微生物常规鉴定技术
微生物常规鉴定技术(带图片)
微生物常规鉴定技术一、形态结构和培养特性观察１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。
，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。
因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要容。
１）细菌的培养特征包括以下容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基菌丝褐色。
霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色:革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
微生物的常规检验技术--乳酸菌的检验
四、乳酸菌的检验
４ 检验程序
四、乳酸菌的检验
５ 操作步骤--样品制备 ➢ 样品制备无菌操作程序： ➢ 第一步：冷冻样品 可先使其在2~5℃条件下解冻，时间不超过18h,也可在温度不超 过45℃的条件下解冻，解冻时间不超过15min； ➢ 第二步：固体和半固体食品 以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的 无菌均质杯内，8000 ~ 10 000 r/min均质1 ~ 2min，制成1:10样品匀液； ➢ 第三步：液体样品 应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生 理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇,制成1:10的样 品匀液； ➢ 第四步：用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水 的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹 打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液； ➢ 第五步：另取1mL无菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次， 即换用1次1mL灭菌吸管。
➢ 双歧杆菌培养:根据待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度，每个稀
释度吸取0.1mL样品匀液于莫匹罗星锂盐改良 MRS琼脂平板，表面涂布，每稀释度做
两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48h ±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释
到平板涂布要求在15min内完成；
➢ 嗜热链球菌培养:根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度,每
培养皿1 培养皿2 平均数
微生物常规生化鉴定技术
微生物常规鉴定技术一、形态结构和培养特性观察１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。
，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。
因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。
霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色:革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
临床细菌常规检验方法
临床细菌常规检验方法1.样本收集：通常采用微生物标本采集套装，如采血培养瓶、骨髓培养瓶、尿培养瓶、分泌物培养瓶等。
不同类型的标本要按照不同的采集方法进行采集，以确保样本的纯度和无污染。
2.样本处理：在获得样本后，要进行适当的处理，如血液样本要进行离心分离，分离出红细胞和血浆/血清。
尿液样本要进行离心去除悬浊物等。
3.细菌培养：将已处理的样本分别接种到含有适当培养基的培养皿中，并在适当温度和湿度下培养一段时间。
通常常规培养采用的培养基包括血浆琼脂、麦康凯琼脂等。
培养时间通常为24-48小时，特殊细菌可能需要更长的培养时间。
4.细菌鉴定：对培养出的菌落进行初步的形态学鉴定，如观察菌落形状、大小、颜色等。
然后进行革兰染色，观察细菌的形态特征，如是否革兰阳性或革兰阴性。
根据初步鉴定的结果，可以选择进一步的生化试验或分子生物学检测，如氧化/发酵试验、羟基酸钠试验、目标序列扩增等。
最终确定细菌的种类和特征。
5.药敏试验：对已鉴定出的细菌进行药敏试验，以确定细菌对各类抗生素的敏感性。
药敏试验通常采用纸片扩散法或肉汤稀释法，通过观察菌落的生长抑制区域大小来判断细菌对抗生素的敏感程度。
6.结果分析和报告：根据细菌培养和鉴定的结果以及药敏试验的结果，进行结果分析和判断。
最后将结果整理成报告，提供给临床医生参考，帮助临床医生做出正确的诊断和治疗决策。
总的来说，临床细菌常规检验方法包括了样本收集、样本处理、细菌培养、细菌鉴定、药敏试验等步骤。
这些步骤的顺序和方法都有一定的规范和标准，以确保检验结果的准确性和可靠性。
临床细菌常规检验在临床诊断和治疗中起着重要的作用，可以帮助医生选择合适的抗生素治疗方案，提高治疗效果。
微生物检验的基本操作技术
微生物检验的基本操作技术一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。
2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。
包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。
包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。
3、无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。
严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
二、无菌操作的环境要求1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；（2）无菌室的消毒和防污染•每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）；•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。
（3）无菌室使用要求①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
《医学微生物学》三大常规的微生物学检查
《医学微生物学》三大常规的微生物学检查从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。
因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。
1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。
病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。
对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。
2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。
若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。
3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。
另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。
4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。
如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。
【血液标本检查】正常人的血液是无菌的。
当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。
细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。
