辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用说明
GoatAnti-RabbitFcspecificIgG产品使用说明书
Goat Anti-Rabbit (Fc specific)IgG产品使用说明书
技术背景： NanoGen TM提供的多克隆抗体主要来自于宿主动物（BALB/c小鼠、家兔、山羊）抗血清、鸡卵黄等，单克隆抗体主要来自于小鼠杂交瘤克隆株。
本产品为以兔IgG Fc片段作为免疫原，制备山羊抗血清，经阴离子交换柱纯化，去除羊血清中其他非特异蛋白，特异识别兔IgG Fc片段的抗体，酶类如碱磷酶（AP）、辣根过氧化物酶（HRP）及其衍生物，荧光染料如荧光素（FITC）、罗丹明及其衍生物，TRITC，青色素（Cy3），藻红蛋白（R-PE）标记后，可用于科学研究。
与鼠IgG、山羊IgG和人IgG 无交叉反应。
二抗克隆性：多克隆
二抗免疫原：兔IgG Fc片段
二抗宿主动物：山羊
应用：免疫组化、免疫荧光、蛋白印记、细胞相关分析实验、流式细胞术。
产品推荐使用浓度：Western blotting/1:5000-1:10000
Enzyme immunoassays/1:1000-1:5000
具体实验过程中，应根据不同的使用用途选择IgG最适工作浓度。
保存说明：自生产之日起，-20℃可保存1年，经常使用可置4℃；为了更好保存、使用试剂，使用前后请适当离心（盖帽）；禁止反复冻溶。
备注：本产品仅用于科研，不能用于人体实验或人体治疗。
HRP标记二抗
二抗：山羊抗小鼠（HRP标记）山羊抗小鼠说明本二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L))，用于Western、ELISA和IHC等的二抗。
HRP，即horseradish peroxidase，中文名为辣根过氧化物酶，可以在Western检测时催化ECL 类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光，可以在ELISA时催化TMB产生蓝色，也可以在IHC 或Western blot检测时催化DAB产生棕色沉淀。
本辣根过氧化物酶标记山的羊抗小鼠IgG(H+L)用于WB、ELISA和IHC的推荐稀释比例参考上表，实际实验操作过程中需根据抗原和抗体的具体情况适当调节二抗的稀释比例。
对于WB，推荐的稀释范围为1:500-2000。
本二抗为用纯化的小鼠IgG免疫山羊，然后用亲和纯化柱对获得的抗血清进行纯化，并经过人IgG吸附纯化的优质山羊抗小鼠二抗。
对人IgG几乎没有结合能力。
·二抗用途本山羊抗小鼠二抗如果用于常规的Western检测，以每次检测需5毫升1:1000稀释的二抗计，至少可以检测20次。
·使用方法Western、ELISA或IHC请参考相关实验步骤进行。
起始稀释浓度按照产品简介中推荐的稀释比例进行稀释。
叠氮钠会抑制辣根过氧化物酶的活性，在含有辣根过氧化物酶的二抗中不可加入叠氮钠。
·使用建议稀释比：ELISA，1:200；Western blot，1:1000；Immunohistochemistry，1：50.稀释后的一抗，回收后可重复使用，回收后的稀释一抗可在4°C短期保存。
·保存条件本山羊抗小鼠二抗4°C保存，一年有效。
·其他说明详细内容请参考说明书。
过氧化物酶标记亲和素使用说明
过氧化物酶标记亲和素使用说明
HRP-Avidin
货号：SE065
规格：0.1ml
保存：-20℃保存至少一年，避免反复冻融。
2-8℃可保存3-6个月。
产品说明：
HRP标记亲和素是采用进口亲和素和高活性过氧化物酶HRP，用改良过的碘酸钠氧化法制成复合物，可广泛用于免疫病理、酶联免疫测定、基因探针及其他学科的放大检测系统。
过氧化物酶标记亲和素每毫升含有 1.5-2mg的Avidin和HRP，3mgBSA。
工作效价：
ELISA法：1：500～1000
组织化学：1：30～100
免疫印迹：1：200～500。
斑点免疫：1：200～500。
具体效价以产品标签为准，最佳使用条件需根据所检测样本的抗原及一抗效价优化而定。
相关产品：
SP034兔IgG免疫球蛋白抗原
SPA131羊抗小鼠IgG(纯化)
SA134羊抗兔IgG(免疫血清)
SF134羊抗兔IgG-FITC
SE237兔抗猪IgG-HRP
A1800抗体稀释液。
分子实验--Western Blotting检测人IgG
Western Blotting检测人IgG作者兰州大学生命学院生物学基地班摘要本实验采用人血清为材料，对此样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，在过氧化物酶底物存在的情况下，检测人的IgG。
关键词Western Blotting 抗体电泳前言Western Blotting是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质为抗原，与对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异目的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测目的蛋白质的表达水平。
正文一、实验试剂，器材和材料的准备试剂（1）药品：丙烯酰胺N,N'—甲叉双丙烯酰胺，四甲基乙二胺，过硫酸铵，三羟甲基氨基甲烷（Tris），甘氨酸，琼脂，蔗糖，溴酚蓝，十二烷基硫酸钠，甲醇，甘油，巯基乙醇，考马斯亮蓝R-250标准分子量蛋白，冰乙醇，兔抗人IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，脱脂奶粉，HCL，NaCL，过氧化氢，CoCl2.（2）电极缓冲液：甘氨酸28.2g，SDS1g，Tris6g,加水至1000ml，ph8.3.用时稀释一倍。
（3）转移缓冲液：25mmol/lTris,192mmol/l甘氨酸，20%甲醇，ph8.3 （4）TBS缓冲液：20mmol/LTris-HCl,500mmol/LNaCl,ph7.5（5）TTBS:取100mlTBS,加50ul Tween-20（6）封闭液及抗体稀释液：3%脱脂奶粉-TBS（7）底物溶液： 2.5mg二氨基联苯胺+9mlTBS+1ml0.3%CoCl2+10ulH2O2,临用前配置。
