微卫星筛选方法课件(精选)

微卫星分析讲解

2核苷酸重复4种类型(AT)n/(TA)n、 (AG)n/(TC)n、 (AC)n/(GT)n、 (GC)n/(CG)n。
3核苷酸重复有10种类型。
每个微卫星DNA 都由核心序列和侧翼序列组成，其核心序列呈串联重复排列，侧翼序列位于核心序列的两端，为保守的特异单拷贝序列。
PCR扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测，如放射性同位素、银染、荧光标记。
我们使用的 T1 载体是 3000bb，太长的片段不易连接。
6、接头连接里面的接头是商业化接头还是贵公司设计合成的，依据是是我们自己制备的。同问题 3，根据内切酶所切还是互补序列一样。
沸煮
8、解链 15lPCR 产物。 98℃沸煮 5-10min，迅速冰浴 1 min， 48℃水浴 1-5min，迅速冰浴 1 min。这个步骤是否有问题，每步的目的是？
已知序列：先用SSR hunter扫描SSR位点，再根据得到的序列设计引物进行后列设计引物进行后续实验。
实验报告主要内容
文字性实验报告：包含实验试剂耗材、步骤、实验条件、体系、引物序列、统计结果等；
各位点筛选多态性的PDF图；
2、引物设计合成及筛选
荧光引物标记：选取一对引物中的一条，合成寡核苷酸链后在5’端合成上荧光素，FAM、HEX、TMR、ROX 标准组合；
设计与合成：荧光引物的标记效率和纯度对后期试验至关重要，我们按照法医身份鉴定试剂盒和基因诊断领域的标准来制备荧光引物；
筛选：我们利用M13（荧光/通用引物，18bp，在5’端添加荧光标记，将M13互补序列添加到一条普通引物的5’ ）加尾法提供筛选服务
测序原始数据（序列和峰图均去掉载体序列）；
PDF图及对应的excel表（微卫星分析）；

微卫星分析讲解

我们使用的 T1 载体是 3000bb，太长的片段不易连接。
6、接头连接里面的接头是商业化接头还是贵公司设计合成的，依据是是我们自己制备的。同问题 3，根据内切酶所切还是互补序列一样。
沸煮
8、解链 15lPCR 产物。 98℃沸煮 5-10min，迅速冰浴 1 min， 48℃水浴 1-5min，迅速冰浴 1 min。这个步骤是否有问题，每步的目的是？
目的是让 DNA 完全变性成单链 DNA，利于杂交。
1-5min， 98℃
9、杂交体系中的探针是根据 DNA 吗不是，还有非目的 DNA。
11、菌落用的是何种菌大肠杆菌的 TOP10 菌株。
12、TP -M13-SSR 程序中为何有两个不同的循环，目的是前 35 个循环让引物结合扩增目的片段，后 10 个循环与 TP -M13 结合。
1、在接头连接反应中，核酸内切酶：Sau3AI,
5’
TGTAAAACGACGGCCAGT-FAM/HEX
微卫星扩增引物的来源：
直接应用已发表的微卫星DNA引物
使用近缘物种的引物
通过筛选DNA序列数据库，或筛选克隆的简单重复序列，借助计算机软件进行引物—最好最根本的方法（引物开发）
2、目前样品是否有剩余，大概剩余多少，都哪些样品有剩余叶片和 DNA 均有剩余，可以给您返样。
3、选用 Sau3AI 酶是否有依据 Sau3AI 能切出 4 碱基粘性末端，我们使用的接头序列是与该粘性末端匹配的，
识别 4 碱基的内切酶位点比 5 或 6 碱基的位点要多（依据概率计算），可以把基因组打断，但又不会打得很碎。也可以使用其他 4 碱基内切酶替换，但接头序列也要与之改变。文献中常用的内切酶有 Sau3AI、EcoRI、Rsa I 等。

