微卫星位点筛选方法综述

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高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM

高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM

高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM摘要:本文介绍了一种新的识别微卫星位点的方法,微卫星标记是一种功能强大的共显性标记,扩增产物可靠且可以确定已知物种的高度的多态信息含量,但是对于新位点的发现依然是一种费时费力的方法。

相对于大肠杆菌文库分离方法,新一代测序技术(NGS)可以得到更多可用的候选基因。

我们对已知微卫星引物的注释作了系统的论述,并发现无论采用什么分离技术,由于PCR 未充分扩增,基因位点的单态性或多拷贝都会导致一半以上的候选基因丢失。

因此,在分子标记技术上,筛选候选基因依然是一个很关键的步骤。

我们通过重新评估毛细电泳法进行基因分型,发现HRM可以用于基因分型及筛选候选基因,对此列出了具体的流程。

通过该流程,或许我们可以快速地进行新一代标记的检测,并可以把费用降低到传统方法的一半甚至四分之一。

关键词:HRM 微卫星重新分离技术分子标记新一代测序技术群体遗传学引言微卫星也叫简单重复序列(SSRs),是群体遗传学中最强大的共显性标记,具有广泛的应用(e.g., Chambers and MacAvoy 2000; Ellegren 2004; Jarne and Lagoda 1996;MacDonald et al. 2011)。

最近由于新一代测序技术(NGS)的发展正解决SSRs技术中的一个重要的缺陷,不能获得足够的设计引物的数据。

扩增片段多态位点的选择,依然是一件费时费力的工作,这是SSRs发展中的另一个瓶颈。

因此我们引进了HRM用于识别潜在的SSR位点,并且HRM有望加快SSR的发展速度,降低传统方法的费用。

SSRs 一般是以核心序列1-6bp为重复单位首尾串联而成的短的DNA序列(Wan et al. 2004)。

微卫星具有高突变率、易于进行PCR扩增、便于毛细电泳法(CE)的分析以及可以利用许多软件工具进行生物学推论的诸多优点,使其在群体遗传学方面得到广泛应用。

传统的SSR位点的重新分离,是借助于丰富的基因文库(Glenn and Schable 2005; Zane et al. 2002),但是该法对于SSR位点不多的物种则不能检测到足够的位点进行分析(Arthofer et al. 2007; Megle´cz et al. 2004)。

微卫星检测方法

微卫星检测方法

微卫星DNA简单重复序(SSR)也称微卫星DNA,也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms),STMS (Sequence-tagged microsatellites)。

其串联重复的核心序列为1一6 bp,其中最常见是双核昔酸重复,即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同,重复单位数目10一60个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。

SSR标记的基本原理:根据微卫星序列两端互补序列设计引物,通过PCR反应扩增微卫星片段,由于核心序列串联重复数目不同,因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。

SSR具有以下一些优点:(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点;(2)微卫星呈共显性遗传,故可鉴别杂合子和纯合子;(3)所需DNA量少。

显然,在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。

如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。

1 微卫星DNA的构成及特点微卫星又称简单序列重复(Simple Se-quence Repeats,SSR)。

一般以1-6个碱基为核心序列,首尾相连组成的串联重复序列。

这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中,含量丰富,且呈随机均匀分布。

它们不仅大量分布于基因的间隔区和内含子中,而且还分布于基因的外显子和调控区(如启动子、增强子),真核生物平均每50-150 kb就存在一个微卫星位点,如在人类基因组中每6 kb就有1个微卫星,禽类基因组中约89 kb出现1个微卫星。

微卫星DNA 数目巨大,人类基因组中约有5×104-1×105个(CA)n重复序列,重复次数一般为15-60次,重复单位相同,其长度一般小于200 bp,但也有的更长。

每个特定位点的微卫星DNA均由两部分构成:中间的核心区和外围的侧翼区。

泥蚶(Tegillarca granosa)GT微卫星位点的筛选和性质鉴定

泥蚶(Tegillarca granosa)GT微卫星位点的筛选和性质鉴定

在 构建遗 传连锁 图谱 和 Q L图谱 的各种 标记 中, T
微卫 星标 记( co a lt o i l S q ec e et Mirst le r mpe eu n eR p a, e i S
济 养 殖 贝 类 ,其 产 量 占浙 江 省 海 水 养 殖 总产 量 的 5 一 1 %,是浙 江省第二 大海水 养殖 品种 ( % 0 李太 武等,
于养 殖环 境 的恶 化 ,养 殖 容 量超 过 养殖 环 境所 能 承
受 的范 围;另一方 面,养殖 的泥蚶 种苗是 由没有 经过 遗 传选 育 的 野生 亲本 人 工 育 苗生 产 的 ,并 且通 常 用 少数 亲本来育 苗;在 经过 累代养殖后 ,养殖 群体 出现 近交 衰退 ,使 一些 具有 优 良性 状 的基 因丢 失 。 因此 , 如何在 经典的选 育 、杂交 育种方 法基础 上,借鉴陆 地
Байду номын сангаас
关键词
微 卫星,磁珠,泥蚶
Q5 7
中 图 分 类 号
泥蚶 (e iac rn s in e s, 称血蚶 、 Tgl raga oaLn au) 俗 l 宁
蚶 、花蚶 、粒 蚶,属软 体动 物 门( l sa 、瓣 鳃纲 Mol c) u
(a el rn ha 、 L m lbac i) 列齿 目(a o o t) 蚶科( ria ) i T x d na 、 A cde,
维普资讯
第3 9卷 第 2期 2008 年 3 月





