两株H1N1亚型重组流感病毒的猪致病性研究

两株H1N1亚型重组流感病毒的猪致病性研究

何剑桥;韦祖樟;欧阳康;黄伟坚;陈樱;何平;赵卫锋;周华波;丁仰保;梁明丽;祝健;李瑞凯;莫彦宁

【摘要】选取2种不同宿主来源的新型甲型重组H1N1亚型流感病毒(犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV-QZ5)和猪流感病毒

(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV-QZ5),以猪为动物模型,分别以106 PFU/mL病毒剂量和气管攻毒的方式感染3周龄仔猪,从而探究新型甲型重组犬流感病毒对猪的致病性.试验发现CIV-QZ5及SIV-QZ5均能有效感染仔猪,攻毒仔猪均出现发热(≥39.5℃)、流鼻涕、食欲减退、活动减少等流感症状,其中CIV组出现1头仔猪(A3)死亡.通过对肺脏灌洗液进行病毒滴定,发现CIV组在攻毒后3d和5d 在肺脏的复制能力较SIV组强,最高达到3.121og10 PFU/mL.病理剖检发现,肺脏出现不同程度的实变.肺脏病理切片发现两组均出现不同病变,其中以死亡仔猪(A3)最为明显,主要以支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡壁增厚,肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主要特征.结果表明,猪源甲型重组CIV不仅能引发猪出现明显流感症状,而且能有效地在肺脏复制,为了解潜在的猪-犬跨宿主传播机制奠定了基础.

【期刊名称】《动物医学进展》

【年(卷),期】2019(040)002

【总页数】6页(P45-50)

【关键词】H1N1亚型流感;重组病毒;犬流感病毒;致病性;猪

【作者】何剑桥;韦祖樟;欧阳康;黄伟坚;陈樱;何平;赵卫锋;周华波;丁仰保;梁明丽;祝健;李瑞凯;莫彦宁

【作者单位】广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技

术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学

动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;南宁市华波宠

物医院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学

动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西玉林市动物疫病预防

控制中心,广西玉林537000

【正文语种】中文

【中图分类】S852.659.5;S858.28

甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)为负股RNA病毒，基因组包含8个节段，分别为碱性聚合酶2(basic polymerase 2,PB2)、碱性聚合酶1(basic polymerase 1,PB1)、酸性聚合酶(acidic polymerase,PA)、血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)、基质蛋白(matrix,M)和非结构蛋白(nonstructural protein,NS)。每一个节段分别编码1个或者2个蛋白。目前，根据表面糖蛋白(HA和NA)抗原的不同，在野禽中发现了16个HA(H1～

H16)和9个NA(N1～N9)亚型，但是仅有H1和H3在哺乳动物(人、猪、马和犬)中建立稳定体系。H5N1和H7N9亚型禽流感病毒感染人引发了数百人死亡[1-2]，

但是至今仍未获得人-人传播能力。2009年暴发的H1N1亚型流感病毒(pdm/09)大流行引发高度关注，研究证实了猪-人传播的事实[3]。此外，发现H1N1亚型流感也可感染宠物犬。不仅如此，随着该病毒不断与本地流行毒株发生重组，从猪群和犬群中都陆续分离到多种基因型重组病毒。Zhu H等[4]监测发现1株新型重配EA毒株(Sw/GD/1361/10)，其基因型特点是携带欧亚类禽(Eurasian avian-like, EA)表面基因(HA和NA)和pdm/09内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)。2009至2012年的监测中发现猪流感病毒(Swine influenza viruses, SIVs)与北美三重重组(North American triple-reassortant,TR)或EA交替重配，特别是以EA 表面基因与pdm/09内部基因的重组形式频繁在猪群中出现[5]。而在宠物犬中，韩国也陆续报道了与pdm/09重组的新型重配株。例如，新型H3N1亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)，其内部基因及NA基因来源于pdm/09谱系[6]；M基因来源pdm/09谱系，其他基因片段来源H3N2 CIV的重组病毒

H3N2mv株。犬和雪貂试验证实其不仅可引起典型呼吸道症状，而且相比原始的

禽源H3N2 CIV具有较强的毒力和复制能力，尤其证实了源于pdm/09谱系的M 基因可以增强其复制和传播能力[7-8]。

本实验室前期工作中，首次发现并分离得到了新型重组的H1N1亚型CIV和

H1N1亚型SIV。其基因片段来源组均由欧亚类禽谱系的HA、NA和M基因片段、pdm/09的PB2、PB1、PA和NP基因片段和北美三重重组谱系的NS基因片段

组成，从遗传进化分析推断这些甲型重组CIVs来源于猪，因此具有潜在的猪-犬

传播的可能性。为了研究其对哺乳动物的致病性，我们利用小鼠模型进行了前期探索，发现它们能够无适应感染小鼠，在肺脏和上鼻窦能够较好地复制，甚至致死小鼠[9]。但是有研究表明，目前CIVs不能在猪中进行有效复制[10]。为了验证这些猪源CIVs是否能有效地感染猪，我们建立了CIVs感染猪的动物模型，为研究猪-犬跨宿主感染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测为阴性的3周龄仔猪14头，购自广西大学原种猪场。

1.1.2 毒株 H1N1亚型犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV)和

H1N1亚型猪流感病毒(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV)。两株流感病毒均为重组病毒，其病毒基因组重组形式均为：HA、NA、M片段来自欧亚类禽谱系；PB2、PB1、PA、NP片段来自pdm/09谱系；NS片段来自北美三重重组谱系，由广西大学动物科学技术学院传染病与分子免疫实验室分离保存。

1.1.3 主要试剂细胞裂解液RNAiso plus、dNTP、RNasin酶抑制剂、M-MLV Reverse Transcriptase (200 U/ L)，宝生物工程(大连)有限公司产品；舒眠宁(麻

醉药)，广西神九生物制品公司产品；琼脂糖凝胶粉，上海生工生物工程技术服务

公司产品；DMEM培养液、胎牛血清，GIBCO公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物感染试验将14头试验仔猪分为3组，包括A组(SIV组6 头)、B组(CIV组6 头)和C组(对照组2头)，采取麻醉气管攻毒方式，试验组每头仔猪攻毒

2 mL(含106 PFU/mL)病毒液，对照组每头接种2 mL细胞培养液(DMEM)。攻毒后，观察感染仔猪的临床症状，包括体温变化、采食量、呼吸道症状及排粪情况等。分别采集对照组及攻毒组攻毒后0、3、5、7 d鼻拭子。同时攻毒后的3、5、7 d 进行处死，无菌采集各组织器官，包括上鼻窦、气管、肺、心、肝、脾、肾和脑，同时收集肺脏灌洗液，进行空斑测定病毒效价并观察肺脏的病理变化。

1.2.2 样品处理用灭菌棉拭子插入仔猪鼻部，放入含有适量青霉素、链霉素PBS

缓冲液中，漩涡振荡1 min后弃去棉拭子，离心后取上清液进行流感病毒检测。

称取仔猪肺脏以及其他组织，每 0.1 g加300 μL的PBS，进行充分匀浆。然后置