2005年版中国药典附录《细菌内毒素检查法》
复方氯解磷定注射液细菌内毒素的检查方法
复方氯解磷定注射液细菌内毒素的检查方法
高锦;付聪;嵇扬;聂渝琼;胡丹
【期刊名称】《药学实践杂志》
【年(卷),期】2008(26)2
【摘要】目的:建立复方氯解磷定注射液细菌内毒素检查法.方法:采用<中国药典>2005年版附录细菌内毒素检查法.结果:复方氯解磷定注射液稀释至含氯解磷定10 ms/mL及以下浓度时,用灵敏度为0.25 EU/mL的鲎试剂检测细菌内毒素,无干扰因素影响.结论:复方氯解磷定注射液细菌内毒素限值确定为0.2 EU/mg,可应用鲎试剂进行细菌内毒素法检查.
【总页数】3页(P133-135)
【作者】高锦;付聪;嵇扬;聂渝琼;胡丹
【作者单位】总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京,100071;中国人民解放军第307医院药学部,北京,100039;总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京,100071;总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京,100071;总后勤部卫生部药品仪器检验所,北京,100071
【正文语种】中文
【中图分类】R927.11
【相关文献】
1.复方乳酸钠注射液3号细菌内毒素检查方法的研究 [J], 付聪;高锦;嵇杨;聂渝琼;程洋;付晓菲
2.复方氨基酸（15AA）双肽（2）注射液细菌内毒素检查方法研究 [J], 祝清芬;冯巧巧;肖英;魏霞
3.复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查方法的研究 [J], 王银娟;陆崟;岩林萍;王曙东
4.注射用复方甘草酸苷细菌内毒素检查方法的研究 [J], 陈红英
5.复方骨肽注射细菌内毒素的检查方法研究 [J], 冯磊
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《中国药典》2005年版二学习资料
品种 地塞米松 地塞米松磷酸钠 曲安奈德 氢化可的松
醋酸氢化可的松 醋酸氢化可的松与醋酸可 大于5.5 的松
重视残留溶剂的控制，本版药典（二部）对残留溶 剂的检查推荐采用顶空毛细管气相色谱法，限度与 ICH一致。药品生产企业可采用简便的填充柱气相 色谱法进行工艺控制，其他色谱法如HPLC测定吡 啶，离子色谱法测定N-甲基吡咯烷酮等，可作为气 相色谱法的主要补充。顶空毛细管气相色谱法应考 虑共出峰干扰、热降解干扰、基质效应的影响与药 品溶解性及溶剂介质的影响。 本版药典（二部）收载化学合成原料药约100种， 本版药典（二部）24个品种增订残留溶剂检查，部 分品种残留溶剂种类见表2。制订残留溶剂检查方 法的难点在于各论中方法应满足所有企业不同工艺； 药典方法应具有较好的耐用性；生产工艺的改变将 需要对标准进行相应的修订。
此外，本版药典有针对性地对61个难溶药物增订溶 出度检查；对于上浮的胶囊，采用溶出度一法（转 篮法）和二法（浆法）时可用沉降蓝的方法；原采 用2片加入到至同一溶出杯的方法修订为1片，如三 唑片、溴吡斯的明片和盐酸哌替啶片等，并通过修 订检测方法使检测灵敏度满足溶出物的检测要求。 18个小剂量药品增订含量均匀度检查。70个原料药 增订专属性红外鉴别。
薄层色谱
一、仪器与材料 1、固定相或载体 粒径10~40 μm → 5~ 40 μm 2、喷雾器、显色剂与荧光检测 二、操作方法 1、点样 点样直径2~4 μm ，点间距1.0~2.0 cm 2、展开 单向、双向、多次 3、薄层扫描（删去） 三、系统适用性试验（新增） 1、检测灵敏度 限度对照溶液再经适当稀释，应显示 清晰斑点
注射剂安全性指导原则
注射剂安全性检查法应用指导原则2009-02-28 21:23:41| 分类：个人日记| 标签：|字号大中小订阅本指导原则为注射剂临床使用的安全性和质量可控性而定。
注射剂安全性检查法包括细菌内毒素检查法、热原检查法、异常毒性检查法、过敏反应物质检查法、降压物质检查法、溶血与凝聚检查法等。
根据注射剂的处方、原（辅）料来源、工艺、用法及用量等设定相应的检查项目，并参照本指导原则进行检查项目的适用性研究。
检查项目的制定一、中药注射剂（一）、静脉用注射剂，应设置所有安全性检查项目。
由于中药注射剂成分和干扰细菌内毒素检查法的因素复杂多变，一般首选热原检查法。
如药品本身的药理作用影响体温或对家兔的急性毒性反应而影响热原检查时，可选择细菌内毒素检查法。
（二）、肌内用注射剂，应设异常毒性、过敏反应物质等检查项。
原料和工艺易污染热原且用量较大者，须考虑设热原检查项。
二、化药（包括抗生素、生化药）注射剂（一）静脉用注射剂1、所有静脉用注射剂，均应设细菌内毒素（或热原）检查项。
2、所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时，如组分结构不清晰或有可能污染毒性杂质且又缺乏有效的理化分析方法，应考虑设立异常毒性检查项。
3、所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时，如组分结构不清晰且有可能污染异源蛋白或未知过敏反应物质，又缺乏相关的理化分析方法且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应物质检查项。
4、所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时，如组分结构不清晰或有可能污染组胺、类组胺样降血压物质，应考虑设立降压物质检查项。
（二）肌内用注射剂1、所有肌内用注射剂，如临床用药剂量较大，生产工艺易污染细菌内毒素，应考虑设细菌内毒素（或热原）检查项。
2、所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时，如组分结构不清晰或有可能污染毒性杂质且又缺乏有效的理化分析方法，应考虑设立异常毒性检查项。
3、所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时, 如组分结构不清晰或有可能污染异源蛋白或未知过敏反应物质，又缺乏相关理化分析方法且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应物质检查项。
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程1 简述1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.2 供试品细菌毒素限值的确定。
（一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；（二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。
