪成０.５＊０.５cm小块，再放入事先准备好的PDA固体培养基平板中，２８℃恒温培养３－５d．每天观察一次，确定菌丝生长时间．等长出菌丝后，挑取平板中单一菌落进一步纯化，纯化后的菌株转接到装有PDA斜面培养基上，２８℃下恒温保存．当菌落长满斜面后，划线接种于平板培养基上，每２d观察一次，根据菌落的形状颜色以及长出时间的不同，有不纯的菌落就要继续划线分离培养，直到得到纯种．将纯化后的菌株编号记下，接入PDA斜面培养基，于２８℃恒温培养６－７d后，保存于４℃冰箱。
植物病原真菌的分离原理
植物病原真菌的分离原理
植物病原真菌的分离原理主要包括以下几个步骤：
1. 采样：选择受感染的植物部位，如叶片、茎、果实等，并避免采样过程中的污染。
2. 表面消毒：使用消毒剂如70%酒精或10%次氯酸钠溶液，对样品进行表面消毒，以杀灭植物表面的细菌和真菌。
3. 组织处理：将消毒后的植物组织切碎或切割成小块，以增加真菌的释放。
4. 培养基接种：将处理后的植物组织均匀地分散于含有适宜营养物质和抑菌剂的培养基上，如琼脂培养基。
5. 培养条件：将接种好的培养基置于适宜的温度和湿度条件下，有利于真菌的生长。
6. 观察和分离：观察培养皿上是否有真菌生长，如果有，则进行分离，通常通过挑取单个真菌菌丝并转移到新的培养基上进行单菌种的培养。
7. 鉴定和纯化：通过对分离得到的真菌进行形态学观察、生理生化特性研究以及分子生物学分析等方法，鉴定其属种和病原性，并进行纯化培养。
通过以上步骤，可以将植物病原真菌从植物组织中分离出来，并得到纯化的菌种，为进一步研究真菌的生物学特性和病害防治提供了基础。
植物内生菌的分离
植物内⽣菌的分离植物内⽣菌的分离钱昆121140041⼀、实验⽬的1、掌握对植物内⽣菌的分离处理⽅法。
2、熟练掌握对细菌、真菌的染⾊观察技术。
3、了解微⽣物分⼦实验的基本操作流程。
⼆、实验原理在植物的⽣态环境中，存在着各种各样的微⽣物,它们有的附着于植物的表⾯，有的则⽣活于植物体内。
对于附着于植物表⾯和根际的微⽣物已有很多研究，⽽对于植物体内微⽣物的研究却刚刚起步。
但有资料显⽰, ⼀些植物内⽣微⽣物与宿主发⽣关系时，可明显增强宿主的抗病性，提⾼植物的⽣产⼒。
因此，合理利⽤植物的内⽣微⽣物具有重要的理论意义和实⽤价值。
植物内⽣菌作为微⽣物研究领域之⼀，近年来⼀直备受关注。
内⽣菌概念在1866年⾸先由Bary提出的，指那些在其⽣活史的⼀定阶段或全部阶段⽣活于健康植物的组织或器官内部的微⽣物（主要为真菌和细菌）。
其后的很长时间内，内⽣菌研究进展缓慢。
直到1993 年，美国蒙⼤拿州⽴⼤学Strobel等从短叶红⾖杉的韧⽪部位分离到⼀株产新型抗癌物质紫杉醇的内⽣真菌，从⽽启发⼈们可从植物内⽣菌寻找与植物产⽣的相同或相似的化合物，由此促进了植物内⽣菌的研究。
植物内⽣菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内⽣真菌、内⽣细菌和内⽣放线菌，⼴泛分布于各种陆⽣及⽔⽣的低等植物和⾼等植物中。
内⽣真菌是在宿主植物的茎和叶内⽣存并完成⽣活周期的真菌。
这类真菌中，有许多种类很少形成孢⼦，或者在宿⽣植物上形成孢⼦（或者孢⼦果），不容易识别。
真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。
与病原菌不同，这些真菌对宿主植物⼏乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共⽣关系，或者是不太密切的共⽣关系。
对于现已分离得到的植物内⽣细菌，⼀般可分为专性内⽣细菌与兼性内⽣细菌，前者指⾄今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与⼟壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，⽽且种类居多。
根据内⽣细菌对宿主植物⽣长发育的影响可以将其分成三类：第⼀类对植物的作⽤是中性的，即尚未发现它们的内⽣定殖对宿主植物⽣长与繁殖有影响；第⼆类对植物⽣长发育有促进作⽤，如能提⾼宿主植物抗病、抗逆能⼒，或能通过固氮与分泌激素促进植物⽣长发育等；第三类对植物⽣长具有负⾯影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。
