农杆菌介导的瞬时表达系统

农杆菌介导的瞬时表达系统

一．溶液配制

乙酰丁香酮AS 0.1M，取0.101gAS溶于5mLDMSO中，在工作台上用灭过菌的0.45μM滤膜过滤,分装入无菌小管，-20℃冰冻保存；

MES 1M 调pH=5.6，过滤除菌；

MgCl2 1M 过滤后灭菌；

Kan 终浓度100mg/ml，过滤除菌。

(AS ，MES均购自泰安齐旺试剂公司)

YEB过夜培养液(30ml)

MES AS Kan 10mM

20μM

50μg/ mL

300μl

6μl

15μl

悬浮培养液(50ml)

MES 10mM 500μl AS 200μM 100μl MgCl2 10mM 500μl YEB培养基(pH 7.2)

酵母膏

牛肉膏

蛋白胨

蔗糖

MgSO4·7H2O 1g/L

5g/L

5g/L

5g/L 493mg/L

二．操作步骤

1. 挑起单个农杆菌菌落，接种3mL YEB培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜，储存时间比较长的菌液可多活化两次；

2. 接种2mL过夜培养的50mL的YEB液体培养基（含抗生素，10mM MES和20μM乙酰丁香酮），28℃摇床培养2-4h；

3. 将上述过夜培养菌液在4℃，8000g下离心6min，收集菌体；

4. 用渗透培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞。调节浓度OD600至0.5-1.0（一般需要100-150mL渗透培养液），置室温培养至少3小时，无需振荡；

5. 对需要渗透处理的烟草植株无一定大小要求，一般4-5叶期，已经生长一个月左右的本生烟比较合适。一般渗透处理下部2-3个比较大的叶片。用针头在需要渗透处理的叶片背面非常细微地扎一细小的浅微孔，然后用3mL的无针头的注射器吸取2-3mL悬浮有农杆菌的渗透培养液，从针孔处将培养液轻微的注入叶片内。注意用一手指从叶片下面拖住叶片，将注射器平平地堵住针孔，不让液体从叶片边缘挤压出来。注射区域接近叶片边缘即可或根据自己的实验目的决定；

6. 将处理过的烟草放回温室，照常管理。一般沉默发生在2-5天内；

7. 在暗室里，利用长波紫外灯（MODEL SB-100P/F,365nm）观察渗透处理过的叶片，并拍照记录叶片侵染区绿色荧光表达的变化过程。