辣根过氧化物酶标记 Streptavidin
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
组织化学技术5免疫组化
Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 ①保证离子浓度和PH值。 ②减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
Ab滴片图示：
方法：洗三次，每次5分钟。 Ab孵育技术 必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
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应用：特别适用于含抗原量较少的组织。
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包埋后染色：
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组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制
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成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由
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于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，
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故又称载网染色（on grid staining ）。
优点： ① Ultrastructure 保存良好。 超薄切片易穿透，可标记细胞任何 部位。 方法简便，（+）结果高度可重复性。 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 树脂中的组织不易进行免疫反应。
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液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时
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新配）
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自来水洗净。
5
用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞
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核（可不染）。
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常规脱水、透明、封固、镜检。
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结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
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（四）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 ① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。
免疫组化sabc法原理
免疫组化sabc法原理免疫组化SABC法原理免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体和免疫反应来检测组织样本中特定蛋白质的方法。
免疫组化技术的发展为研究细胞和组织中蛋白质的表达和定位提供了一种有效的手段。
在免疫组化技术中，SABC法（Streptavidin-Biotin Complex）是一种常用的放大方法，用于增强目标抗原的检测信号。
SABC法的原理是通过将抗原特异性的一抗与生物素化的二抗结合，再利用亲和力很强的鸡蛋白素-链霉亲和素（Streptavidin-biotin）结合系统，将生物素与酶或荧光染料等标记物连接起来，从而使目标抗原能够被可视化。
具体而言，SABC法分为四个步骤：抗原修复、阻断、一抗孵育和二抗孵育。
首先是抗原修复，组织样本通常需要进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫活性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解和酸性处理等。
接下来是阻断步骤，目的是阻止非特异性结合。
通常使用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）、小鼠血清、马血清和羊血清等。
然后是一抗孵育，将具有特异性的一抗与待检测的抗原结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择取决于实验的需求。
最后是二抗孵育，将生物素化的二抗与一抗结合。
二抗通常是兔源抗小鼠IgG的抗体，也可以是其他动物源的抗体。
生物素化的二抗通过亲和力结合到一抗上，形成免疫复合物。