其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂，K=0.2EU/kg/h。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算：MV D=C?L/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml或U/ml。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。
1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。
2005年版中国药典 《细菌内毒素检查法》
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》凝胶法鲎试剂使用说明书【名称】通用名：鲎试剂英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate （简称TAL）汉语拼音：hou shi ji本品主要成份为B因子、C因子、凝固酶原、凝固蛋白原。
【用途】专用于细菌内毒素检查。
【性状】本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水和生理盐水中易溶。
【原理】本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。
【用法】1．材料和设备1.1选择所需的规格及灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素工作品及细菌内毒素检查用水。
1.2准备若干支10ⅹ75mm玻璃反应试管（若使用0.1ml规格的鲎试剂无需准备此试管）、各种规格吸管或移液器或注射器、稀释内毒素用玻璃管、反应试管架、计时器、旋涡混合仪、恒温水浴箱（37±1℃）。
2．实验操作2.1 稀释细菌内毒素工作品：取内毒素工作品（冻干品）1支，按细菌内毒素工作品使用说明书进行操作。
2.2 TAL试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于TAL试剂中，轻轻振摇至少30S至试剂完全溶解。
注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在短时间内使用（即配即用）。
2.3 检查操作2.3.1 取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10×75mm试管或复溶后的0.1ml /支规格的鲎试剂原安瓿8支，其中2支作供试品管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。
2.3.2 每支供试品管加入0.1ml供试品；阴性对照管加入0.1ml检查用水；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ内毒素的供试品。
2.3.3 封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟，然后取出观察结果。
试管在孵育期间应避免任何的振动。
细菌内毒素检测标准
细菌内毒素检测标准一、范围：本试验为《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定的“凝胶法”，系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理，经判定供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。
二、依据：GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法。
第二部分：生物学试验方法。
《中华人民共和国药典》2010年版二部三、器具及试剂：1.器材：（1）锥形瓶（2）三角烧瓶（3）无热原剪刀、镊子（4）恒温培养箱（5）超净工作台（6）恒温水浴箱（7）电热干燥箱（8）旋涡混合器（9）移液器2.试剂：（1）细菌内毒素国家标准品（2）细菌内毒素工作标准品（3）鲎试剂（4）细菌内毒素检查用水四、实验前准备：1.器具处理：试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素。
玻璃器皿置电热干燥箱内1800C干烤至少2h，或2500C干烤至少30min。
塑料器皿置30%双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒检查用水充分冲洗后置600C烘干备用。
2.鲎试剂灵敏度复核实验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度试验。
试验步骤按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定进行。
3.供试品干扰实验：（1）对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，以检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。
当鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何影响细菌内毒素试验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰实验。
（2）每种产品应取3批并分别使用不少于两个制造商生产的鲎试剂进行干扰实验。
供试液制备按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”规定进行。
（3）如供试品对细菌内毒素试验有干扰作用，可选用下列适宜方法排除干扰：a)使用更灵敏的鲎试剂对供试品进行更大倍数稀释;b)采用无热原氨基甲烷缓冲液稀释供试液;c)采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液pH值在6.0-8.0范围;d)采用阳离子缓冲（MgSO4或MgCl2）稀释供试液以调节离子浓度。
动态浊度法定量检测清开灵注射液中细菌内毒素
动态浊度法定量检测清开灵注射液中细菌内毒素目的：建立定量检测清开灵注射液中细菌内毒素的方法。
方法：采用《中国药典》2005年版二部附录中的动态浊度法检测细菌内毒素。
结果：用此法检测时无干扰因素影响，内毒素回收率为50%~200%。
结论：使用动态浊度法定量检测清开灵注射液中细菌内毒素是可行的，此方法既可避免兔热原检查法操作复杂的缺点，同时又避免了限量法检测内毒素时的干扰。
