2005年版中国药典无菌检查法

2005年版《中国药典》无菌检查 法
罗慧萍 四川省食品药品检验所
2006年7月
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2005年版无菌检查法介绍
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2005年版药典无菌检查方法的验证
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2005年版无菌检查法介绍
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无菌检查基本定义
无菌检查是检查要求无菌的药品.医疗器具.原料.
辅料.以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的 一种方法。 符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检 验条件下未发现细菌和真菌污染。
②固体制剂 无菌粉针剂或无菌粉末原料的供试品。 取规定量，加适宜的溶剂溶解或按
标签说明复溶，根据其溶解性按水溶 液或非水溶性供试品项下的方法检验。
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薄膜过滤法8种供试品的处理和接种
③β-内酰胺类抗生素供试品

取规定量，按水溶性制剂或无菌粉针 剂及无菌粉末原料的供试品处理法处理， 薄膜过滤，用冲洗液冲洗数次。最后一 次用适量的β-内酰胺酶冲洗液清除残留 在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基； 或将滤膜直接接入含适量β-内酰胺酶的 培养基。
对氨基苯甲酸：用于磺胺类供试品 聚山梨酯80：用于非水溶性供试品 β -内酰胺酶：用于β -内酰胺类供试品 0.5%葡萄糖肉汤培养基：用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查
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硫乙醇酸盐流体培养基氧化层颜色的要求
接种前：培养基氧化层的高度不得超过培养基深度 的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失 （不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，
带的），吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解， 按水溶性制剂或非水溶性制剂项下方法操作。 同时应做包装中所配带的无菌针头的无菌检 查。 ⑧具有导管的医疗器具（输血、输液袋等） 取规定量，用冲洗液50ml/袋分别冲洗内壁， 集中冲洗液于适宜的无菌容器中，薄膜过滤。 同时应做包装中所配带的针头的无菌检查。
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无菌检查对照试验
阳性对照 ：应根据供试品特性选择阳性对照菌。 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄 色葡萄球菌为对照菌； 抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌； 抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌； 抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。 阴性对照 ：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和 稀释剂同法操作，作为阴性对照。
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无菌检查环境要求
无菌检查在环境洁净度10000级下的局部洁净
度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进 行,其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生 物污染。 一般 18 ℃ ~26℃ ，相对湿度 45％~65％ 例行消毒处理（试验前、后） 定期洁净度检查（一般3～6月一次）
并应防止被污染。
培养后：装量与容器高度的比例应符合培养结束
后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的
1/2。
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培养基的装量
直接接种法规定接种的供试品体积不得大
于培养基体积的10%,同时,硫乙醇酸盐流体
培养基每管装量不少于15ml,改良马丁培养
基每管装量不少于10ml;医用器械体积过大
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上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量 供试品装量V(ml) 每支样品接入每管培 养基的最少量（ml) 最少检验数量（瓶 或支） 20 10 10 10 10 10 6 6
≤1 1<V<5 5≤V<20 20≤V<50 50≤V<100 50≤V<100(静脉给药） 100≤V ≤ 500 V ＞ 500
①水溶性供试品


取规定量，直接过滤，或加稀释剂，混匀后， 过滤。 有抗菌作用或有防腐剂的供试品，冲洗滤膜不 得少于3次。 接种培养基 封闭式过滤器（三支过滤器），100ml/支 一般过滤器（一支过滤器），取出滤膜，分成 3份，50ml/管。
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薄膜过滤法8种供试品的处理和接种

取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯 80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化， 接种至培养基中。或直接接种至含聚山梨 酯80或其它适宜乳化剂的培养基中。
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直接接种法9种供试品的处理和接种 ⑥敷料供试品 取规定数量，以无菌操作拆开包装， 于不同部位分别剪取约100mg或 1cm×3cm的供试品，接种于足以浸没 供试品的适量培养基中。 ⑦肠线、缝合线等供试品 肠线、缝合线及其它一次性使用的医 用材料按规定量取最小包装，无菌拆开 包装，接种于足以浸没供试品的适量培 养基中。
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薄膜过滤法8种供试品的处理和接种
④非水溶性的供试品