（8）30%丙烯酰胺贮备液:29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。
纯化抗体IgG使用说明
纯化抗体IgG使用说明
Purification Antibody
规格：1mg/5mg/10mg
保存-20℃保存，有效期一年以上
产品说明:
纯化抗体IgG采用Protein A/G亲和层析纯化，制成高纯度（﹥95%）和高活性的纯化羊或兔IgG抗体。
纯化抗体IgG为PBS溶液，可根据用户要求，配成不同浓度，用前最好-20℃存放，可根据使用方法采用不同浓度稀释。
通常不同使用目的可分别用下列缓冲液稀释，注意完全溶解后充分混匀。
冻存过久会产生少量聚合体，用前最好低温高速离心，去除冷聚合球蛋白及变性蛋白后重新定量。
抗体标记：500ug～20mg/ml，ELISA包板：10～20ug/ml，层析金条对照线：2mg/ml等。
胶体金标记：用pH9.0硼酸缓冲液稀释。
HRP标记：用0.01mol/L pH9.0CB或用包被液CB稀释。
荧光素标记：用0.5mol/L pH9.5CB（碳酸盐缓冲液）稀释。
生物素标记：用0.1mol/L NaHCO3稀释。
其它方法：如免疫扩散可用0.01mol/L pH7.2PBS稀释。
浓度：
一般情况10mg/ml，具体信息见标签。
相关试剂：
SP034兔IgG免疫球蛋白抗原
SA134羊抗兔IgG(免疫血清)
SF134羊抗兔IgG-FITC
SE237兔抗猪IgG-HRP
A1820HRP标记的抗体稀释液。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
间接法Elisa
间接法ELISA SOP一、包被1．抗原包被量为20µg/板。
2．例如：抗原浓度为0.8mg/ml。
3．取25µl抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100µl/孔。
4．包被完毕后，4℃过夜。
二、封闭1．从4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。
2．加封闭液，200µl/孔。
3．37℃孵育2h。
4．甩干，洗板（3次）。
5．用干燥的自封袋4℃保存。
【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200µl -300µl洗板液，静置2min，甩出，将板拍在干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。
三、一抗1．可洗板一次。
2．阳性对照：1µl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1：1000稀释（第一孔）。
3．阴性对照：做1：2万稀释。
用1µl阴性血清加入100µl抗原稀释液中，先做1：100稀释。
再从此液取出5µl加入995µl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。
4．空白对照：只加抗原稀释液。
5．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100µl抗原稀释液。
6．第一孔加100µl（1：1000）的阳性对照。
7．第二孔加100µl（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100µl加到3号孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。
1：10001：20001：40001：80001：160001：32000阴性对照（1：2万）空白对照8．将酶标板37℃孵育1h，洗板3次。
【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数(一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易)。
②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。
③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。
四、二抗本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1．用0.01MPBS做1：5000稀释（现用现配）。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
酶联免疫吸附剂测定ELISA实验报告及实验讨论
ELISA实验报告一、实验名称酶联免疫吸附测定二、实验原理在抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物中加入相应酶的底物，反应生成有色产物，然后借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。
待测抗体的定量与有色产生成正比。
三、实验材料与试剂1.抗原Human IgG (0.025mg/ul),一抗Rabbit-α-human IgG,二抗辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。
2.包被液，PBS溶液，封闭液，Tween-20 0.5mL蒸馏水稀释至100mL，邻苯二胺溶液，中止液。
3.聚苯乙烯微量细胞培养板，酶联免疫检测仪，取液器，烧杯，稀释用带凹槽的平板。
四、实验步骤1.将用包被液稀释好的Human IgG加入到培养板以B2至D10为对角线的矩形区域中，200ul/well，B11 C11 D11处不加抗原作为对照，然后在37℃下温育30分钟。
2.取出平板，倒尽液体，然后向B2至D11的矩形区域每个孔中加入200ul的PBS 洗涤液，然后倒掉，如此洗涤3次。
再将平板倒置在吸水纸上，使孔中液体流尽。
3.在B2到D10的矩形区域每个孔中加入0.5﹪的BSA溶液200ul，然后在37℃条件下温育30分钟。