Vb J9. O2 l3 N . Ma.2 8 t, 00
OC ANOL E OGI E L MNOL A T I OGI S NI A I CA

微卫星位点筛选方法综述

微卫星位点筛选方法综述

论文综述微卫星分子标记筛选方法综述摘要:微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。

它作为一种重要的分子遗传标记,能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化,被广泛应用于实验动物的研究。

本文概述了获得和富集微卫星位点的常用方法。

最简便、最省时的方法是从从公共数据库(如Genbank、EMBL、EST数据库等)或已发表的文献中查找到微卫星位点,但只限于已经有序列数据发布的物种;第二种方法是种间转移扩增,即从相近物种的数据库中查找微卫星位点,或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。

第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点,其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及分子标记技术法。

关键词:微卫星;分子标记;实验动物微卫星(Microsatellite),又称为简单序列重复(Simple Sequence Repeat , SSR),短串联重复(Short Tandem Repeat STR),是以少数几个核苷酸(一般1~6个)为重复单位的串联重复DNA序列。

微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中[1],在植物基因组中平均每33 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点,而在哺乳动物中每6 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点[2]。

并且SSR的重复次数不同和重复程度不同,使其呈现高度的多态性。

微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因,区分二倍体(或多倍体)的纯合体或杂合体,这是AFLP、RAPD 等显性标记所无法做到的。

另外,微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性,方便各实验室间的交流。

目前,微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。

随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。

微卫星引物筛选步骤

微卫星引物筛选步骤

1.进行酶切用Vs pⅠ对四种鱼(GC、GS、NL和ZZ)基因组DNA(需基因组DNA浓度较高)进行酶切。

反应体系为:ddH2O 15µLVs pⅠbuffer 2µLVs pⅠ酶1µLDNA 2µL总体积20µL酶切在37℃反应3~4h即可,但是为了提高酶切效率可切4~6h。

PCR反应程序为:94℃ 5min,(94℃ 1min,53℃ 1min,72℃ 1min)×30,72℃ 10min,4℃ hold。

Vs pⅠ酶即(AseⅠ酶):酶切识别位点为:5’A T↓T A A T 3’5’T A A T↑T A 3’AseⅠ酶的接头为:A1:5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’A2:5’TAG GTA CGC AGT C 3’AseⅠ酶用的预扩增产物为:A3:5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’2.接头制备用10µL A1(200µM)和10µL A2(200µM)混合,94℃ 3min后室温放置30min。

3.酶切片段与接头连接接头为A1和A2制备的接头,命名为AE。

连接反应体系如下:ddH2O 5µLT4 ligation酶0.5µLT4 buffer4µL酶切产物20µLA TP(10mM)0.3µLAE 1µL总体积30.8µL上述混合体系在16℃连接过夜。

10h左右。

4.连接产物PCR扩增对连接产物进行PCR扩增,每个样本做4管。

扩增引物为A3。

反应体系如下:ddH2O 14µL10×buffer 2.5µLMg2+2µLdNTPs(10mM)0.5µLA3 1µLDNA(连接产物)5µLTaqE(2.5U/µL)0.2µL总体积25.2µLPCR反应程序为:(94℃ 30sec,56℃ 1min,72℃ 1min)×20,72℃ 10min,4℃ hold。

虎纹蛙微卫星位点的跨种引物筛选

虎纹蛙微卫星位点的跨种引物筛选

护野生动物 , 同时被列 入 CT S附录二 和《 IE 中国物种 红色名录》 易危等级 。近年来 由于栖息地破坏、 J 过
度捕猎 以及人们传统饮食文化消费 的影响 , 虎纹蛙野
生种群数量急剧下降。为 了满足人们 日 益增长的消费
需求 , 大量泰国虎纹蛙种群被引入 国内进行人工养殖 , 同时还与本 地种群 进行杂交繁育 。这种繁育 方式 J 和大规模的种群下降会对物种的遗传多样性和遗传结
文献标识码 : A
文章编号 :6434 2 1 )20 3 -4 17 -4 X(0 1 0 - 70 0
基 金项 目 : 浙江省 自然科 学基金 项 目( 5 6 3 ) 浙 江省科技计划重点项 目(0 8 20 7 Y 02 4 ; 20 1 2 5 ) 2 作者简 介 : 东海 (9 2一) 男, 宁沈 阳人 , 士研 究生, 究方向为两栖 类保 护遗传 学与分子 生态学。 陈 18 , 辽 硕 研
因此本文采用近缘物种跨种扩增的方法对虎纹蛙
的微卫星位点进行引物筛选 , 以期为该物种遗传多样 性和遗传结构的检测及无尾 目物种跨种扩增的后续相
关研究提供基础资料 。
1 材料 和方 法
3s退火温度退火 3 s7  ̄延伸 4 s最后再 7  ̄延 5, 5 ,2 C 5; 2 C 伸 lmn O i。其 中退火温度采用温度梯度( 8 4  ̄ 6 ℃) C一 0 来执行。对于有扩增 产物的位点 , 优化其反应条件和 反应体系, 直至获得单一 、 稳定的扩增结果。 将 P R扩增后 的结果按照有无 目的条带、 C 涂带和
(. 1浙江师范大学 生态研 究所 , 浙江 金华 3 10 ; . 204 2 浙江大学 生命科学学院, 杭州 305 ) 10 8

