第七章 固定化酶(Immobilized Enzyme)

根据吸附剂的特点又分为两种：
物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键
等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、 微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有 机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度
2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限 制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位 置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使 酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触， 影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用, 所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称 为空间障碍效应。
3、扩散限制效应
（一）、影响固定化酶（细胞）性质的因素
酶经过固定化后引起的性质改变，不外来自 两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化 载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性 质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种 影响效应：

分配效应 空间障碍效应 扩散限制效应
1、分配效应
由于载体和底物 的性质差异引起了微 环境和宏观环境之间 的性质不同。微环境 是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体 溶液称为宏观环境。 由这种不同造成的底 物、产物和各种效应 物在两个环境之间的 不同分配，被称为分 配效应。
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二、固定化酶（细胞）的性质
有一定的机械强度且稳定性好，催化剂与系统分
相。 固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂质，在 反应中酶与产物自然分开，所以产物易提纯，收 率也高。 酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提高，可 较长期使用与储藏，并可以再生。 能反复使用，可大大降低生产成本；同时也为实 现生产的管道化、连续化与自动化提供了可能。
1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小 和总吸附面积的大小。
2.共价偶联法的优点、缺点
（1）共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合 牢固、稳定性好、利于连续使用。 （2）共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂， 反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较 高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的 空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。
（四）、交联法
共价交联法的基本原理是酶分子和多功能试 剂之间形成共价键得到三维的交联网状结构
4、固定化酶（细胞）的最适温度的变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速 度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性 提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利 的结果。
5、米氏常数Km的变化
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性 能变化。 简单说，由于高级结构变化及载体影响引起 酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km 变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高， 载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩 小以至消失。
第七章 固定化酶
（Immobilized Enzyme）
酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使 用，而且不易与产物分离，不利于产物 的提纯和精制。 针对这些限制酶广泛应用的因素，将 水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手 段处理，将酶束缚在一定的空间内，限 制酶分子在此区间进行活跃的催化作用， 成为不溶于水的固定化的酶或细胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范 围内进行催化反应的酶。
1.共价交联法的四种形式：
（1）酶直接交联法： 在酶液中加入适量多功能试剂，使其 形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试 剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反 应时间之间的平衡。 操作简单，但是缺乏选择性，活力回 收往往不高。
（ 2 ）酶辅助蛋白交联： 当可得到的酶量有限，可以使用第二个 “载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使 酶与惰性蛋白共交联的方法。
3.包埋法的优点、缺点 包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、 很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。 包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以 通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是 大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架 会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶 动力学行为改变，使活力降低。
（三）、共价结合（偶联）法
共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。它 的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上 的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上 （借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能 基团进行偶连）。
1.共价偶联法中的几个影响因素
（ 1 ）载体的物化性质要求载体亲水，并且有 一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件 下与酶结合的功能基团。 （ 2 ）偶联反应的反应条件必须在温和pH、中 等离子强度和低温的缓冲溶液中。 （ 3 ）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的 其它功能基团副反应尽可能少。 （ 4 ）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少 载体的空间位阻对酶活力的影响。
条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的 相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚 糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如 Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
1.影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:
一、固定化酶(细胞)的制备方法
(一) 吸附法 （二）包埋法 （三）共价结合（偶联）法 （四）交联法 （五）四种固定化酶制备方法的特点小结 （六）固定化方法与载体的选择 （七）固定化细胞 （八）固定化酶(细胞）应用实例
吸附法 包埋法 共价结合法 交联法
(一)、吸附法
吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键 相互作用而达到固定目的的方法。 只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经 洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的 固定化技术，在经济上也最具有吸引力。
2、固定化后酶稳定性提高
稳定性提高的原因：
固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子
伸展变形。 酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作 用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起 作用。 抑制自降解，提高了酶稳定性。
3、固定化酶（细胞）的作用pH变化
酶固定化后，对底物的最适pH曲线 常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定 化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之， 若使用带正电荷载体的话，其最适pH值 较游离酶偏低，即向酸性偏移。
这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是 白蛋白、明胶、血红蛋白等。
（3）吸附交联法： 此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化 铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交 换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联，用此法所得固定化酶也可称为壳状 固定化酶。
（4）载体交联法： 用多功能试剂的一部分功能基团化学 修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能 基团偶联酶蛋白。
2、微囊化包埋法
微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶 囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业 使用 。 微囊制备方法 （1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某 些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的 皮膜将酶包埋。 （2）界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。他所得的 微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发 生化学反应而失活。 （3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活 性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于 是产生了扩散阻力： 1）、外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面 传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前， 发生在固定化颗粒周围的液膜层。 它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增 加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。 2）、内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后 传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应 同时进行。 载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。 因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大 而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以 降低这种内扩散阻力。
（二）、包埋法
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）：
将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的 酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就 在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高， 并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联 到高聚物上，可以减少酶的脱落。 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提 取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 ，操作简单经 济。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属 离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化 的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 胶原和明胶也是常用的包埋载体。
（八）固定化酶(细胞）应用实例
固定化酶和固定化细 胞 氨基酰基转移酶 应用 DL-氨基酸的旋光度解 析 生产时 间
1969
葡萄糖异构酶
青霉素酰胺酶 天冬氨酸酶 延胡索酸酶 ß -半乳糖苷酶 L-天冬氨酸ß -脱羧酶
将葡萄糖异构变为果糖
生产6-APA 生产L-天冬氨酸 生产L-苹果酸 水解乳糖 生产L-丙氨酸
2.吸附法的优点、缺点
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多， 吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的 固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落， 会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。
世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAESephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于 DL-AA的光学分析。