反向遗传技术拯救流感病毒标准操作规程

反向遗传技术拯救流感病毒标准操作规程

反向遗传技术拯救流感病毒标准操作规程（编号：016）

1、目的及适用范围

利用该系统改变病毒基因组序列，拯救重组病毒。

2、主要仪器及试剂

CO2细胞培养箱、生物安全柜、离心机、转染试剂、TPCK处理的胰酶（2μg/mL）、胎牛血清（FBS）、DMEM、293T或Vero等细胞

3、操作步骤

3.1 在转染前细胞传代

3.2转染前换无抗生素培养基，混匀质粒（pPolI-WSN-PB2 pPolI-WSN-PB1 pPolI-WSN-PA pPolI-WSN-HA pPolI-WSN-NP pPolI-WSN-NA pPolI-WSN-M pPolI-WSN-NS pcDNA-PB2 pcDNA-PB1、pcDNA-PA、pCAGGS-NP）pcDNA-PA 0.1μg,其余质粒1μg，按照lipofectamine 2000

说明书操作。

3.3转染4-6h后换液，含TPCK处理的胰酶2μg/mL、0.01%-0.1%FBS的DMEM，48h 可检测到103

以上pfμ的病毒。

4、注意事项

转染试剂：在拯救病毒时不能用PEI，据报道PEI有抑菌杀毒作用。建议用脂质体如lipofectamine 2000。

5、问题向导

没有拯救出重组病毒可能原因：质粒的纯度不够

附：

1、转染用的12质粒：

1.1病毒vRNA表达质粒：pPolI-WSN-PB2 pPolI-WSN-PB1 pPolI-WSN-PA pPolI-WSN-HA pPolI-WSN-NP pPolI-WSN-NA pPolI-WSN-M pPolI-WSN-NS

1.2 病毒聚合酶和NP蛋白表达质粒：pcDNA-PB2、pcDNA-PB1、pcDNA-PA、pCAGGS-NP

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