[Abstract] Objective:To develop an assay for the determination of becterial endotoxin(BET) in Qingkailing Injection. Methods:BET was determinated by turbidimetric-kinetic method. Results:The other components in Qingkailing Injection did not interfere with the quantitation of BET,the recovery of BET was in the range of 50%-200%. Conclusion:The method is proved to be suitable for the determination of BET in Qingkailing Injection and could be used as an alternative for the rabbit pyrogen test.[Key words] Qingkailing Injection; Bacterial endotoxin; Turbidimetric-kinetic method; Interfere factors test清开灵注射液为中药注射剂，是安宫牛黄丸的改型制剂。
内毒素的检测方法及去除方法。
一、热原的性质及除去热原的方法
1．高温法
热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
6．其它
包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法
《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法
由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
2．吸附法
热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法
热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.0～15nm超滤膜可将其除去。
2．细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内
毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
注射用泮托拉唑钠细菌内毒素检查方法的建立
注射用泮托拉唑钠细菌内毒素检查方法的建立黄洋;赵志龙【摘要】Objective To establish a method for bacterial endotoxin test of pantoprazole sodium for injection. Methods According to appendix of"Chinese pharmacopoeia"2005 edition, the interference test and bacterial endotoxin test of different batches of samples were carried out. Results There was interference in the agglutinate reaction between the sample and the relative TAL with pantoprazole Sodium for Injection, and the interference was eliminated after diluted. Conclusion The noninterference concentration of pantoprazole sodium for injection is 2 mg/ml. The bacterial endotoxin test can be used for the quality control of pantoprazole sodium for injection.%目的：建立注射用泮托拉唑钠细菌内毒素检查方法。
方法按《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法，对不同批号的样品进行了干扰试验和细菌内毒素检查。
结果注射用泮托拉唑钠水溶液对TAL与细菌内毒素的凝集反应有干扰作用，经稀释后可排除干扰。
细菌内毒素检测技术
细菌内毒素检测技术---血站应用指南天津市天大天发科技有限公司目录一国家标准的要求 (2)1 细菌内毒素单位：EU (2)2 细菌内毒素国家标准品： (2)3 血站常用检测品种的内毒素限值 (2)5 检测细菌内毒素的设备 (4)6 跟细菌内毒素检测有关的国家标准： (4)二细菌内毒素检查法所用试剂的基础知识 (12)1细菌内毒素 (12)1.1细菌内毒素标准品 (12)1.2细菌内毒素化学结构(LPS)： (12)1.3细菌内毒素在水溶液中的状态： (13)1.4 细菌内毒素的耐热特性 (13)2 鲎试剂（TAL） (13)2.1细菌内毒素和鲎试剂生化反应原理： (14)2.2 鲎试剂的凝胶反应过程观测 (15)3 细菌内毒素检查用水 (15)3.1 药典对细菌内毒素检查用水的要求 (15)3.2 细菌内毒素检查用水注意事项 (15)4 样本处理剂 (15)三检测方法 (16)1 各类样品的预处理及检测方法 (16)2 血液保存液内毒素检测实例 (17)2.1 试验器材及试剂 (17)2.2 供试品资料 (17)2.3 试验方法设计 (17)2.4 实验过程 (17)2.5 结果分析 (18)3 细菌内毒素检测报告样例 (19)四BET系列细菌内毒素分析仪介绍 (21)1 生产企业技术实力雄厚，研究历史深久。
(21)2 仪器发展的重大事件 (22)3 仪器应用范围 (23)4 性能参数 (23)5 检测原理 (24)5.1光密度反应时间(t0.02)取值方法 (24)5.2反应速率测定及浓度计算方法 (25)5.3仪器直接鉴别葡聚糖存在的原理 (25)6 仪器突出特色 (27)6.1 更加符合药典 (27)6.2 检测结果更加准确 (27)6.3 降低检测成本 (27)附件全国部分用户名单 (27)一国家标准的要求1 细菌内毒素单位：EU关于细菌内毒素的量值在80年代几乎都是以重量单位来表示,它很不科学，相同重量的内毒素，由于菌株来源不同，提取方法各异而且所加附形剂不同，因此其生物活性相差很大。
2005年版中国药典内毒素检测
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
定量测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
常用的方法是在250℃干烤至少30分钟，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0-8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。
酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的建立药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5E U/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h)。