种间转移扩增法筛选长爪沙鼠微卫星位点

种间转移扩增法筛选长爪沙鼠微卫星位点

爪 沙 鼠 的基 础 研 究 相 对 薄 弱 , 其 是 遗 传 学 基 础 尤
研 究 开 展 的 甚 少 , 使 对 长 爪 沙鼠 生 物 学 特 性 及 致
应 用 研 究 不 够深 入 。找 到更 多 的遗 传 标 记 物 是 开
展 长爪 沙 鼠 遗 传 研 究 的基 础 和 条 件 , 微 卫 星 由 而
2 2 长 爪 沙 鼠 微 卫 星 位 点 的 类 型 分 析 .
1 11 实 验 动 物 : 洁 级 长 爪 沙 鼠 2 . . 清 2只 , 别 不 性
限, 体质 量 4 8 , 9~ 5g 由首都 医科大 学实 验动 物部提
供 【 C K( )0 0— 0 2 , 于提取 基 因组 D A。 S X 京 20 0 1 】 用 N 1 12 仪 器 : 脂 糖 凝 胶 电 泳 仪 ( 京 六 一 仪 器 .. 琼 北
T ep s i C rd c e e un e n o f m d a i pe sq e c e e t( S h oi v P R p o u t w r sq e cd a d c n r e ss l e u n e rp a S R) l i e ut O ee 5 6 te s e i m o .R s l c ft s 3 h m uema es 3 3( 8 3 % )w r i rt ya pie r elb r o ebl f h s 3 3sq e c dm res 3 o s r r , 1 5 . 9 k eed c e m l df m t oa r g ri .O ee 1 e u n e ak r,10 sel i f o h a ty s t
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微卫星位点获取方法的研究进展

微卫星位点获取方法的研究进展

微卫星位点获取方法的研究进展微卫星位点获取方法是一种基因分型和遗传分析的重要手段,它可以通过测定微卫星位点的多态性来研究个体间的遗传差异和进化关系。

研究者们一直致力于发展更加高效、准确和便捷的微卫星位点获取方法。

本文将介绍微卫星位点获取方法的研究进展,并分析不同方法的优劣势。

传统的微卫星位点获取方法主要依赖于聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, )或琼脂糖凝胶电泳(Agarose Gel Electrophoresis)技术。

这些方法需要进行反应体系的优化和样品处理的多个步骤,操作繁琐且费时。

此外,这些方法对于微卫星序列扩增反应的选择性和敏感性有一定的限制,导致了低位点数目和较大的测定误差。

近年来,随着高通量测序技术的发展,研究者们开始采用下一代测序(Next Generation Sequencing, NGS)平台进行微卫星位点的获取和分型。

这些方法不仅可以获得更多的位点信息,还可以提高测定精度和准确性。

NGS方法的主要优势在于其高通量性和多样性,可以同时对多个样品进行测定,并且可以对微弱突变进行敏感检测。

其中,常用的NGS方法包括基因组重测序(Whole Genome Sequencing, WGS)、基因组库构建和目标区域测序(Targeted Re-Sequencing)等。

此外,研究者们还开发了一些基于多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)的位点获取方法,如多重微卫星分型法(Multiplex PCR)和简化微卫星-PCR方法(Simplified Microsatellite-PCR, SMP)。

这些方法通过引入多个引物或优化反应体系,提高了微卫星位点的扩增效率和选择性,并减少了操作的复杂性。

此外,通过引入荧光标记和电泳分离等技术,可以实现高通量的微卫星位点分型。

除了上述方法外,近年来还涌现了一些新的位点获取技术,如基于DNA芯片(DNA microarray)的方法和全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study, GWAS)。

奥利亚罗非鱼微卫星位点的筛选

奥利亚罗非鱼微卫星位点的筛选

e n O. u e s n l d n d O. u e s d o a r u ,i c u i g Re a r u ,0. u e s 0 ) a r u ( 2 ,0. u e s 8 )a l a n l tc s a r u ( 3 s we l s O. io i u . Th e u t h we h t 3 a r f p i r ( 2 5 ) we e a p iid s c e s u l ,o ih 3 e r s ls s o d t a 7 p is o rme s 9 . r m l e u c s f l f y fwh c 2 p is ( 0 )d s l y d p l mo p im .Th rme ar 8 ipa e oy r h s e p i rUN H 1 8 s o d s r n s o i t n wih s x 6 h we t o g a s ca i t e . o
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中国地鼠微卫星DNA引物的设计及筛选