植物内生菌分离处理方法汇总
刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA 固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的V A培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8−13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次, 平放于NA 平板上, 28 °C培养2−3 d。
取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
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分离植物内生真菌操作流程
1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4?）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌
30min。
（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植
物实行三株标本，必须具有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写下在小纸条
上放到上装标本的袋子里，檀香的标本与写著名字的纸条一同偷拍，样本上存有脏东西时，恳请用纸轻轻盖住，若不确切植物名字，恳请将整棵植物偷拍领用作鉴别，并搞好有关记录。
（2）制作pda固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大
概倒15个板，等待其凝结后用作注射。
2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3.取样：
（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位展开采样，穗序
5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果
实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位注射两块板，小
板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即
左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌
中冲洗时被冲掉。
（3）若植物标本存有余下，且是没烧完的，再次上装不好，放在冰箱里，水泵，
洗过的扔掉。
（4）每种植物标本所剪的样本放到一个50ml的离心管中，放到试管架上，
并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4.表面杀菌：在无菌操作台中展开
（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器
已经开始计时1min,每10秒钟摇晃离心管几次，并使其充份杀菌。
（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管
中样本好像出来，盛满的样本不要再放进其中，也不要用手遇到样本，样本不可以碰
触至除了离心管以外的东西。
（3）然后，再向各离心管中加入40ml的3%次氯酸钠，拧紧盖子，用计时
器已经开始计时10min，内要1min摇晃几次离心管，时间至后，扳动盖子，将次氯酸钠放入事先准备工作的锥形瓶中，特别注意不要将管及中样本好像出来，盛满的样本不要
再放进其中，也不要用手遇到样本，样本不可以碰触至除了离心管以外的东西。
（4）最后，用无菌水冲洗三遍，操作步骤同上面（3）。
（5）冲洗完后，将样本放
在盖子里，备用。
（6）表面杀菌就是整个实验中的关键步骤，务必深入细致展开表面杀菌，各项壮