高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM

高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM摘要：本文介绍了一种新的识别微卫星位点的方法，微卫星标记是一种功能强大的共显性标记，扩增产物可靠且可以确定已知物种的高度的多态信息含量，但是对于新位点的发现依然是一种费时费力的方法。

相对于大肠杆菌文库分离方法，新一代测序技术（NGS）可以得到更多可用的候选基因。

我们对已知微卫星引物的注释作了系统的论述，并发现无论采用什么分离技术，由于PCR 未充分扩增，基因位点的单态性或多拷贝都会导致一半以上的候选基因丢失。

因此，在分子标记技术上，筛选候选基因依然是一个很关键的步骤。

我们通过重新评估毛细电泳法进行基因分型，发现HRM可以用于基因分型及筛选候选基因，对此列出了具体的流程。

通过该流程，或许我们可以快速地进行新一代标记的检测，并可以把费用降低到传统方法的一半甚至四分之一。

关键词：HRM 微卫星重新分离技术分子标记新一代测序技术群体遗传学引言微卫星也叫简单重复序列（SSRs），是群体遗传学中最强大的共显性标记，具有广泛的应用(e.g., Chambers and MacAvoy 2000; Ellegren 2004; Jarne and Lagoda 1996;MacDonald et al. 2011)。

最近由于新一代测序技术（NGS）的发展正解决SSRs技术中的一个重要的缺陷，不能获得足够的设计引物的数据。

扩增片段多态位点的选择，依然是一件费时费力的工作，这是SSRs发展中的另一个瓶颈。

因此我们引进了HRM用于识别潜在的SSR位点，并且HRM有望加快SSR的发展速度，降低传统方法的费用。

SSRs 一般是以核心序列1-6bp为重复单位首尾串联而成的短的DNA序列(Wan et al. 2004)。

微卫星具有高突变率、易于进行PCR扩增、便于毛细电泳法(CE)的分析以及可以利用许多软件工具进行生物学推论的诸多优点，使其在群体遗传学方面得到广泛应用。

传统的SSR位点的重新分离，是借助于丰富的基因文库(Glenn and Schable 2005; Zane et al. 2002)，但是该法对于SSR位点不多的物种则不能检测到足够的位点进行分析(Arthofer et al. 2007; Megle´cz et al. 2004)。

磁珠富集法筛选白鲢的微卫星分子标记

• 1 材料和方法
• 1.1白鲢基因组DNA片段的提取和酶切
采白鲢的血液，每0.1mL血浆加0.9 mL裂解液, 37 ℃消化过夜，用等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液(25： 24 ：1)抽提3 次。然后用0.05 mol/LTris-HCl(pH8.0)和0.01 mol/L EDTA (pH 8.0)透析16 h 。无水乙醇沉淀，溶于0.1×TE。用限制性内切酶Sau3A I酶切，1% 琼脂糖凝胶电泳检测，切下400~ 900 bp片段用试剂盒进行回收备用。
• 1 .6 连接T-载体，克隆建立10µL连接反应体系：2×连接酶缓冲液5µL, pGEM-T vector 1µL，插入DNA片段2µL，T4DNA连接酶1µL(3U/µL )，加无菌去离子水补足10µL，同时T载体自身连接作为对照，4℃连接过夜。用CaCl2制备的感受态大肠核心序列重复次数应当在一个非常高的水平上，避免由于微卫星核心序列过短，造成微卫星标记筛选中多态性引物比例过低而造成浪费。本研究所得到的白鲢微卫星序列重复数在10次以上的占总数的 71.74% ，这对于筛选PIC高的分子标记，进行白鲢野生甚至养殖种群的遗传多样性研究是十分有利的。
• 1 .4 .3 磁珠吸附富集
磁珠上包被有链霉亲和素，可与探针上的生物素结合，从而通过磁力将探针连同所需的微卫星序列一同分离出来。将杂交完毕的杂交液加入已平衡好的磁珠中， 25 ℃温育20min ，并轻轻摇动使生物素和链霉亲和素充分结合。温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液。依次用洗液Ｉ，洗液II，洗液III 洗涤磁珠，去除不含有微卫星的序列。洗涤方法是：洗液I在室温洗2 次，每次静置10min；洗液 II在68℃洗2次，每次静置15 min；洗液III 在室温快速洗2次，即可基本将不含微卫星的序列去除干净。