一、标本采集l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。
穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。
2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。
伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。
3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。
微生物鉴别方法
微生物鉴别方法一、微生物鉴别方法——传统方法在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。
在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。
1、形态学特征(1)细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽抱和荚膜、芽抱的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，抱子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
(2)群体形态群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。
如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。
2、生理生化反应特征(1)利用物质的能力包括对各种碳源利用的能力（能否以C02为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。
（2）代谢产物的特殊性这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、C02、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。
（3）与温度和氧气的关系测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。
对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。
3、生态学特征生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。
在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。
3.4细菌生化鉴定技术卫生微生物检验实验方法与技能
附录
(1) 菌种 • 大肠埃希菌、伤寒沙门
菌、产气肠杆菌、变形 杆菌。
(2) 培养基、试剂 • 微量生化反应管，KIA
斜面，MIU半固体 • 靛基质试剂、甲基红试
剂、VP试验甲/乙液。
【思考题】
• 简述IMVC组试验的原理、结果判断及应用。 • 简述KIA复合试验的原理及结果判断。
2023/12/28
1. 糖发酵试验
【原理】
– 各种细菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，对糖 （苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的 分解后仅产酸，有的分解后产酸产气，故可用来鉴别 细菌。
【方法】
– 将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种葡萄糖、乳糖发 酵管，35℃培养18-24h 观察结果。
【结果】
– 首先确定细菌是否生长，细菌生长者培养基呈混浊状： – 不分解糖，培养基顔色与接种前无变化，以“-”表示；
6. 克氏双糖铁（KIA）复合试验
【原理】
– 该培养基用酚红指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色。 – 含葡萄糖和乳糖，前者是后者的1/10。 – 能发酵乳糖或同时发酵G，产酸量大，底层和斜面均变黄。 – 只发酵G，产酸量少，斜面部分挥发、氧化，恢复红色。
底层缺氧，酸不被氧化依然黄色。 – 产气，琼脂出现裂隙。 – 产硫化氢，遇铅或铁离子形成黑色沉淀。
VP 试验 左侧：产气肠杆菌阳性（变红）；
右侧：大肠埃希菌阴性
5. 枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验（C）
【原理】
– 当细菌可以利用铵盐作为唯一氮源，同时柠檬酸盐 为惟一碳源时，可在柠檬酸盐培养基上生长，分解 柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香 草酚蓝由绿色变为深蓝色为阳性，培养基不变色 （绿色）为阴性。
微生物检验技术介绍
微生物检验技术介绍微生物检验技术是医学、生物学、化学等多个学科领域交叉融合的前沿技术，其主要目的是通过对微生物的形态、结构、生理生化特性等进行观察、测定和分析，为疾病诊断、病原体鉴定、流行病学调查等方面提供重要依据。
以下是微生物检验技术的主要内容：一、传统微生物学检验技术传统微生物学检验技术是建立在经典微生物学的基础上，通过形态学、生理生化等特征对微生物进行鉴定和分类。
该方法具有简单、直观、快速等优点，但易受主观因素和经验限制，且无法对某些微生物进行准确鉴定。
1、显微镜检查显微镜检查是微生物检验的基本方法之一，通过观察微生物的形态、大小、结构等特征，对微生物进行初步鉴定。
该方法主要用于细菌、真菌等微生物的观察。
2、培养基培养培养基培养是一种常用的微生物分离培养方法，通过在培养基中接种微生物，观察其生长情况，进行分离、鉴定和计数。
该方法可用于细菌、真菌等微生物的培养。
3、生化鉴定生化鉴定是通过测定微生物对各种生化试剂的反应，了解其生理生化特性，从而对微生物进行鉴定和分类。
该方法可用于细菌、酵母菌等微生物的鉴定。
二、现代微生物学检验技术随着科技的发展，现代微生物学检验技术越来越趋向于自动化、快速化和高精度化。
以下是一些常见的现代微生物学检验技术：1、免疫学检测技术免疫学检测技术是一种基于抗原-抗体反应的检测方法，通过制备特异性抗体，对样本中的抗原进行检测。
该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已被广泛应用于医学、食品等领域。
2、分子生物学检测技术分子生物学检测技术是一种基于DNA或RNA等核酸分子的检测方法，通过分析核酸分子的序列、结构等特征，对微生物进行鉴定和分类。
该方法具有高精度、高特异性等优点，但需要一定的技术和设备支持。
3、色谱-质谱联用技术色谱-质谱联用技术是一种将色谱分离与质谱鉴定相结合的检测方法，通过将样本中的化合物进行分离和鉴定，了解其化学性质和结构特征。
该方法可用于细菌、真菌等微生物产生的代谢产物的鉴定。
微生物四大基本技术
微生物四大基本技术微生物学是生物学的重要学科之一，其主要研究微生物的生物学特性及其对环境的影响，包括微生物的生理、生态、遗传、进化及其应用等方面。
微生物学中的四大基本技术是鉴定、分离、培养和纯化，下面将详细介绍四个技术及其在微生物学中的应用。
一、鉴定技术鉴别和分类微生物的目的是确定微生物种属的名称和系统学位置，并集成有关微生物的生物学、生态学、遗传学、生化学与人类学等知识。
鉴定技术在微生物分类鉴定和研究中发挥十分重要的作用，如确定食品污染中的病原菌、确定土壤中的益生菌、确定自然生态系统中的微生物群等。
二、分离技术分离技术是将混合物中的微生物单元分开，主要包括单菌分离和纯菌培养两个步骤。
单菌分离利用对微生物的生长特点，通过变形培养、酶切和物理分离等手段提取单个菌单元；纯菌培养是将分离出的单个微生物菌单元在合适的培养基上培育，从而获得单一的纯菌培养物。
分离技术是微生物学中最基础、最原始的技术，主要用于检测、分离和鉴定微生物的种类和数量。
采用分离技术对微生物进行分离和纯化，可以排除影响微生物研究的干扰因素，从而帮助研究人员更准确地刻画微生物的特性和生态功能。
三、培养技术培养技术是指将微生物体系移植至特定的培养基中进行培育的过程，可分为常规培养和特殊培养两种。
常规培养主要是将微生物体系在营养丰富的培养基上进行培育，包括液体培养和固体培养；特殊培养则是指使用特定的培养基和条件对某些微生物进行培养。
培养技术可以帮助研究人员获得微生物样品，便于研究微生物的特性和生态功能。
不同类型的微生物需要在不同的营养基上进行培养，通过调整培养条件，可以影响微生物的生理生化特性，进而研究微生物对外界环境的响应机制。
四、纯化技术纯化技术是指将杂质和其它污染物从分离出的微生物单元或培养物中去除，使其成为单一的微生物纯种。