作严格进行。
5.平板注射：
（1）将已经凝固的平板标好相应的植物标本名字，时间和自己的名字，每
种标本的平板再用a、b、c、d利尼县区分，例如桂花a，桂花b，桂花c，桂花d等，桂花a和桂花b用以注射桂花的叶子，c和d用以注射叶柄，以此类推。
（2）在无菌操作台中，打开酒精灯，平板的盖子四周在酒精灯处灭菌，将
镊子在火焰上杀菌后，夹采样本，在酒精灯附近关上平板的一边，放进样本，大板每
个必须注射五个样本即为左上、右上、左下，右下和正中，大板每个注射四个样本即为左上、右上、左下，右下，样本在平板上整齐排序，尽量一次性放在位，不要在平板上到处
安远，掉下来在操作方式台上的样本不可以再用，托盘每种植物标本前一定必须在火焰上
杀菌。
（3）放入样本后，立刻合上平板，并且再在酒精灯处灭菌，此过程要注意
严苛无菌操作。
6.室温培养：接种好的平板放在室温下培养3~7天，每日观察。
7.挑取菌种：等待样本附近短出来菌后，还可以划出相同菌种前，立即展开挑菌。
（1）用记号笔在平板底部划必须放的菌种，并且每块板上标不好1,2,3等，标
完后，数好需要挑的真菌总数，取相应数量灭过菌的1.5ml小管，做好相应的标记。
（2）在无菌操作台中，挑取适当菌种放进1.5ml小管中，特别注意尽量挑取二者
同颜色的菌块，这样挑菌种比较纯，此过程也要注意无菌操作。
（3）记录不好每块板上挑取的真菌数及种类，等待其布满后，同样的则不须要
再记录。
8.提纯菌种：
（1）数好需要纯化的菌种，倒好相应数量的平板，待其凝固后，在无菌操
作台中，将小管中的真菌块下到平板正中央，此过程也必须特别注意无菌操作。
（2）种好菌的平板放在室温下培养，每日观察，若染上细菌，则重新挑到
新板中再短，若分离出其他菌种，则拎代莱板再拆分。
9.菌种保藏：
（1）准备工作：已杀菌的液体石蜡和菌种中草药管，每种菌摆两个小管，其中一
个小管放1ml液体石蜡。
（2）偷拍：等待内生真菌布满平板后，在无菌操作台里关上平板盖子，拍摄下
照片，并且也拍好与之相对应的菌种名称。
（3）中草药：小管搞好标记后放到无菌操作台里，关上酒精灯，挑一个平板
和与之相对应的两个小管，打开小管盖子，盖子口朝上放在操作台上，小管放在酒精灯附近，将平板在酒精灯火焰处灭菌，针在火焰上灭菌后，打开平板盖子，在平板一边划一块培养基，分成若干小块，每个小管放五小块。
合上平板盖子，在火焰处灭下菌，针在挑下一个菌种前务必灭菌。
（4）中草药菌种的小管放在冰箱里。
10.菌种蒸煮：
（1）制作pda液体培养基，与50ml锥形瓶，50ml量筒一起灭菌。
（2）灭菌后，在无菌操作台中将pda液体培养基分装到50ml锥形瓶中，
各个瓶30ml，在瓶壁上写下上适当的所需蒸煮的菌种。
（3）从各个平板中取两小块带菌种的培养基放入瓶中，发酵20天。
（4）注意无菌操作。
11.过滤发酵液体：
（1）准备工作：滤纸，圆柱形，锥形瓶，针筒，细菌滤器（已杀菌的），50ml距
心管（已灭菌的），移液器，ph试纸，1.5ml小管（已灭菌的），96孔板，蒸馏水。
（2）过滤器：将滑下来滤纸的圆柱形先用少量蒸馏水润湿，然后死掉锥形瓶里的
蒸馏水，将发酵瓶中的液体倒入漏斗，注意不要将菌块倒入，也不要倒太满，待其漏下后再倒。
（3）测ph：用移液器汲取一点的发酵液，几滴在ph试纸F83E43Se，并搞好记录。
（4）等待发酵液过滤器回去后，用洗脸整洁的针筒汲取里面的液体，可卡因后，在针
筒头上套上已灭菌的细菌滤器，缓缓打入相应50ml离心管中，并在1.5ml相应小管中放入1ml发酵液，用移液器分别吸取200微升发酵液放入编号为1#和2#的96孔板的相同位置，作好记录，并且记录50ml离心管中最后所得发酵液的体积。
（5）50ml离心管、1.5ml小管、96孔板分别上装不好放进冰箱留存，水泵。
（6）好像出来发酵液的锥形瓶先摆着，不去除，所用的细菌滤器拿走里面的滤
纸，洗净，重放滤纸，用报纸包好灭菌。
12.菌丝形态偷拍：
（1）准备：载玻片和盖玻片，生理盐水，移液器，枪头，显微镜。
（2）在干净的载玻片中央滴20微升生理盐水，用枪头挑一丝菌丝，轻轻在
水中拍散，砌上盖玻片，在显微镜下，分别拍摄下菌丝形态，产孢子结构，孢子以及其他特定形态。