4.Washing with PBS 200ul/well for three times。
具体步骤同步骤2。
5.将first antibody Rabbit-α-human IgG稀释成不同的浓度梯度，200ul/well 按下表加入到平板中。
其中B10 C10 D10不加一抗作为对照，然后incubate at7.在B2到D11的矩形区域中加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，每孔200ul，在37℃下温育30分钟。
8. Washing with PBS 200ul/well for three times。
具体步骤同步骤2。
9.向平板B2到D11的矩形区域中加入底物邻苯二胺溶液200ul/well。
10. 向平板B2到D11的矩形区域中加入终止液，每孔50ul。
试验方法
3 4 1 1 牛血清白蛋白残留量测定法试验目的:测定牛血清白蛋白残留量实验原理:1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
本法系采用酶联免疫法测定供试品中残余牛血清白蛋白(BSA)含量。
实验步骤：供试品溶液的制备供试品如为冻干剂型，检测前应按标示量复溶后混勻，室温静置30分钟,检测前应再次混匀。
供试品如为液体剂型可直接用于检测。
干扰试验首次采用该法检测的供试品应进行干扰试验。
制备溶液I(供试品倍比稀释）、溶液 II (供试品和30ng/m l的内控标准品等量混合）和溶液 DI(30ng/ml的内控标准品倍比稀释）。
当供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定范围中点时，则 2 倍稀释后制备溶液 I 和溶液 II。
溶液 I 、溶液 II 可倍比稀释测定，溶液 E 应多孔测定（至少 10 孔以上），并在试验间均匀添加。
按测定法操作，分别测定溶液I 、溶液 n 、溶液 in 的 b s a 含量，溶液 I 与溶液 n 的含量之差应在溶液El含量测定值的 95%可信区间内，表明供试品不会对该检测法产生干扰作用。
登革热检测方法
附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体 试验材料： （1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存； （2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）； （3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体； （4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等； （5）荧光显微镜。
检测步骤： （1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断： 细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。
根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义： 阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义； 恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测单份和/或双份血清IgG抗体 试验材料： （1）抗原： 阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体； （3）缓冲液： 包被液：pH9.6碳酸缓冲液； 稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶） 洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）； （4）显色液：A/B液 （5）终止液：4NH2SO4 （6）酶标板、酶标仪。
免疫显色试剂说明书
免疫显色试剂说明书【产品名称】免疫显色试剂【包装规格】【预期用途】在免疫组化反应或原位杂交反应中与首要抗原抗体结合，通过染色，将靶点进行标记。
【检测原理】免疫显色试剂是二步法免疫组化试剂盒，适合与兔或鼠源一抗配用。
其主要过程为，一抗与切片中的靶抗原形成抗原抗体复合物，酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物与抗原抗体复合物中的一抗结合，再利用辣根过氧化物酶催化二氨基联苯胺（DAB）在抗原部位形成棕色显色。
由于该系统不含生物素和链亲和素，所以不受内源性生物素干扰，染色背景非常清晰。
【主要组成成分】其他需要但未提供的材料：PBST缓冲液（pH7.2-7.4）、纯化水、酒精、脱蜡液、苏木素染色液、中性树胶、塑料湿盒、染色缸、染色架等。
【储存条件及有效期】储存条件：2-8℃，有效期18个月。
请在开瓶3个月内使用。
生产日期、有效期至：见标签。
【样本要求】常规经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。
【检测方法】常规脱蜡水化：石蜡切片经常规脱蜡和水化。
抗原热修复：参照一抗说明书进行抗原修复。
DAB工作液的配制：按每毫升DAB缓冲液（试剂D）中加入50μL DAB色原（试剂C）（约1滴）的比例配制DAB工作液，DAB工作液应现配现用。
配制好的DAB 工作液需在2小时内使用，如出现沉淀，使用前先混匀。
操作步骤：1）抗原修复完毕后自然冷却的切片，用自来水清洗。
2）除去切片上组织周围的液体，用免疫组化笔圈定玻片上的待测组织区域并放入PBST缓冲液中。
3）取出切片，除去PBST缓冲液，滴加内源性过氧化物酶阻断剂（试剂A）（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），于组织上孵育10分钟，用PBST清洗切片。
4）除去PBST缓冲液，滴加100μL左右一抗工作液（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），于组织上进行孵育（按照各自一抗说明书操作）。