在SABC法中，生物素与酶或荧光染料等标记物结合，常用的酶标记有辣根过氧化物酶（HRP），荧光标记有荧光素酶（FITC）和罗丹明（Rhodamine）等。
这些标记物能够使抗原产生可见的颜色或荧光信号。
在目标抗原上添加底物，使酶催化底物产生可见的颜色反应，或者直接观察荧光信号。
通过显微镜观察或图像分析系统，可以定量分析目标抗原的表达和定位。
免疫组化SABC法具有高度特异性和敏感性，能够定量检测目标抗原在组织中的表达水平和定位。
它在研究细胞生物学、病理学和分子生物学等领域发挥了重要作用。
辣根过氧化物酶标记抗体原理
辣根过氧化物酶标记抗体原理一、辣根过氧化物酶标记抗体的原理辣根过氧化物酶（HRP）是一种常用的酶标记物，具有很高的灵敏度和稳定性。
辣根过氧化物酶标记抗体原理主要是利用辣根过氧化物酶与抗体的特异性结合，通过其催化能力来检测目标分子的存在并定量分析。
辣根过氧化物酶标记抗体的制备过程主要分为两个步骤：辣根过氧化物酶的活化和抗体的标记。
1. 辣根过氧化物酶的活化辣根过氧化物酶通常以干燥粉末的形式存在，需要在一定条件下进行活化。
活化的过程中，辣根过氧化物酶会与过氧化氢发生反应，形成活性中间体。
这个活性中间体具有较强的催化能力，可以催化底物的氧化反应。
2. 抗体的标记在活化的辣根过氧化物酶中，将目标抗体与其特异性结合。
这个过程中，通常使用交联剂来进行共价结合，使得辣根过氧化物酶与抗体牢固地结合在一起。
这样就得到了辣根过氧化物酶标记抗体。
二、辣根过氧化物酶标记抗体的应用辣根过氧化物酶标记抗体在生命科学研究中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 免疫组化辣根过氧化物酶标记抗体可以用于免疫组化实验，通过与目标抗原的特异性结合，可以在组织切片中精确地定位抗原的存在位置。
辣根过氧化物酶的催化反应会产生可见的颜色，从而可以直观地观察到抗原的分布情况。
2. 免疫印迹辣根过氧化物酶标记抗体也可以用于免疫印迹实验，通过与目标蛋白的结合，可以检测目标蛋白的存在和表达水平。
辣根过氧化物酶的催化反应会产生发光信号或者颜色变化，从而可以定量地测量目标蛋白的数量。
3. 免疫荧光辣根过氧化物酶标记抗体还可以用于免疫荧光实验，通过与目标抗原的结合，可以在细胞或组织中观察到荧光信号。
这种方法可以用来研究细胞的定位、蛋白的相互作用等重要生物学过程。
4. 免疫流式细胞术辣根过氧化物酶标记抗体也可以应用于免疫流式细胞术，通过与目标抗原的结合，可以实现对细胞表面抗原的定量和检测。
通过流式细胞仪的高通量检测，可以同时分析大量细胞的抗原表达情况，为研究细胞免疫学提供了重要手段。
辣根过氧化物酶(hrp)标记抗体的简易方法
辣根过氧化物酶(hrp)标记抗体的简易方法
过氧化物酶(hrp)标记抗体是用来表征可以探针凝集反应的特异性抗体，在临床实验研究中的应用得到广泛的认可。
它的应用范围十分广泛，比如体液免疫学分析、组织学病理学分析以及疾病诊断、计量检验研究等等。
简单说，hrp标记抗体是把过氧化物酶hrp与抗体联合在一起，通过特异性抗体与被检物质（抗原）之间的可凝集反应得以应用，通过hrp的过氧化反应，这种反应被放大从而易于检测（可见部分检测反应使用对抗联系）。
hrp标记抗体的简易方法主要包括直接标记（direct labeling）和间接标记（indirect labeling）两种方法。
直接标记就是直接在抗体上表征过氧化物酶，而间接标记则是用一种不活性的人工抗原（Artificial antigen）表征过氧化物酶，再将其与抗体结合之后实现标记。
不同的是，直接标记方式要求抗体具有足够的处理过氧化物酶hrp 的敏感性和穩定性，另外在反应过程中要确保hrp能均匀分布在抗体表面，而间接标记有利于hrp的均匀分布，能够有效改善抗体的表位，延长其在反应中的有效性。
虽然hrp标记抗体分析系统在实验室研究中受到广泛应用，但是其具体的标记方法却不断地发生变化。
为了确保标记过程的准确性，要首先确定优选的hrp、hrp连接剂和标记抗体，并根据原料质量和实验程序做出必要的改变以保证标记抗体的有效性和稳定性。
其次，在进行标记前要检查原料和实验设备是否合适，确保反应条件的正确性，并在延迟反应过程中加入缓冲剂和阻垢剂以延长抗体、hrp以及hrp连接剂的稳定性。
最后，建议实验人员按照规定的步骤进行实验，以保证结果的可靠性，并且确保标记抗体在模板或探针过程中不会造成污染。
Streptavidin-HRP说明书
产品简介
链霉亲和素（Streptavidin）是一种分子量 60kDa 左右的四聚体蛋白，一分子链霉亲和素 可以高度特异性地与四分子生物素结合，链霉亲和素可用于检测和分离生物素化蛋白。辣根 过氧化物酶（HRP）是一种含亚铁血红素的糖蛋白，与底物孵育，能产生一种着色、荧光或 发光标记的分子衍生物。Streptavidin-HRP 是由链霉亲和素和辣根过氧化酶交联所得，与 生物素化蛋白和特定化学发光底物结合产生光信号，因此可用于生物素化抗体、蛋白、组织、 细胞、核酸等样品的检测。
储存缓冲液
1XPBS, 50%甘油。
储存温度
2-8℃保存一个月，-20℃保存一年，避免反复冻融。
产品应用
具体工作浓度按实际实验样品调整。稀释倍数受多种因素影响，包括一抗和二抗浓度、孵育 时间等，我们推荐稀释比例如下：
Immunocytochemistry Western Blot ELISA
1:200-1：500 1:1000 - 1:10000 1:5000 - 1:20000
订购信息
产品名称
Streptavidin-HRP
货号 SLP001H SLP001HC
规格 100µl 1ml