取规定量，直接进行过滤或溶于含适量 的聚山梨酯80或其它适宜溶剂的稀释剂中， 立即过滤，用聚山梨酯80-0.1%蛋白胨溶 液冲洗滤膜数次，于聚山梨酯80培养基中 培养。
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薄膜过滤法8种供试品的处理和接种
⑤可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试
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培养及观察
上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。 培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。 如在加入供试品后、或在培养过程中，培养 基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有 无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新 鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培 养2日、真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜 面有无菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检， 判断是否有菌。
本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的
无菌检查同时进行，但是，一旦所用培养基不 符合无菌要求，供试品的无菌检查结果应视为 无效。
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培养基的灵敏度检查
硫乙醇酸盐12ml，9支，4株菌，各1ml，每种培养 基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。 培养3d(原5天)。 改良马丁9ml，5支，2株菌，各1ml，每种培养 基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。 培养5d。 结果判定 空白管培养基无菌生长，加菌的培养基管均生 长良好，判灵敏度检查合格。 （原3支管有2管生长，合格。）
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直接接种法9种供试品的处理和接种
⑧灭菌医用器具供试品 取规定量，必要时应将其拆散或切成小
碎段，接种于足以浸没供试品的适量培养 基中。 ⑨放射性药品 取供试品1瓶(支)，接种于装量为7.5ml 的培养基中。每管接种量为0.2ml。
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薄膜过滤法8种供试品的处理和接种
整个器具3（切碎或拆
散开）
无菌检查方法
直接接种法
薄膜过滤法：只要供试品性状允许，应采用薄
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膜过滤法。 优先采用封闭式薄膜过滤器。
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直接接种法9种供试品的处理和接种 ①一般水溶性供试品 取规定量，直接接种至培养基中。 ②混悬液等非澄清水溶液供试品 取规定量接种至培养基中。 ③固体制剂供试品 取规定量直接接种，或加入适宜的 溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取 规定量接种至培养基中。
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无菌检查培养基
1.常用培养基及用途 硫乙醇酸盐流体培养基：培养好氧菌、厌氧菌。 改良马丁琼脂培养基：培养真菌
2.选择性培养基及用途:按硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处 方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂。 中和剂或表面活性剂的加入量应通过验证试验验证。如
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灵敏度检查用菌种
金黄色葡萄球菌【CMCC(B)26003】 铜绿假单胞菌【CMCC(B)10104】 枯草芽孢杆菌【CMCC(B)63501】 生孢梭菌【CMCC(B)64941】 白色念珠菌【CMCC(F)98001】 黑曲霉【CMCC(F)98003】
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菌液的制备
时，培养基用量可在2000ml以上。
薄膜过滤法为100ml/管或50 ml/管．
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无菌检查培养基
培养基的适用性检查
培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检查 符合规定的培养基方可供试品的无菌检 查试验。
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培养基的无菌性检查
每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天， 应无菌生长。
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结果判断
以一次检出为准。 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但 经确证无菌生长，判供试品符合规定； 若供试品管中任何1管显浑浊并确证有菌生 长，判供试品不符合规定，除非有证据充 分证明检出的微生物非供试品本身所致， 原检验结果无效，应重试。
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结果判断
当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：

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薄膜过滤法8种供试品的处理和接种 ⑥无菌气（喷）雾剂供试品 取规定量，将样品容器置冰
室冷冻约1小时。速以无菌手续 在容器上钻一小孔，释放抛射 剂后再无菌开启容器，按水溶 性制剂或非水溶性制剂项下方 法检验。
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薄膜过滤法8种供试品的处理和接种
⑦装有药物的注射器 取规定量，装上无菌针头（非包装中所配
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批产品出厂最少检验数量
供试品 注射剂 ≤100 100＜N≤500 ＞500 10%或4个（取较多者） 10个 2%或20个（取较少者）
批产量N（个）
每种培养基最少检验数量
大体积注射剂（>100ml)
眼用及其他非注射产品 ≤200
2%或10个（取较少者）
5%或2个（取较多者） 10个
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢 杆菌、生孢梭菌30-35℃培养18-24小时的新鲜 培养物，白色念珠菌在23-28℃24-48小时的新 鲜培养物，黑曲霉23-28℃培养5-7天的培养物， 分别用0.9％无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含 菌数小于100cfu的菌悬液。。
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检验量
全量 半量 2 5 10 半量 半量 500
上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量
供试品装量M （mg/支或瓶） M<50 50≤M<300 300≤M<5g M≥5g 外科用敷料棉花及纱布 缝合线、一次性医用材料 带导管的一次性医疗器具 （输液袋） 其它医疗器具 每支样品接入每管培 养基的最小量（mg) 全量 半量 150 500 取100mg或 1cm×3cm 整个材料3 最少检验数量 （瓶或支） 20 10 10 10 10 20 10 20
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洁净度检查
单向流空气区、工作台面及环境应定期按 《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的
洁净度须符合无菌检查的要求。
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无菌检查培养基
一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配 制 。 培养基的pH值应符合规定，分装好的培养基及时密封后必 须在配制当天（2小时内最佳）进行灭菌处理。 配制时所用器具应采用洁净玻璃制品，避免增加培养基中 的金属离子及其他微量元素而影响微生物的生长，鉴别。 制备好的培养基应在 2-25℃保存，保存在非密闭容器中， 应在3周内使用；保存在密闭容器中，可在1年内使用。
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直接接种法9种供试品的处理和接种
④ß-内酰胺类或磺胺类供试品 取规定量，混合，加入适量的无菌ß-内
酰胺酶溶液或对氨基苯甲酸溶液使中和， 接种至培养基中。或接入含ß-内酰胺酶或 对氨基苯甲酸的培养基中。
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直接接种法9种供试品的处理和接种
⑤非水溶性供试品
品
取规定量，混合至适量无菌十四烷酸异丙酯中， 迅速振摇，使供试品充分溶解，必要时，供试品 可适当加热，温度不超过44℃，趁热迅速过滤。 十四烷酸异丙酯的用量同方法验证试验；无菌 十四烷酸异丙酯，将购买的十四烷酸异丙酯用 0.22µm脂溶性滤膜过滤即得，该滤膜140℃干热 灭菌2h。 若无法过滤，可加入不少于100ml的稀释液，充 分震摇萃取，静置，以下层水相作供试液，过滤， 以适量冲洗液冲洗滤膜数次，于聚山梨酯80培养 基培养。
＞200
桶装固体原料
≤4
每个容器
续上
批产量N（个） 桶装固体原料 4＜N≤50 每种培养基最少检验数量 20%或4个容器（取较大者）
＞50
抗生素固体原料 药（≥5克） 医疗器具 ≤100 100＜N≤500 ＞500
2%或10个容器（取较大者）
6个容器
10%或4件（取较大者） 10件 2%或20件（取较少者）