一抗孵育完毕，用PBST清洗切片。
5）除去PBST缓冲液，每张切片加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（试剂B）100μL左右（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），室温下孵育30分钟。
直接抗人球蛋白试验原理
直接抗人球蛋白试验原理抗人球蛋白是直接抗人球蛋白试验中的重要试剂。
抗人球蛋白是由兔、羊等动物免疫人类IgG和/或IgM制备而成。
在制备过程中，先将兔、羊等动物注射人类IgG和/或IgM，使其产生抗体。
然后将动物的血清收集，离心去除血细胞和血浆，得到抗人球蛋白。
2. 直接抗人球蛋白试验的步骤（1）取被测血液样本。
在抗凝管中加入适量的抗凝剂（EDTA、肝素等），轻轻颠倒管子使其混匀。
（2）离心。
将抗凝管中的血液样本离心，离心后将上清液倒入离心管中。
（3）洗涤红细胞。
将离心管中的红细胞沉淀洗涤4-5次，去除血浆和细胞碎片。
（4）加入抗人球蛋白。
将抗人球蛋白加入洗涤后的红细胞中，使其与红细胞表面的抗体结合。
（5）离心。
将含有抗人球蛋白的红细胞离心，去除上清液。
（6）检测结合情况。
加入适量的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG抗体，使其与抗人球蛋白结合。
HRP标记的抗兔IgG抗体能与抗人球蛋白结合的红细胞表面的IgG和/或IgM结合，形成颜色反应。
（7）检测结果。
颜色反应的程度与红细胞表面的抗体和补体结合的程度成正比，可通过比较样品与对照的颜色反应程度来判断是否存在抗体和补体结合于红细胞表面。
3. 结果的解释直接抗人球蛋白试验结果可分为阳性和阴性两种。
阳性结果表示被测血液中存在抗体和/或补体结合于红细胞表面，可能是自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病等疾病的表现。
阴性结果表示被测血液中不存在抗体和/或补体结合于红细胞表面。
4. 注意事项（1）抗人球蛋白试验前应检查被测血液中是否存在抗凝剂，如存在应及时更换。
（2）洗涤红细胞时应注意避免过度洗涤，以免破坏红细胞膜。
（3）HRP标记的抗兔IgG抗体应保存在4℃以下，避免受热、受光、受冻等影响。
（4）进行抗人球蛋白试验时应严格遵守实验室安全操作规程，避免对人身安全造成威胁。
总之，直接抗人球蛋白试验是一种常用的检测血液中抗体和补体结合于红细胞表面的试验，可用于诊断自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病等疾病。
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（Goat Anti-rabbit IgG/HRP）规格：0.1ml/1ml抗体来源：Goat克隆类型：Polyclonal交叉反应：Rb产品应用：WB=1:1000-10000ELISA=1:1000-10000IHC-P=1:100-1000IHC-F=1:100-1000not yet tested in other applications.optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.分子量：150kDa性状：Lyophilized or Liquid浓度：2mg/1ml免疫原：Full length plasma protein亚型：IgG纯化方法：affinity purified by Protein A储存液：0.01M PBS,pH7.4with10mg/mL BSA and0.1%Gentamicin保存条件：Storage:Store at–20oC for one year.Avoid repeated freeze/thaw cycles.The lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater than a year when kept at-20oC.When reconstituted in sterile distilled water or diluent supplied, theantibody is stable for at least two weeks at2-4°C.产品介绍：Immunoglobulin G(IgG),is one of the most abundant proteins in serum with normal levels between 8-17mg/mL in adult blood.IgG is important for our defence against microorganisms and themolecules are produced by B lymphocytes as a part of our adaptive immune response.The IgG molecule has two separate functions;to bind to the pathogen that elicited the response and to recruit other cells and molecules to destroy the antigen.The variability of the IgG pool is generated by somatic recombination and the number of specificities in an individual at a given time point is estimated to be1011variants.Important Note:This product as supplied is intended for research use only,not for use in human,therapeutic or diagnostic applications.。
大熊猫IgG Fc HRP酶标二抗的制备
