药品微生物检验及方法验证

药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。

第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。

器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。

培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。

固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。

煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。

万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。

液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。

万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。

消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。

表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。

可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。

另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。

第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。

首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。

进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。

穿戴好后通过缓冲间进入无菌操作间。

实验前先对工作台面进行消毒，然后再摆放实验用品。

实验中供试液的制备是一个关键环节。

针对不同的供试品性质制定不同的制备方法，原则上整个过程不得损伤供试品中污染的微生物，也不得污染供试品。

在吸取供试液时，使用的吸管容量和最小刻度要和吸取的供试液量相匹配，不能使用10ml的吸管吸取1ml的供试液，以免造成误差过大的情况，影响结果。

吸取供试液时应当取均匀的液体注皿或者稀释，取上清夜或沉淀物必然对结果产生影响，因为中药口服制剂一般都含药材原粉，不能溶解于稀释液当中，只能以小颗粒分散在液体中，这些颗粒上边会附着有一部分微生物，供试液的制备过程不能把附着在颗粒上的微生物全部洗脱到液体中，而且各种微生物细胞的沉降系数各不相同，在静置状态下，它们在液体中的分布也是不均匀的，所以必须取振摇均匀的供试液（混悬液）。

在无菌操作的过程中，应当注意一些细节，特别是瓶口试管口以及镊子剪刀等的灼烧灭菌和擦拭消毒。

剪刀用消毒液擦拭消毒后必须烤干或者凉干再使用，避免剪刀上残留的消毒液杀死供试品中的微生物。

往平皿里加注供试液时，注意应当缓缓注入，速度过快容易造成液体飞溅，吸管壁残留液体过多，导致污染操作台面、器皿，培养皿中供试液量不足，影响结果。

实验中手臂不要有大的动作，不宜快速移动。

净化台上物品的摆放应当有一定的顺序，尽可能地减少来回交叉动作，因为这样会导致层流净化台中气流紊乱，容易引起污染也容易碰倒容器，发生意外。

倾注培养基时，以培养基能够覆盖平皿底部为好，大概在15-20ml，不宜过多或过少。

如过多则在摇匀时容易溢出皿外，过少则会营养不足，且在培养过程中容易干裂甚至不能覆盖平皿底面，影响微生物生长。

摇匀时应以平皿中供试液分布均匀即可，如果供试液颜色较浅不便于观察，一般可以顺逆时针交替摇20次左右即能达到均匀分布。

从开始制备供试液到倾注培养基，时间不得超过1小时，否则供试液中的微生物有可能死亡或者繁殖。

做完实验后，关掉电源，工作台面进行消毒，最好对房间地面也进行消毒。

所有工作都进行完毕之后，将培养皿及实验过程中使用到的、不宜在无菌室存放的器皿和试剂等通过传递窗传递到室外，将霉菌（酵母菌）、细菌、致病菌分别放入各自适宜的温湿度环境培养。

霉菌（酵母菌）一般置23~28℃培养48~72小时；细菌置30~35℃培养24~48小时；致病菌置37℃培养18~24小时培养，必要时延长至48小时。

逐日观察。

第三部分：菌落计数及报告单填写按照《中国药典》2005年版规定，细菌以48小时菌落数字报告，霉菌（酵母菌）以72小时菌落数字报告，必要时延长至5~7天。

菌落蔓延成片的平皿不宜计数，霉菌菌落为丝状的集合体，在菌落较小时肉眼难以看清楚，因此培养时间一定要足，必要时可以延长培养时间。

致病菌通常有大肠菌群和大肠埃希菌以及沙门菌，一般都需要进行增菌培养，增菌培养液不能作为鉴别致病菌检出与否的依据，必须做进一步的分离培养和生化鉴别。

平皿计数完毕后，再将菌落数字及鉴别情况填写在报告单上。

菌落数字的报告规则为：选取细菌、酵母菌菌落数在30~300之间，霉菌菌落数在30~100之间的稀释级别，作为菌落数报告的依据。

具体计算方法见《中国药典》2005年版一部附录72。

当菌落数大于100时，采用数字修约方法保留两位有效数字：四舍六进五留双。

第三位数字如果小于等于四就舍去，如果大于等于六就向前进一位，如果是五则看五前边的数字，是奇数五进一位，是偶数五舍去。

另外，当同一稀释级别的两个平皿上的菌落平均数不小于15时，则两个平皿的菌落数字不能相差一倍或以上。

包材的检验由于稀释倍数不规则导致结果数字比较复杂。

以面积为单位制备供试液的有PVC和镀铝膜，一般都是擦拭100平方厘米的面积，再将棉签剪入30ml的稀释液中，取1ml注皿或者稀释，这样稀释倍数就是1：30，1：300如此类推，最后各级别的菌落数都要乘以30，300等等作为结果报告。

以个体为单位制备供试液的有各种规格的瓶子，一般取三个，以瓶子的容积为限将体积等于一瓶容积的稀释液分别等量加入三个瓶子中，充分振摇后再折到一起，摇匀，取1ml注皿或者稀释。