中国地鼠微卫星DNA引物的设计及筛选

中国地鼠微卫星DNA引物的设计及筛选宋国华;耿佳宁;贾若愚;岳文斌;刘田福;胡松年【摘要】本研究旨在筛选中国地鼠微卫星位点,为中国地鼠遗传分析提供遗传标记.根据建立的中国地鼠微卫星富集文库,对筛选的含微卫星DNA序列的克隆应用引物设计软件Primer 3.0设计引物135对,选择合成11对理论上易出现影子带的引物,用20个中国地鼠个体对这些引物进行了评估.结果显示,11对引物均能扩增出谱带,这11条带的平均多态信息含量(PIC)为0.4195,平均观察杂合度(Ho)为0.3895,平均期望杂合度(He)为0.4565,每个位点的平均等位基因数为5.818.筛选出的微卫星位点均可用于中国地鼠种群遗传结构分析,这将为中国地鼠品种选育、种系评估提供更多的微卫星遗传标记信息.%The objectives of the present study were to screen new microsatellite loci in Chinese hamster to develop genetic markers for genetic analysis. A library of partial small size fractionated genomic DNA was constructed with the Chinese hamster. 135 pairs of primers were designed with the software Primer 3. 0 for rnicrosatellites positive clones obtained. 11 pairs primers that the stutter bands easily in theory were synthesized and 20 samples were tested with them. The results showed 10 of the 11 loci were found to be polymorphic,and PIC, the mean observed heterozygosities (Ho) , the mean expected heterozy-gosities( He) were 0. 4195, 0. 3895 and 0. 4565, respectively. The microsatellite markers would be useful for further studying on accessions identification and breeding of Chinese hamster,which would provide some evaluable tools for marker-assisted selection breeding and gene mapping in Chinese hamster.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)012【总页数】5页(P128-132)【关键词】中国地鼠;微卫星;基因组文库【作者】宋国华;耿佳宁;贾若愚;岳文斌;刘田福;胡松年【作者单位】山西医科大学实验动物中心,山西太原030001;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801;中国科学院北京基因组研究所,北京 100029;中国科学院北京基因组研究所,北京 100029;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801;山西医科大学实验动物中心,山西太原030001;中国科学院北京基因组研究所,北京100029【正文语种】中文【中图分类】S813.3微卫星DNA,又称为简单序列重复(SSR)或短串联重复序列(STR),广泛存在于真核生物基因组中,每个简单重复DNA片段中一般重复单位仅1~6个碱基,重复次数为10~20次,动物体中最为常见的重复单位是双核苷酸(CA/GT)n。

微卫星用来亲子鉴定的原理

微卫星用来亲子鉴定的原理

微卫星用来亲子鉴定的原理微卫星是一种短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点,由于其在基因组中具有多态性,因此被广泛应用于亲子鉴定领域。

亲子鉴定是通过比较目标个体与亲缘关系标本(通常是可能的亲生父母)的微卫星位点进行相似度分析,从而确定两者之间的关系。

微卫星的原理主要包括微卫星的检测和分析两个方面。

微卫星的检测是亲子鉴定的第一步,其方法主要有聚合酶链反应(PCR)和毛细管电泳。

首先,需要设计引物对微卫星位点进行PCR扩增。

引物是一对短的DNA片段,与目标微卫星序列的上下游区域互补。

在PCR反应中,引物与DNA模板结合,DNA聚合酶在引物的指导下将DNA序列复制扩增。

通过多轮PCR循环,可使微卫星序列的数量显著增加。

其次,PCR产物需要经过毛细管电泳分析。

电泳是一种将分子在电场中迁移的方法。

在毛细管电泳中,PCR产物被注入至玻璃毛细管中,并在电场的作用下在毛细管内迁移。

由于微卫星序列的长度不同,不同长度的PCR产物在电场下具有不同的迁移速度,从而形成一系列不同长度的峰。

通过检测这些峰的数量和大小,可以确定目标个体所携带的微卫星位点的等位基因型。

微卫星的分析是亲子鉴定的关键步骤,通过比较目标个体与亲缘关系标本的微卫星位点等位基因型来确定两者之间的关系。

在分析中,主要包括等位基因型的比较和计算相似度。

等位基因型的比较是通过将目标个体的等位基因型与亲缘关系参照样本的等位基因型进行比较来进行的。

亲缘关系参照样本通常是可能的亲生父母,他们的等位基因型通常已经确定。

通过比较,可以确定目标个体所携带的等位基因型是从哪一位亲缘关系参照样本中遗传的。

计算相似度是通过比较目标个体与亲缘关系参照样本在微卫星位点等位基因型上的一致性来进行的。

相似度通常通过比较两者等位基因型的共同位点来估计,共同位点的数量越多,相似度越高。

通过比较多个微卫星位点的相似度,可以得出最终的亲子鉴定结果。

总结来说,微卫星亲子鉴定的原理是通过PCR扩增和毛细管电泳分析目标个体与亲缘关系参照样本的微卫星位点等位基因型,并通过等位基因型的比较和相似度的计算来确定两者之间的关系。