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常州天ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ人和生物科技有限公司
碧云天Mouse TNF-α ELISA Kit (小鼠TNF-α酶联免疫吸附检测试剂盒)说明书
Mouse TNF-α ELISA Kit产品编号 产品名称包装 PT512Mouse TNF-α ELISA Kit96次产品简介：碧云天的Mouse TNF-α ELISA Kit (Mouse Tumor Necrosis Factor-α Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即小鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测小鼠血清、血浆、细胞或组织裂解液、或细胞培养上清液中的TNF-α的试剂盒。
本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。
多次重复检测结果表明，最小检出量为30.8pg/ml ，与人TNF-α、sTNF RIs 、TNF RII 等均没有交叉反应，板内、板间变异系数均小于10%。
TNF-α，即TNF 、TNF α或TNFalpha ，也称cachectin 、cachexin 或TNFSF1A 。
TNF-α由巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞在细菌感染、内毒素刺激、病毒或寄生虫感染时产生。
肿瘤坏死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily)共约19个成员，包含由巨噬细胞等产生的TNF-α和T 淋巴细胞产生的TNF-β(也称Lymphotoxin-alpha)，以及FASL 、TRAIL 、CD40L 、CD27L 、CD30L 等。
TNF-α与TNF-β在结构上有一定的相似性，并且在氨基酸水平有28%的同源性，它们拥有共同的受体TNFR1和TNFR2。
由于TNF-α的生物学活性占TNF 总活性的70%~95%，因此目前常说的TNF 多指TNF-α。
TNF (Tumor Necrosis Factor)因为能诱导细胞死亡而得名，实际上其很多时候诱导的细胞死亡为细胞凋亡。
人TNF-α有两种形式，一种是由233个氨基酸组成的跨膜蛋白同源三聚体(homotrimers)，另外一种是该跨膜蛋白在TNF-α转化酶TACE(TNF-α converting enzyme)的作用下切除信号肽，形成成熟的157个氨基酸的可溶性TNF-α单体(分子量为17KDa)的同源三聚体。
大鼠神经特异性烯醇化酶NSE
大鼠神经特异性烯醇化酶NSE ELISA本试剂盒用于定量检测大鼠血清和血浆中的NSE的浓度。
本试剂盒采用双抗夹心ELISA法。
抗大鼠NSE单抗包被于酶标板上，大鼠标本中的NSE会与单抗结合。
加入生物素化的抗大鼠NSE（二抗），它将与结合在单抗上的大鼠NSE结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。
辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 将与二抗的生物素结合，多余的物质会被洗掉。
加入TMB显色。
大鼠NSE的浓度与OD(450nm)成正比。
酶标板(Coated Wells) 48wells Anti-Rat NSE Biotin 1 vial浓缩洗涤液(40X)(Washing Concentrate)12.5ml 标准品(Standards) 1 vial显色液(TMB Substrate) 6ml 标准品稀释液(Standard Diluent) 7ml终止液(Stop Solution) 6ml 浓缩酶联物（HRP） 1 vial酶联物稀释液(HRP Diluent) 7ml 生物素稀释液(Biotin Diluent)7ml1.可在450nm处进行读数的酶标仪；2.能精确吸取10-200µL的移液器；3.可调多道（8）移液器（50－200µL）；4.供可调多道移液器使用的试剂存放槽；5.洗瓶或洗板机；6.蒸馏水或去离子水；7.1升的圆柱形量筒；8.移液器：1和（10或25 mL）；9.移液器枪头；10.纸巾；11.计时器，用以监控温育步骤；12.处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）；1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。
所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。
使用后立即冷藏保存试剂。
2.洗板不正确可以导致不准确的结果。
在加入HRP或底物前确保尽量吸干孔内液体。
温育过程中不要让微孔干燥掉。
3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
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辣根过氧化物酶标记Streptavidin产品简介：本辣根过氧化物酶标记Streptavidin (HRP-labeled Streptavidin)也称HRP-Streptavidin、Streptavidin-HRP或辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，为进口分装，可以用于生物素(Biotin)标记的抗体、核酸、蛋白或其它生物素标记分子的检测。