纯化技术主要包括精细过滤、免疫沉淀、离心沉淀、磁珠分离和柱层析等，其中柱层析技术应用最为广泛。
纯化技术对于微生物研究至关重要，可大幅提高微生物的纯度和活性，从而更好地揭示微生物的功能和代谢途径。
微生物的分类鉴定技术.
实训材料与仪器： 普通光学显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等
实践操作 普通光学显微镜的使用
显微镜的安置 光源调节
确定观察部位 浸油观察
显微镜使用后处理
• 一手握镜臂，一手托 镜座，保持镜体直立。 放置水平桌面上。
• 坐姿端正，两眼同时 睁开操作，必要时左 眼观察，右眼绘图或 记录。
1674年，荷兰布商列文·虎克(Antonie van Leeuwenhoek,1632～1723)（上图）为了检查布 的质量，亲自磨制透镜，装配了高倍显微镜（300 倍左右）（下图），并观察到了血细胞、池塘水 滴中的原生动物、人类和哺乳类动物的精子，这 是人类第一次观察到完整的活细胞。列文·虎克把 他的观察结果写信报告给了英国皇家学会，得到
• 由于空气与玻片的密度不同，使光 线受到曲折，发生散射，降低了视 野的照明度。若中间的介质是一层 油（其折射率与玻片的相近），则 几乎不发生折射，增加了视野的进 光量，从而使物象更加清晰。
物镜与油镜系统镜光线通路
显微镜使用中的注意事项
字形叉开置于载物台上（或将载物台下降到最低点），最 后将显微镜送回箱内。
问题探究
1、普通光学显微镜的构造及原理
目镜 镜筒
物镜转换器 接物镜
弹簧夹 载物台 聚光器 虹彩光圈
光源
标本移动螺旋
镜座 电源开关
镜臂 微调螺旋 粗调螺旋
光源滑动变阻器
普通光学显微镜的成像原理
光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以 供人们提取微细结构信息的光学仪器。
观察部位的确定
将标本片放在载 物台上，使标本位于 物镜下方。先用低倍 镜观察，转动粗调节 螺旋，缓慢提升镜筒 （或下降载物台）使 物镜与标本距离拉大， 当出现物像时，改用 细调节螺旋，上下微 微移动，直至物像清 晰后，用推进器找到 理想的观察部位。
微生物检验的基本操作技术
1）、在固体培养基上，观察： 菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶
性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特 征及迁移性等； 2）、在液体培养中： 表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等； 3）、半固体培养基穿刺接种：
观察运动、扩散情况。
1.点状 2.圆形 3.丝状 4. 不规则形 5.假根状 6.纺锤 状
d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及 表面特征（光滑、颗粒、皱状）；
e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则 主要观察是否产酸和有无气体。
5）、穿刺接种法（半固体接种）
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以 用于观察细菌的某些生化反应。 （1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管； （2）以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中 心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能 完全刺到管底），接种针应沿原路退出； （3）经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长， 线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清， 或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细 菌有动力。
③ 处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随 意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无 菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
2、超净工作台
超净台的使用与保养: （1）风速保持在0.32-0.48米/秒; （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上; （3）让超净台预工作10－15分钟; （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干
（1）取菌技巧 D
1. 调整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取 范围 200 ~ 1000μl)
2. 插上灭过菌之 Tip
(用力插紧)
临床微生物学检验技术
二、染色标本
· 细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、 排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类，因 此染色标本的检查在细菌的初步鉴定中应用最广，起 着非常重要的作用。
· （一）常用染料：酸性染料、碱性染料、复合染料。 · （二）常用的染色方法：革兰染色、抗酸染色、
荧光染色。
革兰染色
三、生化反应
（一）碳水化合物的代谢试验 1.糖（醇、苷）类发酵试验
原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶， 因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分 解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌 对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力， 可用以鉴定细菌种类。
方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中， 35℃孵育48~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示 剂，立即观察结果。
结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔 红色为弱阳性。
应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠 埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠 杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌 属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。
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革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结
晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革
兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形
成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。
2. 染色方法
1 标本涂片、干燥和固定。 2 染色：在已固定细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴， 室温作用1min，用细流水轻轻冲洗，甩去积水。再滴 加碘液数滴，室温作用1min，冲洗。滴加95%酒精数滴， 轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片， 使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的 酒精无色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。 再滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细流水冲洗。 3 标本染色后，晾干或用吸水纸吸干，滴香柏油后 用油镜观察。
