08药品微生物限度检测技术
8种医院制剂微生物限度检查法验证
图1 CT示 双 肺 广 泛 囊 状 影 多 为圆形或卵圆形等
图2 左侧联合线区弧形异常 透亮无肺纹理带
PLAM需与下述相鉴别： 结节病双侧肺门对称性增生为本 病 特 征 ，晚 期 X线 表 现 与 PLAM一 致 （肺 内 纤 维 化 ，小 结 节 及 大 的 囊 腔 ）。临 床 表 现 及 发 病 人 群 的 特 征 性 与PLAM差 别 较 大 ，一 般 发 病 于 幼 儿 ，死 于 成 年 之 前 ，侵 肺 仅 占0.1%，乳 糜 胸 少 见 ，极 少 侵犯淋巴管[4]。组织细胞增生症主要发生 于 中 青 年 ，60%的 病 例 病 变 局 限 于 肺 ，最 后 导 致 纤 维 化 ，甚 至 蜂 窝 肺 。CT表 现 以 中 上 野 肺炎为主，有些可形成空洞而含气囊腔，含气囊腔是本病的典 型表现，同时伴有多发结节影，进展期囊腔大，小叶间隔厚。小 叶中央型肺气肿的低密度区无明确的壁，分布不均匀，在低密 度影中可见小叶中央动脉。而肺淋巴管肌瘤病的低密度影有明 确均匀薄壁，分布均匀，血管影位于囊状影边缘。另外结合发病 年龄、性别等因素有助于鉴别 支气管扩张可呈多发囊状影，有 明确的壁，壁通常较厚，沿支气管树分布，在肺周围部较少见， 常同时可见呈轨道征的支气管扩张。
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状 影 直 径<12 mm，多 为 圆 形 或 卵 圆 形 ，少 数 为 不 规 则 形 ，囊 壁 为 均 匀 的 薄 壁 ，大 多 数 厚 度<1 mm。双 肺 病 变 对 称 、弥 漫 、均 匀 分布。 左侧前联合线区可见弧形异常透亮无肺纹理带， 见图 1，2)。
现代医药卫生 2010 年第 26 卷第 16 期
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料 受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、真菌数、酵母 菌数及控制菌数。《中国药典》2005年版规定， 当建立药品的微 生物限度检查法时，应进行细菌、真菌及酵母菌计数方法的验 证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、真菌及酵母菌 数的测定。含抑菌成分的医院制剂的微生物限度检查，必须消
药品的微生物限度检查
24～48h
紫红胆盐葡 萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量 肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐 葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌 增菌 培养 基
供试液的制备
书写检 验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢 酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有 菌 落
确证 试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀 释 液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌 培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据 处理
结果观察与计数
书写检 验记录
平板 接种
需氧菌 的培养
供试液 的制备
配培养基和稀释液
倒置 培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml
药品微生物限度检测技术PPT课件
检
喷雾剂供
查
试品
1.4.2供试品检查
非
无 菌
① 平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法
产
品 微 生 物 限 度 检 查
除另有规定外， 取规定量供试 品，按方法适 用性试验确认 的方法进行供 试液制备和菌 数测定，每稀
培养和计数 ：除另有规定外， 胰酪大豆胨琼脂培养基平板 在30～35℃培养3天，沙氏葡 萄糖琼脂培养基平板在20～ 25℃培养5 天，观察菌落生 长情况，点计平板上生长的 所有菌落数，必要时可适当 延长培养时间至7 天进行菌落
微
生
1.3.3计数方法适用性试验
物
限
度
检
查
非 无
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
菌 1.3.1菌液制备及使用
产 品
菌种
微
试验用菌株的传代次数不得超过5
生
代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
物
限
种为第0代），并采用适宜的菌种
度
保藏技术进行保存，以保证试验菌
检 查
株的生物学特性
检
查
非
② 薄膜过滤法
无
除另有规定外，按计数方法适用性试
菌
验确认的方法进行供试液制备。取相
产
当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试 液，若供试品所含的菌数较多时，可
品
取适宜稀释级的供试液，照方法适用
微
性试验确认的方法加至适量稀释液中， 立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜， 培养和计数：培养条件
生
菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基 和计数方法同平皿计数
值报告菌数
非
③ MPN 法
无
微生物限度检测方法
微生物限度检测方法微生物限度检测是指在药品、食品、化妆品等产品中，对微生物的数量和种类进行检测，以确保产品的质量安全。
微生物限度检测方法的选择和执行对产品的质量控制和安全性评价具有重要意义。
本文将介绍常见的微生物限度检测方法及其应用。
一、培养法。
培养法是一种常见的微生物限度检测方法，它通过将样品接种在适当的培养基上，利用微生物在培养基上生长、分裂和形成可见的典型菌落的特性，来检测微生物的数量和种类。
培养法主要包括菌落计数法、膜过滤法等。
菌落计数法是将样品均匀涂布在含有营养物质的琼脂平板上，经过一定时间的培养后，根据菌落的数量来确定微生物的数量。
膜过滤法是将样品过滤到孔径为0.45μm的膜上，然后将膜放置在含有营养物质的琼脂平板上培养，根据在膜上形成的菌落数量来确定微生物的数量。
二、生物学法。
生物学法是利用微生物的生物学特性，通过培养微生物或者利用生物学试剂来检测微生物的数量和种类。
生物学法主要包括酶标记法、PCR法等。
酶标记法是利用酶标记的抗体或抗原来检测微生物的数量和种类，其原理是将酶标记的抗体或抗原与待检测微生物发生特异性反应，然后通过酶反应产生显色物质或荧光物质来进行检测。