凡纳滨对虾微卫星序列的筛选

段，通过拼接获得了２０２２５条ｕｎｉｇｅｎｅ，从中鉴定得到５８８条微卫星序列，设计了５５７对微卫星引物。随机挑选其中２０对微卫星引
物进行ＰＣＲ扩增，结果有１８对引物扩增成功。研究结果大大丰富了凡纳滨对虾的基因组资料，增加了凡纳滨对虾可用的微卫星
ｐｕｔｓｅｕｅｑｎｃｉｎｇ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎ５００１７７ｍＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｔｏｔａｌｏｆ２０，２２５ｕｎｉｇｅｎｅｓｗｅｅｒｏｂｔｉｎａｅｄｂｙａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅｍＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ａｎｄ５８８ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｅｒｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄｆｒｏｍｔｈｅｕｎｉｇｅｎｅｓ．５５７ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｏｆｍｉｅｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｓｗｅｌ１．Ｔｗｅｎｔｙｍｉｃｒｏｓａｔｅｌ－ｌｉｔｅｐｉｍｅｒｒｐａｉｓｒｗｅｅｒｒａｎｄｏｍｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒＰＣＲａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ１８ｐｉｍｅｒｒｐａｉｓｒｗｅｅｒｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｍｐｌｉｉｅｆｄ．Ｔｈｅｅｓｒｕｌｔｓｈａｄｇｒｅａｔｌｙｅｎ・ｉｃｒｈｅｄＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｇｅｎｏｍｉｃｄａｔａ，ｉｎｃｅａｒｓｅｄｔｈｅａｖａｉｌａｂｌｅｍｉｃｅｓｒａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｓ，ａｒｎｄｗｅｅｒｉｍｐｏｒｔａｎｔｏｒｆｇｅｒｍｐｌａｓｍ，ｇｅｎｅｔｉｃｅｓｒｅａｒｃｈａｎｄｍｏ — ｌｃｕｅｌａｒｍａｒｋｅｒｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆＬ．１）ａｎ／ｌａｍｅｉ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ；Ｍｉｅｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓｅｕｅｑｎｃｅｓ；Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ

微卫星引物筛选步骤

1．进行酶切用Vs pⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。

反应体系为：ddH2O 15µLVs pⅠbuffer 2µLVs pⅠ酶1µLDNA2µL总体积20µL酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。

PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。

Vs pⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 3’5’T A A T↑T A 3’AseⅠ酶的接头为：A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’AseⅠ酶用的预扩增产物为：A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’2．接头制备用10µL A1（200µM）和10µL A2（200µM）混合，94℃ 3min后室温放置30min。

3．酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。

连接反应体系如下：ddH2O 5µLT4 ligation酶0.5µLT4 buffer4µL酶切产物20µLA TP（10mM）0.3µLAE 1µL总体积30.8µL上述混合体系在16℃连接过夜。

10h左右。

4．连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。

扩增引物为A3。

反应体系如下：ddH2O 14µL10×buffer 2.5µLMg2＋2µLdNTPs（10mM）0.5µLA3 1µLDNA（连接产物）5µLTaqE（2.5U/µL）0.2µL总体积25.2µLPCR反应程序为：（94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，72℃ 10min，4℃ hold。

微卫星引物筛选步骤

1．进行酶切用Vs pⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。

反应体系为：ddH2O 15µLVs pⅠbuffer 2µLVs pⅠ酶1µLDNA 2µL总体积20µL酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。

PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。

Vs pⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 3’5’T A A T↑T A 3’AseⅠ酶的接头为：A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’AseⅠ酶用的预扩增产物为：A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’2．接头制备用10µL A1（200µM）和10µL A2（200µM）混合，94℃ 3min后室温放置30min。

3．酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。

连接反应体系如下：ddH2O 5µLT4 ligation酶0.5µLT4 buffer4µL酶切产物20µLA TP（10mM）0.3µLAE 1µL总体积30.8µL上述混合体系在16℃连接过夜。

10h左右。

4．连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增，每个样本做4管。

扩增引物为A3。

反应体系如下：ddH2O 14µL10×buffer 2.5µLMg2＋2µLdNTPs（10mM）0.5µLA3 1µLDNA（连接产物）5µLTaqE（2.5U/µL）0.2µL总体积25.2µLPCR反应程序为：（94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，72℃ 10min，4℃ hold。

微卫星引物筛选步骤

1．进行酶切用Vs pⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ‎）基因组DN‎A（需基因组D‎N A浓度较‎高）进行酶切。

反应体系为‎：d dH2O‎15µLVs pⅠbuffe‎r 2µLVs pⅠ酶1µLDNA2µL总体积20µL酶切在37‎℃反应3～4h即可，但是为了提‎高酶切效率‎可切4～6h。

PCR反应‎程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min‎，4℃ hold。

Vs pⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位‎点为：5’A T↓T A A T 3’5’T A A T↑T A 3’AseⅠ酶的接头为‎：A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’AseⅠ酶用的预扩‎增产物为：A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’2．接头制备用10µL‎A1（200µM‎）和10µL‎A2（200µM‎）混合，94℃ 3min后‎室温放置3‎0min。

3．酶切片段与‎接头连接接头为A1‎和A2制备‎的接头，命名为AE‎。

连接反应体‎系如下：ddH2O‎5µLT4 ligat‎i on酶0.5µLT4 buffe‎r4µL酶切产物20µLA TP（10mM）0.3µLAE 1µL总体积30.8µL上述混合体‎系在16℃连接过夜。

10h左右‎。

4．连接产物P‎C R扩增对连接产物‎进行PCR‎扩增，每个样本做‎4管。

扩增引物为‎A3。

反应体系如‎下：ddH2O‎14µL10×buffe‎r 2.5µLMg2＋2µLdNTPs‎（10mM）0.5µLA3 1µLDNA（连接产物）5µLTaqE（2.5U/µL）0.2µL总体积25.2µLPCR反应‎程序为：（94℃ 30sec‎，56℃ 1min，72℃ 1min）×20，72℃ 10min‎，4℃ hold。

四大家鱼微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用

• 在 5、8月份所占的比例最大分别 11.81% 和22.8%，9月份次之,6、7月份比较少；在总量上，草鱼最多，青鱼最少，鉴定结果与形态鉴定基本一致，说明采用微卫星标记进行种类鉴定是可行的。
青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼原是我国特有的鱼类，最早作为驯养种类故有 “四大家鱼”之称。四大家鱼在我国具有分布广、生长快、食性广、抗病力强、肉味鲜、易养殖等特点，是我国淡水养殖和捕捞的主要对象。近年来，由于水利工程建设、环境污染、过度捕捞等诸多因素，使四大家鱼的天然产量急剧下降，四大家鱼的资源状况直接影响着我国淡水渔业的持续发。为此，有必要对四大家鱼的早期资源展开调查。
• • • • • • • • • • • • • • • • • •
结论与讨论四大家鱼特异性微卫星位点的获取微卫星标记的筛选和开发是利用微卫星标记鉴定物种中最关键的一步本研究从经济省时高效的目的出发从已发表的文献和数据库中查找微卫星标记其中从文献中共获得个微卫星位点其中个位点和可用于四大家鱼的种类鉴定说明从文献中获取微卫星标记是可行的但是获取效率较低可能与这些标记用于四大家鱼遗传多样性的研究有关多态性较高不利于单态性标记的筛选是近年来开发微卫星标记的首选数据库研究表明中含有较为丰富的微卫星序列约有个别物种甚至达到以上本文从和中获得个微卫星标记共筛选出四大家鱼的个微卫星鉴定位点筛选效率较从文献中获取较高认为重复次数多的微卫星既能在种间又能在种内产生多态性但重复次数少的微卫星仅能在种间产生多态性可能与本文所筛选的标记中重复次数较少有关