具体用途包括Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等。
本HRP-Streptavidin用高纯度的Streptavidin和超纯的辣根过氧化物酶交联而成，确保产生最低的本底和最高的灵敏度。
本产品的浓度为1mg/ml。
Streptavidin的分子量为66kD，可以高度特异性地和生物素(Biotin)结合。
Streptavidin和生物素的亲和常数为K d=10-15M。
Streptavidin是一个4聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子。
Streptavidin的中文名为链霉亲和素，从Streptomyces adidinii 中纯化获得，和鸡蛋清来源的Avidin(亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。
和Avidin不同的是，Streptavidin是一种非糖基化蛋白，并且基本不带电荷。
Avidin的pI= ~10.5，在中性pH条件下呈碱性。
由于Streptavidin 和Avidin相比在中性条件下不带电荷，因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多，这样检测时的非特异性背景就低很多。
因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin。
辣根过氧化物酶即horseradish peroxidase (HRP)，可以在Western、EMSA、Southern或Northern等检测时催化ECL类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光，可以在ELISA时催化TMB产生蓝色，也可以在免疫组化、免疫细胞化学或Western blot 检测时催化DAB产生棕色沉淀。
本辣根过氧化物酶标记Streptavidin用于各种常规用途的推荐稀释比例参考下表，实际实验操作过程中需根据具体情况适当调节辣根过氧化物酶标记Streptavidin的稀释比例。
对于Western，推荐的稀释范围为1:2000-10000。
本产品如果用于常规的Western检测，以每次检测需10毫升1:2000稀释的本产品计，可以检测40次。
保存条件：-20℃保存，一年有效。
注意事项：叠氮钠会抑制辣根过氧化物酶的活性，在含有辣根过氧化物酶的溶液中不可加入叠氮钠。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1.Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等请参考相关实验步骤进行。
起始稀释浓度按照产品简介中推荐的稀释比例进行稀释。
使用本产品的文献：1. Liu H, Jiang C, Xiong C, Ruan J.DEDC, a new flavonoid induces apoptosis via a ROS-dependent mechanism in humanneuroblastoma SH-SY5Y cells.Toxicol In Vitro. 2012 Feb;26(1):16-23.2. Liu J, Qian X, Chen Z, Xu X, Gao F, Zhang S, Zhang R, Qi J, Gao GF, Yan J.Crystal structure of cell adhesion molecule nectin-2/CD112 and its binding to immune receptorDNAM-1/CD226.J Immunol. 2012 Jun 1;188(11):5511-20.3.P Xiao, X Lv.Immobilization of Chymotrypsin on Silica Beads Based on High Affinity and Specificity Aptamer and Its Applications.Analytical Letters,2012,45(10),1264-1273.4.Tang MR, Wang YX, Guo S, Han SY, Wang D.CSMD1 exhibits antitumor activity in A375 melanoma cells through activation of the Smad pathway.Apoptosis. 2012 Sep;17(9):927-37. doi: 10.1007/s10495-012-0727-0.5.Liu H, Zhang S, Lin H, Jia R, Chen Z.Identification of microRNA-RNA interactions using tethered RNAs and streptavidin aptamers.Biochem Biophys Res Commun. 2012 Jun 8;422(3):405-10. Epub 2012 May 7.6.Liu J, Qian X, Chen Z, Xu X, Gao F, Zhang S, Zhang R, Qi J, Gao GF, Yan J.Crystal Structure of Cell Adhesion Molecule Nectin-2/CD112 andts Binding to Immune Receptor DNAM-1/CD226.J Immunol. 