中,兽医科学 2021，51(01):53-58Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-10-14D01：10.16656/j.issn.l673-4696.2020.0208 中图分类号：S852.43 文献标志码：A文章编号：1673_4696(2021)01-0053-06大熊猫IgG Fc HRP酶标二抗的制备骆琢\王振斌\李明恒\王兴龙”，潘广林2*(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100;2.陕西省林业科学院珍稀野生动物救护基地，陕西周至710402)摘要：为获得辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗大熊猫IgG抗体，本研究利用重组大肠杆菌表达技术对 大熊猫IgG F c片段进行了表达，获得重组蛋白后进行了小鼠免疫，抗体特异性检测，并进行了多克隆抗体的 HRP标记。
结果显示，在37 °C、IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导5h的条件下，可获得分子质量约为88k u的目的蛋白；将重组蛋白免疫小鼠后，免疫小鼠血清与重组蛋白反应效价可达1 : 102 400以上，且与大熊猫血 清IgG反应良好，经HRP标记试剂盒标记的鼠抗大熊猫IgG效价可达1 :25 600以上。
上述结果表明，本研 究成功制备了 HRP标记的小鼠抗大熊猫IgG二抗，为大熊猫疾病血清学检测方法的开发提供了支撑。
关键词：大熊猫；IgG F c;酶标二抗Preparation of HRP enzyme-labeled second antibody againstgiant panda IgG FcL U O Chen1，WANG Zhen-bin1,LI Ming-heng1，WANG Xing-long1*,PAN Guang-lin2*(1. College of Veterinary Medicine , Northwest A &F University, Yangling 712100, China；2.Rare Wildlife Rescue Base .Shaanxi Academy o f Forestry .Zhouzhi 710402, China)Abstract：In order to obtain HRP labeled anti-giant panda IgG antibody,the giant panda IgG Fc fragment was expressed by recombinant E.coli expression technique. The recombinant protein was immunized in mice,the antibody specificity was detected,and the polyclonal antibody was labeled with HRP. The results showed that the target protein with molecular weight of about 88 ku could be obtained under the condition of 37 °C ,IPTG concentration of 0.5 mmol/L and induction for 5 h.After immunizing mice with the recombinant protein,the reaction titer of the immunized mouse serum with the recombinant protein was more than 102 400 and reacted well with the giant panda serum IgG. The titer of mouse anti-giant panda IgG labeled by HRP labeling kit can reach more than 25 600. The results showed that the HRP labeled mouse anti-giant panda IgG secondary antibody was successfully prepared,which provided support for the development of serological detection methods for giant panda diseases.Key words：giant panda；IgG Fc；enzyme labeled secondary antibody* Corresponding authors：WANG Xing-long,E-mail ：wxlong@nwsuaf. edu. cn；PAN Guang-1 in,E-mail ：33954979@qq. com大熊猫是食肉目、熊科、大熊猫亚科、大熊猫属 猫的生存状况受到广泛关注。
ELISA实验报告
ELISA实验报告作者：李锋学号：2010011574实验时间：2010年11月13日同组人姓名：覃晨、张艺庆一、实验名称酶联免疫吸附测定二、实验原理在抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物中加入相应酶的底物，反应生成有色产物，然后借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。
待测抗体的定量与有色产生成正比。
三、实验材料与试剂1.抗原Human IgG (0.025mg/ul),一抗Rabbit-α-human IgG,二抗辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。
2.包被液，PBS溶液，封闭液，Tween-20 0.5mL蒸馏水稀释至100mL，邻苯二胺溶液，中止液。
3.聚苯乙烯微量细胞培养板，酶联免疫检测仪，取液器，烧杯，稀释用带凹槽的平板。