微卫星标记简述

微卫星标记简述

微卫星标记的简述微卫星标记(microsatellite),又称为短串联重复序列(simple tandem repeats, STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats),是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列,由2~6个核苷酸的串联重复片段构成,由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富,因此微卫星标记的应用非常广泛。

微卫星位点通常通过PCR扩增,扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。

PCR扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测,如荧光标记、银染。

微卫星存在于大多数生物的基因组中,被广泛的应用于遗传杂交育种和绘制染色体遗传图谱等领域。

高度多态的微卫星还可以用来在人群进行个体识别。

实验步骤1. 客户收集标本(血液或组织等标本)并提取DNA。

2. 设计引物序列并扩增,琼脂糖电泳检测结果。

3. 合成荧光标记引物。

4. 进行PCR扩增,产物通过测序仪器电泳检测, 获得扩增片段大小。

5. 分析测序仪器读出的数据,给结果图谱。

微卫星DNA 也称简单串联重复序列( Simple Sequence Repeats,简称SSRs)或简单串联重复序列多态性(Short Tandem Repeat Polymorphism,简称STRP)。

微卫星DNA 是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分,主要由串联重复单元组成,每单元长度在1-10bp 之间,1 个SSR 的总长度可达几十到几百个bp。

每个微卫星DNA 都由核心序列和侧翼序列组成,其核心序列呈串联重复排列。

侧翼DNA 序列位于核心序列的两端,为保守的特异单拷贝序列,能使微卫星特异地定位于染色体常染色质区的特定部位。

Weber 将微卫星分为3 类:单纯(pure) SSR、复合(compound) SSR,和间隔(interrupted) SSR。

所谓单纯SSR 是指由单一的重复单元所组成的序列,如(AT) n;复合SSR 则是由2 个或多个重复单元组成的序列,如(GT)n(AT)m;间隔SSR 在重复序列中有其它核苷酸夹杂其中,如(GT)nGG(GT)m。

生物大数据分析中的遗传多态性检测方法与技巧

生物大数据分析中的遗传多态性检测方法与技巧

生物大数据分析中的遗传多态性检测方法与技巧遗传多态性是生物学研究中非常重要的一个概念,它指的是个体或群体基因组中存在的多个变异形式或等位基因。

遗传多态性不仅与个体间的差异有关,还与个体在适应环境和抵抗疾病方面的差异密切相关。

因此,在生物大数据分析中,准确检测和分析遗传多态性至关重要。

本文将介绍一些常用的遗传多态性检测方法与技巧。

1. 单核苷酸多态性(SNP)的检测方法:SNP是最为常见的遗传多态性形式之一,它是DNA中单个核苷酸(A、T、C或G)的变异。

SNP的检测可通过基于测序技术的方法,如Sanger测序、测序用探针芯片和下一代测序技术等。

这些方法可以快速、准确地检测出SNP位点上的碱基变异情况。

此外,还可以利用聚合酶链式反应(PCR)结合限制性内切酶(RFLP)方法,通过分析产生的DNA片段长度差异来检测SNP位点。

2. 微卫星序列的分析方法:微卫星序列是在基因组中广泛分布的、重复的DNA序列,由于个体间的插入、缺失或重复次数的差异,微卫星序列具有高度多态性。

检测微卫星序列的多态性可以通过PCR扩增方法,使用特异性引物扩增目标微卫星位点,然后通过电泳检测扩增片段的长度差异。

此外,还可以利用基于测序的方法来检测微卫星序列的变异情况。

3. 多态性标记的选择与筛选:在生物大数据分析中,选择适当的多态性标记对于准确检测遗传多样性至关重要。

一种常用的多态性标记是限制性片段长度多态性(RFLP),其基本原理是利用限制性内切酶切割DNA产生的不同长度的片段。

此外,还有单序列重复多态性(SSR)和随机扩增多态性(RAPD)等多态性标记可以选择。

在筛选多态性标记时,通常考虑标记的多态性、位点的连锁关系、扩增效果等因素。

4. 基于群体遗传学的分析方法:群体遗传学是研究个体在群体中遗传结构和动态变化的学科。

在生物大数据分析中,利用群体遗传学的方法可以检测遗传多样性和演化过程。

例如,可以通过计算群体间的遗传距离和群体结构来判断不同种群间的基因流程度。

微卫星方法简介

微卫星方法简介

微卫星方法简介关键词微卫星分子生态应用80年代以来,分子生物学技术与方法已成为进化生物学、保护遗传学、生态学等诸多领域非常重要和崭新的研究工具。

而摆在人们面前可供选择的分子生物学方法又有许多种,如同工酶(allozymes)、限制性片断长度多态性(Ristriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、多位点或单位点小卫星(Multi-locus or Single-locus Minisatellites)以及随机扩增多态DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD)。