注射用卤化丁基橡胶塞的细菌内毒素检查法
关键词 ： 注射 用卤化 丁基橡胶塞 ； 浸提液 ； 细茵内毒 素； 鲎试 剂； 干扰试验
中图 分 类 号 ： ９ ７ １ Ｒ ２．２ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ６— ９ １２ ｏ ）２— ０ １— ２ １０ ４ ３ （０ ７ Ｏ ０ ４ ０ ２２ ． 浸 提 液 制 备
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２ ０ 年第 １ ０７ ６卷第 ２期
药 物鉴 定
注射 用 卤化 丁基橡胶塞 的细菌 内毒 素检查法
张之 奎 ， 梁风 芹 ， 辛国忠 ， 于文胜 ， 郑勇强
（ 黑龙 江乌 苏里 江制 药有 限公 司 ， 龙江 虎林 １ ８ １ ） 黑 ５ ４ ７
时 ， 选 用 家 兔 法 所使 用 的浓 度 比 例 ， ｌ： 。 可 即 ｌ
２１ ．
根据 ２０ ０ ５年版《 中国药典》 规定及相关资料 Ｉ中介绍 的方法进 ２
行 灵 敏 度 复 核 ， 厂 家结 果 相 同 ， 符 合 规 定 ， 表 １ ３个 均 见 。
表 １ 灵 敏 度 复 核 试 验
摘要 ： 目的 建立注射 用 卤化丁基橡胶塞的细 茵内毒素检查 法。 方法 用 ３个不 同厂 家生产 的鲎试 剂对注射 用 卤化丁基橡胶塞浸提液进行 干扰试验 。 结果 采 用细茵 内毒 素检 查法检 查注射 用卤化 丁基 橡胶 塞的热原 ， 内毒素 限量 均小于 ０ ５Ｅ ｍＬ 结论 该方法可行 ， 其 、 Ｕ／ 。 值得推
５种浓 度 。 将细 菌 内毒 素用 Ｂ Ｔ水稀释 成 ０ ２ Ａ，． Ａ Ａ， Ａ共 Ｅ ．５ ０ ５ ， ２ ４种浓度 。 用细菌 内毒素标 准品配制不 同浓度 的样 品阳性液 ， 行 进
预 干 扰 试 验 ， 果 见 表 ２ 结 。
细菌内毒素检查相关问题
细菌内毒素检查相关问题细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题审评四部? 王彦厚摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
关键词：细菌内毒素检查、方法、验证细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。
经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。
但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。
在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。
以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。
此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。
可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。
尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。
因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。
内毒素检查法
2.9细菌内毒素检查用水 2.9细菌内毒素检查用水 2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用 2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用 水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度 水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度 的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用 的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用 水。 3 细菌内毒素的化学结构、量值和限值 3.1化学结构 3.1化学结构 细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要 细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要 有两部分组成：多糖和类脂A 有两部分组成：多糖和类脂A。多糖部分又 可进一步分为O 可进一步分为O-特异性多糖链、核心寡聚 糖。O 特异性脂多糖一般由3 糖。O-特异性脂多糖一般由3-6个单糖通过 糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是 LPS分子中最易变异的成分。 LPS分子中最易变异的成分。
1.2 细菌内毒素在我国的发展
在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始 在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始 将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究， 1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。 1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。 1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4 1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4种 药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试 方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始 方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始 收载细菌内毒素检查法。1995年版中国药典规定 收载细菌内毒素检查法。1995年版中国药典规定 13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典 13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典 规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2005年版 规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2005年版 药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。 药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。