鲫鱼微卫星DNA的筛选

１．材料
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～～蝴～一（黼
５’ ＞ＧＴＣＣＡＱＡＣｆＧＴＣＡＴＣＡＧＧＡＧ＜３’ ５’ ＞ＧＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＡＧＴＣＡＣＧＣ ’
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鲫鱼微卫星ＤＮＡ的筛选
赵佳余炎炎
（河南省信阳市华锐学院）
摘要：利用近缘物种鲤鱼的微卫星序列做引物来分离鲫鱼的微卫星标记。方法：以鲫鱼基因组ＤＮＡ为模板，利用４对鲤鱼的微卫星序列做引物进行ＰＣＲ扩增，对ＰＣＲ产物通过８％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。筛选出以Ａｃ为重复单元的鲫鱼的微卫星
５＇：￣２ＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＯＣＡＴＡＧＴ＜３ ’
１４．
５２０
２．４ＰＣＲ反应条件
１．１实验材料：河南信阳南湾湖中的野生鲫鱼一条。１．２实验试剂：所用ＲＮａｓｅＡ，ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ，ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ２，ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｅｒ２，ＣｌｅａｎＢｕｆｅｒ２，ＷａｔｅｒＢｕｆｅｒ２，ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒ等动物组织ＤＮＡ的提取试剂均购自北京全式金生物技术有限公

微卫星方法简介

微卫星方法简介关键词微卫星分子生态应用80年代以来，分子生物学技术与方法已成为进化生物学、保护遗传学、生态学等诸多领域非常重要和崭新的研究工具。

而摆在人们面前可供选择的分子生物学方法又有许多种，如同工酶(allozymes)、限制性片断长度多态性(Ristriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、多位点或单位点小卫星(Multi-locus or Single-locus Minisatellites)以及随机扩增多态DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD)。

其中每种方法都具有自己明显的不足之处，比如：同工酶标记物由于位点多态性低、变异低而不能很好地被用来估计群体内部个体之间的亲缘关系，这在研究濒危物种时显得尤为突出；小卫星探针由于其片断长而难以获得；RAPD方法稳定性和重复性较差。

目前，随着人们对微卫星(Microsatellites)方法认识的不断深入，这一技术和手段越来越为研究者们所青睐。

微卫星(又名简单序列)是由串联重复序列组成，每单元长度在1～10bp之间，如(TG)n或(AAT)n［1～3］，广泛分布于真核基因组中［4］，因重复单元数目不同而呈现高度多态性［5］。

1 微卫星的产生历程生物学家在20世纪70年代就已经知道真核基因组中存在着短串联重复位点，但直至1982年Hamada等［6］发现从酵母到脊椎动物中的多拷贝多聚(dT-dG)时，这些序列的数目之大和存在之广泛才显现出来。

这一发现后来被Tautz和Renz［7］所证实：他们用不同微卫星序列与不同有机体中的基因组DNA杂交，发现存在着许多类型的简单序列。

1985年，Jeffreys等［8］发现了人基因组中有更长重复单元的超变串联重复序列，即小卫星DNA(Mini-satellite)。

与微卫星一样，小卫星的串联重复单位的数目也显示出可变性，因此二者被统称为可变数目串联重复位点(Variable Number of Tandem RapeatsVNTRs)［2］。