2012 Jun 1;188(11):5511-20. doi: 10.4049/jimmunol.1200324. Epub 2012 Apr 30.7. Bu X, Zhao C, Wang W, Zhang N.GRIM-19 inhibits the STAT3 signaling pathway and sensitizes gastric cancer cells to radiation.Gene. 2013 Jan 10;512(2):198-205. doi: 10.1016/j.gene.2012.10.057. Epub 2012 Nov 1.8. Jiang X, Zhu Z, Sun Z, Wang L, Zhou L, Miao H, Zhang Z, Shi F, Zhu C.The development of an indirect competitive immunomagnetic-proximity ligation assay for small-moleculedetection.Analyst. 2013 Jan 21;138(2):438-42. doi: 10.1039/c2an36447f.9. Xia P, Gou WF, Zhao S, Zheng HC.Crizotinib may be used in lewis lung carcinoma: A novel use for crizotinib.Oncol Rep. 2013 Jul;30(1):139-48. doi: 10.3892/or.2013.2424. Epub 2013 Apr 24.10.Xie X, Mu L, Yao X, Li N, Sun B, Li Y, Zhan X, Wang X, Kang X, Wang J, Liu Y, Zhang Y, Wang G, Wang D, Liu X, Kong Q, Li H.ATRA alters humoral responses associated with amelioration of EAMG symptoms by balancing Tfh/Tfr helper cellprofiles.Clin Immunol. 2013 May 24;148(2):162-176. doi: 10.1016/j.clim.2013.05.009.11.Wu B, Ma X, Zhu D, Liu Y, Sun Z, Liu S, Xue B, Du M, Yin X.Lentiviral delivery of biglycan promotes proliferation and increases osteogenic potential of bone marrow-derivedmesenchymal stem cells in vitro. J Mol Histol. 2013 Mar 17.12.Fan H, Wang X, Jiao F, Zhang F, Wang Q, He P, Fang Y.Scanning Electrochemical Microscopy of DNA Hybridization on DNA Microarrays Enhanced by HRP-ModifiedSiO2 Nanoparticles.Anal Chem. 2013 Jun 18.13.Fan H, Jiao F, Chen H, Zhang F, Wang Q, He P, Fang Y.Qualitative and quantitative detection of DNA amplified with HRP-modified SiO2 nanoparticles using scanning electrochemical microscopy. Biosens Bioelectron. 2013 Sep 15;47:373-8. doi: 10.1016/j.bios.2013.03.027. Epub 2013 Mar 25.14.Han CY, Yue LL, Tai LY, Zhou L, Li XY, Xing GH, Yang XG, Sun MS, Pan WS.A novel small peptide as an epidermal growth factor receptor targeting ligand for nanodelivery in vitro.Int J Nanomedicine. 2013;8:1541-9. doi: 10.2147/IJN.S43627. Epub 2013 Apr 19.15.Zhu Z, Jin J, Xue N, Song X, Chen X.Development and validation of high-throughput screening assays for poly(ADP-ribose) polymerase-2 inhibitors.Anal Biochem. 2014 Mar 15;449:188-94. doi: 10.1016/j.ab.2013.12.028. Epub 2013 Dec 29.16.Liu S, Zhang E, Yang M, Lu L.Overexpression of Wnt11 promotes chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in synergism with TGF-β.Mol Cell Biochem. 2014 May;390(1-2):123-31. doi: 10.1007/s11010-014-1963-0. Epub 2014 Jan 29.。