对中国药典(二○○五年版一部)收载细菌内毒素检查法的建议
对中国药典(二○○五年版一部)收载细菌内毒素检查法的建议汪穗福;苏广海;劳海燕;李薇;林秋晓;苏惠虹【期刊名称】《中医药信息》【年(卷),期】2004(021)001【摘要】对中国药典(二00五年版一部)收载细菌内毒素检查法提出建议,认为药典收载细菌内毒素检查法很有必要和可行,理由是:该法是监控热原反应较成熟和国际上公认较理想的检测方法,收载细菌内毒素检查法能体现出药典的中国特色.收载该法更能促进生产厂家的重视,有利于该法的推广与使用.并认为中药注射剂的细菌内毒素检查法研究在我国已有一定基础和做了大量工作,有条件、有能力做好该项工作,并对如何做好该项工作提出几点措施和建议.【总页数】2页(P57-58)【作者】汪穗福;苏广海;劳海燕;李薇;林秋晓;苏惠虹【作者单位】广州市医药中专学校,广东,广州,510430;广州市药品检验所,广东,广州,510160;广东省人民医院药学部,广东,广州,510080;广州市药品检验所,广东,广州,510160;广东省人民医院药学部,广东,广州,510080;广州市医药中专学校,广东,广州,510430【正文语种】中文【中图分类】R446.5【相关文献】1.中国药典2005年版二部与2000年版二部细菌内毒素检查法的比较 [J], 曲建全;魏彦锋;赵长美;穆淑娥2.中国药典2005年版二部与2000年版二部细菌内毒素检查法的比较 [J], 曲建全;魏彦锋;赵长美;穆淑娥3.对《中国药典》2000年版一部收载的部分中药材增加水分检查的建议 [J], 屈德扬;傅黎春4.对《中国药典》2005年版一部中药制剂收载品种遴选的建议 [J], 高学敏;张德芹;王停5.对1995年版《中国药典》一部收载的部分中药采收期的讨论和建议(Ⅰ) [J], 钟凤林;王康正因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
中国药典三部标准(2005)
中国药典三部标准(2005年版)正文101种A群脑膜炎球菌多糖疫苗拼音名：A Qun Naomoyanqiujun Duotang Yimiao英文名：Group A MeningococcaI Polysaccharide Vaccine书页号：2005年版三部-34本品系用A群脑膜炎奈瑟菌培养液，经提取获得的荚膜多糖抗原，纯化后加入适宜稳定剂后冻干制成。
用于预防A群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎。
1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 菌种生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.1 菌种名称及来源生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟菌CMCC 29201(A4)菌株。
2.1.2 种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3 种子批的传代主种子批启开后传代次数不得超过5代，工作种子批启开后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。
2.1.4 种子批菌种的检定2.1.4.1 培养特性及染色镜检菌种接种于含10%羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25%不生长。
于35～37% 二氧化碳的环境中培养16～20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中呈现均匀混悬液。
染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。
2.1.4.2 生化反应发酵葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气；不发酵乳糖、甘露醇、果糖及蔗糖(附录ⅥV)。
2.1.4.3 血清凝集试验取经35～37℃培养1 6～20小时的菌苔，混悬于含0.5%甲醛的生理氯化钠溶液中，或56℃加热30分钟杀菌以后，使每1ml含菌1.o×10〈9〉～2.o×10〈9〉，与同群参考血清做定量凝集反应，置35～3℃过夜，次日再置室温2小时观察结果，以肉眼可见清晰凝集现象(+)之血清最高稀释度为凝集反应效价，必须达到血清原效价之半。
2.1.5 种子批的保存原始种子批和主种子批应冻干保存于2～8℃。
盐酸瑞芬太尼细菌内毒素检查法的建立
盐酸瑞芬太尼细菌内毒素检查法的建立
付蓉;李莉娥;覃琨;程延军
【期刊名称】《三峡大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2010(32)6
【摘要】目的:建立盐酸瑞芬太尼的细菌内毒素检查法.方法:参照<中国药典>2005年版二部附录"细菌内毒素检查法",用不同厂家的鲎试剂对不同批号的盐酸瑞芬太尼分别进行干扰试验,考察确立盐酸瑞芬太尼的细菌内毒素检查法.结果:采用灵敏度为0.5 IU·mL-1的鲎试剂,将本品稀释到0.254 mg·mL-1以下,对鲎试剂的凝集反应无干扰.结论:本品可用细菌内毒素检查法来控制内毒素,其细菌内毒素限值可定为20 IU·mg-1.
【总页数】3页(P104-106)
【作者】付蓉;李莉娥;覃琨;程延军
【作者单位】武汉大学,药学院,武汉,430072;宜昌人福药业有限责任公司,湖北,宜昌,443005;宜昌人福药业有限责任公司,湖北,宜昌,443005;宜昌人福药业有限责任公司,湖北,宜昌,443005
【正文语种】中文
【中图分类】R914
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2005年版中国药典附录《细菌内毒素检查法》本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指含量小于0.015EU/ml灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0—8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg²h)表示，注射剂K=5E U/(kg²h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg²h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg²h)；M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg²h)、mg (kg²h)或U/ (kg²h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指在实验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