最后稀释倍数应当是瓶子的体积除以3作为基数，依次增大10倍。

牛黄消炎丸小瓶和小金丸用的指形瓶因个体太小，不宜采用前边的方法，目前也没有现成的规定可循，我个人认为取10个置100ml的稀释液中充分摇匀作为1：10的供试液较好，最后可以报告为cfu/瓶。

第四部分：致病菌检验致病菌检验有其不同于计数检验的地方，因此单独叙述。

口服制剂需要检验的致病菌有一下几种：大肠埃希菌，大肠菌群，沙门菌；外用制剂需要检验的致病菌有：金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，深层伤口用制剂还需要检验生孢梭菌。

标准规定，除大肠菌群外致病菌一律不得检出。

大肠菌群是一类能在36℃培养24h内发酵乳糖产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌.它主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌、枸椽酸杆菌、克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌，一般采用发酵法进行检查，按照最大可能数原则报告检验结果。

凡经过验证的产品，其致病菌检验均不需要做阳性对照试验。

致病菌检验属于定性检验，对于除大肠菌群之外的其他检验菌种，都要求鉴别到种。

菌种鉴定一般从菌落形态，细胞形态（革兰氏染色），生化反应等方面进行试验。

增菌培养是为了让污染到药品中的致病菌进行恢复生长，为后续的分离培养和生化试验做准备，以提高检出率。

培养液的操作（分离培养等步骤）必须在阳性室进行，实验过程中注意保护自己，如果发生培养液外漏污染台面等情况时，不要惊慌，立即将蘸有消毒剂的抹布扑在污染处，停留一定时间后再将其擦干。

第五部分：异常检验结果的处理微生物检验偶尔会出现结果异常的情况，在中药制剂的检验中尤为多见。

究其原因，跟中药制剂成分的复杂性和药材来源的多样性以及加工过程的粗放性等有关系。

复杂的成分常常引起不确定的抑菌性，药材来源的多样性和加工过程的粗放性往往使污染微生物的数量处在大幅的变化之中。

总体来说，产生的异常结果通常有以下几种：1、培养皿上菌落过多无法计数；2、高稀释级培养皿上菌落数大于或接近于低稀释级；3、同一稀释级各培养皿菌落数差异过大；4、阴性对照平皿有菌生长；5、似是而非的酵母菌。

首先分析一下出现上述结果的可能原因。

1、培养皿上菌落过多无法计数。

有两个可能的原因：供试品本身污染较为严重；实验过程污染。

究竟怎么区分是供试品本身的问题还是实验过程的问题，很大程度上需要相当的经验积累，需要从菌落的生长情况和形态的差异性等方面进行判别，一般人为污染的微生物其菌落形态较为单一，而供试品本身污染的微生物则菌落形态较为多样化。

最终确定结论还应当结合各稀释级别平皿上的情况和阴性对照以及其他供试品的情况综合判别。

2、高稀释级培养皿上菌落数大于或接近于低稀释级。

原因一：供试品有抑菌性，在高浓度时抑制微生物生长；原因二：稀释不均匀。

可能的情况是吸取了低稀释级供试液的上清液注皿，而在稀释下一个级别时吸取了较为均匀的或者下层沉淀的供试液；原因三：操作过程污染。

3、同一稀释级各培养皿菌落数差异过大。

平行实验各次吸取的供试液不均匀，或者是倾注培养基后没有充分摇匀，导致某一个平皿上的若干个微生物细胞因为重叠在一起而形成了同一个菌落，另外一个原因仍然是操作过程污染。

4、阴性对照平皿有菌生长。

无疑这是实验过程本身的问题，分析其污染的原因，也有这么几个可能：一是稀释液污染，二是培养基污染，三是器皿污染，四是操作污染。

如果是前两个原因，污染肯定是大面积的，也就是说在其他的平皿上也肯定有异常情况出现；如果器皿灭菌不到位，也会出现大面积污染的情况；操作过程污染属于偶然的个别现象，不会形成大面积的污染。

5、似是而非的酵母菌。

这个问题在含有药材原粉的中药固体制剂当中比较容易出现。

目前药典规定的培养酵母菌和霉菌的培养基是玫瑰红钠琼脂，该培养基的选择性不是特别高，一部分细菌仍然可以在玫瑰红钠琼脂平皿上生长，而且一部分细菌的菌落和某些酵母菌的菌落从其形态上也很难做出区分，往往让人觉得似是而非。

针对上述几种异常现象和可能的原因，经过实践和参考相关的资料，提出解决办法。

首先，检验结果出现异常时，不论何种原因引起，从工作流程上来说，都必须安排另一名检验员进行复检，以确保检验结果的准确性。

分析原因只是为了在以后的工作当中进行改进，避免出现同类问题。

其次，如果判断是稀释液、培养基和器皿灭菌不到位引起的污染，原则上培养基和稀释液应当灭菌后弃去，重新配制，器皿可以重新清洁后再次灭菌，注意灭菌的时间和温度等参数必须符合规定。

如果判断是供试品本身带菌较多，在复检时应当增加适当的稀释级，但最低稀释级的稀释倍数不宜过大，否则会导致误差太大而无法做出准确的结论。