其中每种方法都具有自己明显的不足之处,比如:同工酶标记物由于位点多态性低、变异低而不能很好地被用来估计群体内部个体之间的亲缘关系,这在研究濒危物种时显得尤为突出;小卫星探针由于其片断长而难以获得;RAPD方法稳定性和重复性较差。

目前,随着人们对微卫星(Microsatellites)方法认识的不断深入,这一技术和手段越来越为研究者们所青睐。

微卫星(又名简单序列)是由串联重复序列组成,每单元长度在1~10bp之间,如(TG)n或(AAT)n[1~3],广泛分布于真核基因组中[4],因重复单元数目不同而呈现高度多态性[5]。

1 微卫星的产生历程生物学家在20世纪70年代就已经知道真核基因组中存在着短串联重复位点,但直至1982年Hamada等[6]发现从酵母到脊椎动物中的多拷贝多聚(dT-dG)时,这些序列的数目之大和存在之广泛才显现出来。

这一发现后来被Tautz和Renz[7]所证实:他们用不同微卫星序列与不同有机体中的基因组DNA杂交,发现存在着许多类型的简单序列。

1985年,Jeffreys等[8]发现了人基因组中有更长重复单元的超变串联重复序列,即小卫星DNA(Mini-satellite)。

与微卫星一样,小卫星的串联重复单位的数目也显示出可变性,因此二者被统称为可变数目串联重复位点(Variable Number of Tandem RapeatsVNTRs)[2]。

三疣梭子蟹微卫星标记的筛选及特征分析

三疣梭子蟹微卫星标记的筛选及特征分析
微卫星位点 , 分布于 2 0 条 序列 中 , 其中 1 9条序列检测到 2个或 2个以上微卫 星位点 。对所有筛选 到的微卫星位点进行分类 统计后表明 , 核心序列为( C T / A G ) 的有 2 7个( 5 O %1 , 2 7个位点为其他类 型的重复 。结果表 明三疣梭子蟹 C T / A G微卫星标记在
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水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用

水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用

水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用一、本文概述随着现代生物技术的飞速发展,微卫星标记技术(Microsatellite Markers)已成为水生生物学研究中不可或缺的工具。

本文旨在全面综述水产生物微卫星标记技术的最新研究进展,包括其在水生生物遗传多样性分析、种群遗传结构解析、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、基因定位以及辅助育种等多个领域的应用。

本文还将探讨微卫星标记技术在未来水产生物学研究中的发展趋势和潜在挑战。

我们将对微卫星标记技术的基本原理和特点进行简要介绍,以便读者对该技术有一个清晰的认识。

随后,我们将重点回顾近年来微卫星标记技术在各类水产生物(如鱼类、甲壳类、贝类等)中的研究应用,以及所取得的重要成果。

在此基础上,我们将分析当前研究中存在的问题和不足,并对未来发展方向进行展望。

通过本文的阐述,我们期望能为从事水产生物学研究的学者和技术人员提供有益的参考和启示,推动微卫星标记技术在水产生物学领域的应用和发展。

二、微卫星标记技术的基本原理和方法微卫星标记技术,也称为简单序列重复(Simple Sequence Repeats, SSRs)或短串联重复(Short Tandem Repeats, STRs),是一种基于DNA序列多态性的分子标记技术。

其基本原理是利用生物基因组中广泛存在的微卫星DNA序列,这些序列由1-6个碱基组成的重复单元串联而成,重复次数在不同个体或品种间存在差异,从而表现出多态性。

微卫星位点的筛选和引物设计:通过生物信息学方法,从已知的基因组序列中筛选出微卫星位点,然后利用这些位点的序列信息设计特异性引物。

PCR扩增:以基因组DNA为模板,利用设计的特异性引物进行PCR 扩增,扩增产物即为包含微卫星序列的DNA片段。

电泳检测和数据分析:将PCR产物进行凝胶电泳,根据DNA片段的大小差异进行分离,然后通过凝胶成像系统观察并记录结果。

通过对电泳图谱的分析,可以计算出微卫星序列的重复次数,从而得到不同个体或品种间的多态性信息。

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论文综述微卫星分子标记筛选方法综述摘要:微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。

它作为一种重要的分子遗传标记,能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化,被广泛应用于实验动物的研究。

本文概述了获得和富集微卫星位点的常用方法。

最简便、最省时的方法是从从公共数据库(如Genbank、EMBL、EST数据库等)或已发表的文献中查找到微卫星位点,但只限于已经有序列数据发布的物种;第二种方法是种间转移扩增,即从相近物种的数据库中查找微卫星位点,或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。

第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点,其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及分子标记技术法。

关键词:微卫星;分子标记;实验动物微卫星(Microsatellite),又称为简单序列重复(Simple Sequence Repeat , SSR),短串联重复(Short Tandem Repeat STR),是以少数几个核苷酸(一般1~6个)为重复单位的串联重复DNA序列。

微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中[1],在植物基因组中平均每33 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点,而在哺乳动物中每6 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点[2]。

并且SSR的重复次数不同和重复程度不同,使其呈现高度的多态性。

微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因,区分二倍体(或多倍体)的纯合体或杂合体,这是AFLP、RAPD 等显性标记所无法做到的。