四、实验步骤1.将用包被液稀释好的Human IgG加入到培养板以B2至D10为对角线的矩形区域中，200ul/well，B11 C11 D11处不加抗原作为对照，然后在37℃下温育30分钟。
2.取出平板，倒尽液体，然后向B2至D11的矩形区域每个孔中加入200ul的PBS 洗涤液，然后倒掉，如此洗涤3次。
再将平板倒置在吸水纸上，使孔中液体流尽。
3.在B2到D10的矩形区域每个孔中加入0.5﹪的BSA溶液200ul，然后在37℃条件下温育30分钟。
4.Washing with PBS 200ul/well for three times。
具体步骤同步骤2。
5.将first antibody Rabbit-α-human IgG稀释成不同的浓度梯度，200ul/well 按下表加入到平板中。
其中B10 C10 D10不加一抗作为对照，然后incubate at 37℃ for one hour.7.在B2到D11的矩形区域中加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，每孔200ul，在37℃下温育30分钟。
8. Washing with PBS 200ul/well for three times。
Elisa实验报告
KH2PO40.2g,
Na2HPO4·12H2O2.9g,
Tween-20，0.5ml，
蒸馏水加至1000ml。
6．洗涤液：同稀释液。
7．封闭液：0.5%（质量分数）BSA（用PBS配制）。
8．邻苯二胺溶液(底物)：
配制：
0.1mol/L柠檬酸(2.1g/100ml),取6.1ml，
0.2mol/LNa2HPO4·12H2O(7.163g/100ml), 取6.4ml,
实验材料与试剂：
1．聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)。
2．酶联免疫检测仪。
3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。
4．包被液：0.05mol/L碳酸缓冲液（pH9.6）：
Na2CO30.15g,
NaHCO30.293g，
蒸馏水稀释至100ml。
5．稀释液（PBS-Tween）：
NaCl8g,
KCl 0.2g，
B
228
1.114
0.810
0.698
0.519
0.374
0.094
C
1.098
1.357
0.943
0.996
1.019
0.895
0.682
0.415
0.201
0.067
D
1.494
1.354
1.240
1.334
1.118
0.859
0.667
0.472
0.281
0.083
组平均
1.333
1.317
1.131
1.186
1.084
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辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用说明
规格：0.1ml/1ml
抗体来源：Goat
克隆类型：Polyclonal
交叉反应：Rb
产品应用：WB=1:1000-10000ELISA=1:1000-10000IHC-P=1:100-1000IHC-F=1:100-1000 not yet tested in other applications.
optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.
分子量：150kDa
性状：Lyophilized or Liquid
浓度：2mg/1ml
免疫原：Full length plasma protein
亚型：IgG
纯化方法：affinity purified by Protein A
储存液：0.01M PBS,pH7.4with10mg/mL BSA and0.1%Gentamicin
保存条件：Storage:Store at–20℃for one year.Avoid repeated freeze/thaw cycles. The lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater than a year when kept at-20oC.When reconstituted in sterile distilled water or diluent supplied,theantibody is stable for at least two weeks at2-4℃。
产品介绍：
Immunoglobulin G(IgG),is one of the most abundant proteins in serum with normal levels between8-17mg/mL in adult blood.IgG is important for our defence against
microorganisms and the molecules are produced by B lymphocytes as a part of our adaptive immune response.The IgG molecule has two separate functions;to bind to the pathogen that elicited the response and to recruit other cells and molecules to destroy the antigen.The variability of the IgG pool is generated by somatic recombination and the number of specificities in an individual at a given time point is estimated to be1011variants.
Important Note:
This product as supplied is intended for research use only,not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.。