用以下公式来确定MVD：MVD=CL/λ式中L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L 以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U/ml；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小稀释浓度C=λ/L。
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法1 凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm³75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).λc=1g-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
只有当A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。
按下式计算C和B 的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。
Es= 1g-1(∑Xs/4)Et= 1g-1(∑Xt/4)式中Xs和Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。
当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5 Es和2 Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
表1 凝胶法干扰试验溶液的制备注：A 供试品溶液；B干扰试验系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D阴性对照。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
为确保所选择的处理方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法（1）凝胶限量试验按表2制备溶液A、B、C、D。
使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。
按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
注：A供试品溶液；B供试品阳性对照；C阳性对照；D阴性对照。
结果判断保温60分钟±2分钟后观察结果。
若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的所有平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。
若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。
（2）凝胶半定量试验本方法系通过确定终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。
按表3制备溶液A、B、C和D。
按鲎度剂灵敏度复核试验项下操作。
结果判断若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ—2λ之间，试验有效。
系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度〔按公式CE=1g-1(∑X/2)〕。
如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。
如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以该供试品进行半定量的初始稀释倍数）。
如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。
从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。
B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。
D为阴性对照。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。
若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。
方法2 光度测定法光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程过程中浊度变化而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理，可以分为终点浊度法和动态浊度法。
终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度和透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。
动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。
终点显色法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。
动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。
光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检测结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性实验。
用标准内毒素配成溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。
每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。
同时要求做2支阴性对照。
当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。
根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应该大于或等于0.980，试验方有效。
否则须重新试验。
干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm）。
作为供试品干扰实验中添加的内毒素浓度。
按表4制备溶液A、B、C 和D。
注: A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。
B为加入标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。