另外,微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性,方便各实验室间的交流。

目前,微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。

随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。

但微卫星分析中引物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星位点的难度和花费。

微卫星标记分离最大的困难是引物的获得。

同RAPD、AFLP 等遗传标记不同,微卫星研究首先需要获知位点的序列信息,以便从重复序列两端侧翼的保守序列中设计引物。

因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。

目前已知微卫星位点的物种很有限,这是因为微卫星位点的获得需经过克隆、杂交筛选、测序等步骤,因此需花费一定的人力、金钱,这限制了微卫星标记的大量使用。

但近年来发展起来的各种微卫星位点富集技术已在一定程度上解决了这个问题。

已有的最常用的获得微卫星位点的方法包括:1.从公共数据库中查找微卫星位点;2.遗传距离相近物种间引物转移扩增;3.从基因组DNA中筛选微卫星位点。

其中,最方便、最经济的方法就是从已发表的文献中获得微卫星引物,但该法在使用对象上,只限于已有引物开发出的物种,而且引物的数量不会有所增加,只能停留在原有基础上。

对于近缘种引物的应用,其适用范围究竟有多大;原物种的微卫星基因座在其他物种间转移扩增时,其多态性如何。

这些问题使得在不同物种间共用微卫星引物时,盲目性较大,可指导操作的理论依据不足。

最好的途径就是从基因组DNA中筛选微卫星位点并进行引物的开发。

1 从数据库中查找微卫星位点在上述三种方法中,最简便最省时的就是从公共数据库或已发表的文献中查找到微卫星位点。

许多微卫星研究的出发点都是公共数据库,比如从EMBL、Genbank或EST数据库中查找微卫星位点。

从这些数据库中,可通过电子查询方式方便地获得所需要的序列或寻找已存在的微卫星引物。

研究者对大量序列进行处理,利用Clustal W等程序,根据相似性程度,剔除冗余的EST,再剔除过短的序列(小于100bp)和过长的序列(大于1000bp),再利用SSRHunter等软件搜索获得含有微卫星的序列,并根据其侧翼序列设计引物。

何蔚[3]等选用前人分离得到的42对大熊猫微卫星引物,分别用圈养大熊猫的血液DNA和野生大熊猫的粪便DNA对其进行PCR扩增,结果表明不同标记的多态性差异较大,并筛选出13对能较好地应用于大熊猫遗传多样性研究的微卫星引物。

匡刚桥[4]等利用生物信息学方法从公开发表的鳜鱼GenBank数据库中寻找多态信息含量丰富的微卫星位点中共搜索到304条鳜鱼核酸序列,经计算机筛选和人工选择, 最终获得22 条含微卫星重复单元的序列,利用SSRHunter软件在此22条含有微卫星的序列中发现30个微卫星位点,设计出17对引物,其余位点两端序列短无法设计引物。

其中13对引物扩增条带清晰,经过多态性分析,最终筛选获得6对多态性微卫星引物。

徐玲玲[5]等从资料和GenBank中选取扩增效果好、等位基因多、均匀分布于小型猪18条常染色体和X染色体上的100个微卫星位点合成引物,对封闭群小型猪基因组进行PCR扩增及条件优化,筛选出32个分布于不同染色体且等位基因多的微卫星位点。

近年来随着数据库中EST序列的增加,通过数据库搜寻法获得EST微卫星位点的报道越来越多。

在此基础上进行SSR引物开发也就成了一种既经济又有效的方法。

许新[6]等从杂色鲍cDNA文库中用SSRHunter软件搜索获得173个重复序列,从中设计93对引物,有78对可以扩增,占合成总引物的83.9%,用深圳、汕尾等3个群体中挑选出多态性引物19对,多态性微卫星比例24.36%。

石耀华[7]等从马氏珠母贝cDNA文库查找到了268个重复序列,含微卫星的EST数占EST总数的3.48%,设计151对微卫星引物,有130对可以扩增,占合成引物总数的86.09%,其中多态性引物45对,占微卫星总数的34.6%。

EST微卫星位于编码区,由于基因序列的保守性,EST微卫星序列比从基因组中筛选的微卫星多态性低。

Eujayl[8]比较了小麦EST的微卫星和基因组微卫星多态性,结果发现基因组微卫星多态性(53%)远高于EST微卫星(25%)。

从数据库中查找微卫星最大的缺点是只限于已经有序列数据发布的物种。

一个替代方法是从相近的物种数据库中查找微卫星位点,或使用已发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。

2 近缘物种交叉扩增获得微卫星引物由于微卫星重复序列和包含引物位点的侧翼序列在物种间具有保守性,所以某一个物种的微卫星引物可以在其相近的物种中使用,用来检测相近物种同源位点的多态性。