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微生物常规鉴定技术一、形态结构和培养特性观察１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。
，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。
因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。
霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
二、生理生化试验微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有：１、糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。
可用指示剂及发酵管检验。
试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。
接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。
一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。
２、淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。
淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。
然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。
立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。
阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。
淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。
培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。
淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。
某些细菌能够分泌淀粉酶（胞外酶），将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。
淀粉被水解后遇碘不再变蓝色。
（1）将装有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水浴中融化，然后取出冷却至50℃左右，即倾入培养皿中，待凝固后制成平板。
（2）翻转平板使底皿背面向上，用记号笔在其背面玻璃上划成两半，一半用于接种枯草芽孢杆菌作为阳性对照菌，另一半用于接种试验菌大肠杆菌或产气肠杆菌。
接种时用接种环取少量菌在平板两边各划“+”字。
如图7-1-1。
（3）将接完种的平板倒置于37℃恒温箱中，培养24h。
（4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。
如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。
透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。
３、V-P试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
试验方法：１）O’Meara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养48h，培养液1ml加O’Meara试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1~2min，静置于室温或36±1°C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。
亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。
２）Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。
３）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。
不产酸的培养物不能使用。
本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。
在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。
４、甲基红（Methyl Red）试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。
迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。
故在pH5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。
５、靛基质（Imdole）试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h 时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。
６、硝酸盐（Nitrate）还原试验有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。
亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
试验方法：临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。
用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。
进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。
α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。
７、明胶（Gelatin）液化试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。
试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。
于20~22℃培养7~14天。
明胶高层亦可培养于36±1℃。
每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。
平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10~20min后，菌落周围应出现清晰带环。
否则为阴性。
８、尿素酶（Urease）试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。
尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。
其活性最适pH为7.0。
试验方法：挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±1℃培养10，60和120min，分别观察结果。
或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。
培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。
９、氧化酶（Oxidase）试验氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。
阴性者无颜色改变。
应在数分钟内判定试验结果。
10、硫化氢（H2S）试验有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1℃培养24~28h，培养基呈黑色为阳性。
阴性应继续培养至6天。
也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置36±1℃培养1~6天。
纸条变黑为阳性。
11、三糖铁（TSI）琼脂试验试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。
葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。