分离植物内生真菌操作流程

分离植物内生真菌操作流程
1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4?）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌
30min。

（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植
物实行三株标本，必须具有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写下在小纸条
上放到上装标本的袋子里，檀香的标本与写著名字的纸条一同偷拍，样本上存有脏东西时，恳请用纸轻轻盖住，若不确切植物名字，恳请将整棵植物偷拍领用作鉴别，并搞好有关记录。

（2）制作pda固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大
概倒15个板，等待其凝结后用作注射。

2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。

3.取样：
（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位展开采样，穗序
5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果
实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。

（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位注射两块板，小
板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即
左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌
中冲洗时被冲掉。

（3）若植物标本存有余下，且是没烧完的，再次上装不好，放在冰箱里，水泵，
洗过的扔掉。

（4）每种植物标本所剪的样本放到一个50ml的离心管中，放到试管架上，
并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。

4.表面杀菌：在无菌操作台中展开
（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器
已经开始计时1min,每10秒钟摇晃离心管几次，并使其充份杀菌。

（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管
中样本好像出来，盛满的样本不要再放进其中，也不要用手遇到样本，样本不可以碰
触至除了离心管以外的东西。

（3）然后，再向各离心管中加入40ml的3%次氯酸钠，拧紧盖子，用计时
器已经开始计时10min，内要1min摇晃几次离心管，时间至后，扳动盖子，将次氯酸钠放入事先准备工作的锥形瓶中，特别注意不要将管及中样本好像出来，盛满的样本不要
再放进其中，也不要用手遇到样本，样本不可以碰触至除了离心管以外的东西。

（4）最后，用无菌水冲洗三遍，操作步骤同上面（3）。

（5）冲洗完后，将样本放
在盖子里，备用。

（6）表面杀菌就是整个实验中的关键步骤，务必深入细致展开表面杀菌，各项壮
作严格进行。

5.平板注射：
（1）将已经凝固的平板标好相应的植物标本名字，时间和自己的名字，每
种标本的平板再用a、b、c、d利尼县区分，例如桂花a，桂花b，桂花c，桂花d等，桂花a和桂花b用以注射桂花的叶子，c和d用以注射叶柄，以此类推。

（2）在无菌操作台中，打开酒精灯，平板的盖子四周在酒精灯处灭菌，将
镊子在火焰上杀菌后，夹采样本，在酒精灯附近关上平板的一边，放进样本，大板每
个必须注射五个样本即为左上、右上、左下，右下和正中，大板每个注射四个样本即为左上、右上、左下，右下，样本在平板上整齐排序，尽量一次性放在位，不要在平板上到处
安远，掉下来在操作方式台上的样本不可以再用，托盘每种植物标本前一定必须在火焰上
杀菌。

（3）放入样本后，立刻合上平板，并且再在酒精灯处灭菌，此过程要注意
严苛无菌操作。

6.室温培养：接种好的平板放在室温下培养3~7天，每日观察。

7.挑取菌种：等待样本附近短出来菌后，还可以划出相同菌种前，立即展开挑菌。

（1）用记号笔在平板底部划必须放的菌种，并且每块板上标不好1,2,3等，标
完后，数好需要挑的真菌总数，取相应数量灭过菌的1.5ml小管，做好相应的标记。

（2）在无菌操作台中，挑取适当菌种放进1.5ml小管中，特别注意尽量挑取二者
同颜色的菌块，这样挑菌种比较纯，此过程也要注意无菌操作。

（3）记录不好每块板上挑取的真菌数及种类，等待其布满后，同样的则不须要
再记录。

8.提纯菌种：
（1）数好需要纯化的菌种，倒好相应数量的平板，待其凝固后，在无菌操
作台中，将小管中的真菌块下到平板正中央，此过程也必须特别注意无菌操作。

（2）种好菌的平板放在室温下培养，每日观察，若染上细菌，则重新挑到
新板中再短，若分离出其他菌种，则拎代莱板再拆分。

9.菌种保藏：
（1）准备工作：已杀菌的液体石蜡和菌种中草药管，每种菌摆两个小管，其中一
个小管放1ml液体石蜡。

（2）偷拍：等待内生真菌布满平板后，在无菌操作台里关上平板盖子，拍摄下
照片，并且也拍好与之相对应的菌种名称。

（3）中草药：小管搞好标记后放到无菌操作台里，关上酒精灯，挑一个平板
和与之相对应的两个小管，打开小管盖子，盖子口朝上放在操作台上，小管放在酒精灯附近，将平板在酒精灯火焰处灭菌，针在火焰上灭菌后，打开平板盖子，在平板一边划一块培养基，分成若干小块，每个小管放五小块。

合上平板盖子，在火焰处灭下菌，针在挑下一个菌种前务必灭菌。

（4）中草药菌种的小管放在冰箱里。

10.菌种蒸煮：
（1）制作pda液体培养基，与50ml锥形瓶，50ml量筒一起灭菌。

（2）灭菌后，在无菌操作台中将pda液体培养基分装到50ml锥形瓶中，
各个瓶30ml，在瓶壁上写下上适当的所需蒸煮的菌种。

（3）从各个平板中取两小块带菌种的培养基放入瓶中，发酵20天。

（4）注意无菌操作。

11.过滤发酵液体：
（1）准备工作：滤纸，圆柱形，锥形瓶，针筒，细菌滤器（已杀菌的），50ml距
心管（已灭菌的），移液器，ph试纸，1.5ml小管（已灭菌的），96孔板，蒸馏水。

（2）过滤器：将滑下来滤纸的圆柱形先用少量蒸馏水润湿，然后死掉锥形瓶里的
蒸馏水，将发酵瓶中的液体倒入漏斗，注意不要将菌块倒入，也不要倒太满，待其漏下后再倒。

（3）测ph：用移液器汲取一点的发酵液，几滴在ph试纸F83E43Se，并搞好记录。

（4）等待发酵液过滤器回去后，用洗脸整洁的针筒汲取里面的液体，可卡因后，在针
筒头上套上已灭菌的细菌滤器，缓缓打入相应50ml离心管中，并在1.5ml相应小管中放入1ml发酵液，用移液器分别吸取200微升发酵液放入编号为1#和2#的96孔板的相同位置，作好记录，并且记录50ml离心管中最后所得发酵液的体积。

（5）50ml离心管、1.5ml小管、96孔板分别上装不好放进冰箱留存，水泵。

（6）好像出来发酵液的锥形瓶先摆着，不去除，所用的细菌滤器拿走里面的滤
纸，洗净，重放滤纸，用报纸包好灭菌。

12.菌丝形态偷拍：
（1）准备：载玻片和盖玻片，生理盐水，移液器，枪头，显微镜。

（2）在干净的载玻片中央滴20微升生理盐水，用枪头挑一丝菌丝，轻轻在
水中拍散，砌上盖玻片，在显微镜下，分别拍摄下菌丝形态，产孢子结构，孢子以及其他特定形态。