这样就大大地减少了检测微卫星位点的工作量。

微卫星在近缘种之间的通用性已有研究,但在属间应用还不多。

根据M. Rossetto[9]对近年来发表文献的总结,微卫星位点可在物种间扩增,其多态性也相当高。

Zucoloto[10]等利用密西西比鳄和宽吻凯门鳄的微卫星在其他3种鳄鱼中进行扩增,扩增率均在85%以上。

Küpper[11]等使用的环颈鸻微卫星成功地在4种鸻科鸟类中获得扩增,平均扩增率为75%。

蔡清秀[12]等从从非洲象31个微卫星位点和5个已知亚洲象微卫星位点中筛选出14个勐养亚洲象的微卫星位点,其中9个多态位点能在185份粪便样品DNA中稳定扩增。

孙涛[13]等利用138条人类微卫星引物在黑叶猴中进行筛选,得到了23个具有多态性的微卫星位点。

其中有7个位点偏离Hardy-Weinberg 平衡,9个位点存在无效等位基因现象,但是各位点之间均未检测到连锁不平衡现象,这些位点将在黑叶猴种群遗传结构的研究中发挥重要作用。

洪艳云[14]等选用10对非洲糜羚微卫星引物和10对绵羊微卫星引物作为筛选普氏原羚基因组DNA微卫星位点的引物,结果发现20对引物中有8对引物在普氏原羚基因组DNA中扩增出了多态性位点。

谭元卿[15]等利用小鼠微卫星位点引物536对,对长爪沙鼠基因组DNA扩增出了313个阳性条带,经测序分析确定130个长爪沙鼠的微卫星位点,与小鼠同源性为24.3%。

引物跨物种共用的有效程度除与其亲缘关系的远近有关外。

Primmer[16]等对大量鸟类微卫星交叉扩增研究的数据进行总结后提出,交叉扩增中微卫星在来源物种中的完全重复单元数目(perfect repeat units)与交叉扩增所获得的同源微卫星位点的多态性呈正相关。

微卫星位点的重复单元数目越多,其多态性也就越高,这表明微卫星位点的高重复单元数目在其近缘物种仍有所保持。

这意味着即使由于较远的亲缘关系使物种间交叉扩增率较低,具有较高重复单元数目的原始微卫星位点仍有可能获得有价值的扩增产物。

值得注意的是,仅从产物片断大小和变化上不是总能很好地确定微卫星的存在,通过改变扩增条件用微卫星引物在物种间扩增得到产物后,仍需要通过杂交、测序等方法确定所扩增出的条带就是所期望的产物。

3 从基因组DNA中筛选微卫星位点对于无法从上面两种方法获得微卫星引物的物种,可以从基因组DNA中筛选微卫星位点。

绝大多数微卫星位点是从100-1000 bp的小插入片段基因组文库中通过寡核苷酸探针杂交获得的。

标准的分离微卫星位点的方法有如下步骤:①提取基因组DNA;②用限制性内切酶将基因组DNA切割成小片段;③凝胶电泳,回收大小100-1000 bp的片段;④将回收片段克隆,使用标记探针进行杂交;⑤筛选出含有重复序列的克隆;⑥测序证实重复序列片段的存在;⑦根据重复序列片段两端保守序列设计引物,进行PCR扩增,检验引物的有效性;⑧对小量样本进行预试验,挑选出重复性好,具多态性的微卫星位点。

按以上步骤,Srikwan[17]和Munshi-South[18]利用尼龙膜菌落原位杂交法分离出6个泰国树鼩(Tupaia glis)和5个马来西亚树鼩(Tupaia spp.)的微卫星位点。

魏东旺[19]等从鲤鱼基因组DNA中筛选微卫星位点,用探针(CA)n 对质粒pGEM-3Zf(+)构建的基因文库进行杂交筛选,从2000个白色菌落中共获得阳性克隆45个,其中32 个克隆中共得到22个微卫星。

从基因组文库中分离微卫星位点的传统方法在微卫星富集程度上效率很低,为了提高微卫星位点分离的效率,在文库构建前或构建后发展了一些富集方法。

3.1 杂交法富集微卫星杂交富集法根据所使用的介质不同可分为三种:磁珠法、尼龙膜法和亲和素超滤离心法。

3.1.1 磁珠富集法磁珠富集法的基本原理是用生物素标记重复序列寡核酸探针并与基因组DNA酶切片段杂交,再利用生物素与亲和性强的特性,使两者相互作用的稳定性和强度即使在变性、杂交、洗脱等操作过程中也不产生分离,从而完成对重复序列目标片段的富集,建立微卫星富集文库。

经过磁珠富集后使获得的具有重复序列片段的效率大幅度提高。

目前,链亲和素包埋的磁珠已被广泛应用到各种微卫星富集方法中。

磁珠杂交的微卫星富集过程是在文库构建前,一般步骤如下:限制性内切酶酶切基因组DNA,酶切后的DNA片段≤1000 bp;接头连接酶切DNA片段;酶切位点和接头作为引物结合位点,进行扩增,增加DNA片段量;生物素标记的互补微卫星寡核酸探针同PCR扩增产物杂交;链霉素包埋的磁珠杂交筛选目的片段;目的片段洗脱、扩增、纯化、克隆;阳性克隆进行DNA测序,设计引物进行PCR 分析;多态性鉴定。

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