PCR法是利用聚合酶链式反应技术，通过扩增微生物的特异基因序列来检测微生物的数量和种类。
三、物理化学法。
物理化学法是利用微生物的生理生化特性，通过测定微生物的生长代谢产物或者利用特定的物理化学性质来检测微生物的数量和种类。
物理化学法主要包括ATP生物发光法、流式细胞术等。
ATP生物发光法是利用微生物在生长过程中产生的ATP来进行检测，通过测定样品中的ATP含量来确定微生物的数量。
流式细胞术是利用流式细胞仪对微生物进行快速、高效的检测和鉴定，通过测定微生物在流式细胞仪中的光散射和荧光信号来确定微生物的数量和种类。
综上所述，微生物限度检测方法多种多样，每种方法都有其适用的范围和特点。
在实际应用中，需要根据产品的特点和检测的目的选择合适的检测方法，并严格按照相应的标准和规范进行执行，以确保产品的质量安全。
微生物限度检查基本技术
（3．1．4）、操作的注意事项 制备的供试液力求分散均匀，使之菌体能均匀分散，其次在每次吸取供试液注皿的时候，都要 把供试液摇匀，这样能使两个平板上生长的菌落数比较接近。 浇注培养基的温度不能高，浇注好的平板摇匀后即要求冷却，不要把平板垒起来，这样不利于 冷却。 操作时间不能太长，一般要求从供试品稀释到注皿的时间不要超过1小时，因为有些活力较好 的菌体在制备供试液的过程中就可行细胞分裂，这样测得的菌数就不能代表原始的污染程度。另外， 供试液的平皿底部接触时间太长，会使菌液药渣附着不宜摇散。 可以在培养基中加0.1‟的TTC 。 （3．2）、薄膜过滤法 采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗 量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶液不影响微生物的充分被截留。滤器及 滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤 前先少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤 膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需 要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜 上的微生物受损伤。
（3）枯草芽孢杆菌(CMCC(B) 63501)
（4）白色念珠菌(CMCC(F) 98001) （5）黑曲霉(CMCC(F) 98003) (2．2)、菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂 养基中，培养18~24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基 中，培养24~28小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m1含菌数为50~100cfu的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5m10.9%无菌氯化钠溶液， 将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤 菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m1含孢子数50~100cfu的孢子 悬液
药品微生物限度检查方法介绍
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菌液的制备（3 菌液的制备（3）
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马 丁琼脂斜面培养基上， 23～28 ℃培 养5～7天，加3~5ml0.9％无菌氯化钠 溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 取1 ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml， 采用10倍递增稀释法，稀释至104~10-6，使细菌数约为50~100cfu/ml。
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供试液的制备（4 供试液的制备（4）
非水溶液性供试品 软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加到 含已灭菌溶化并45℃保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌混 匀后，慢慢加入45℃左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试品 充分乳化，作供试液（1:20）。 油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯—80 5 –8ml，摇匀，再加 入稀释剂至100ml。
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药品微生物限度检查方法介绍
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2005年版微生物限度标准的应用
• 微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生 物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、 工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学 评价的综合依据之一。 • 药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料 的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药 品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查 均以本标准为依据。 • 检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及 控制菌的检 查。
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菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] 生孢梭菌(Clostridium 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941] 白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 白色念珠菌(Candida 黑曲霉(Aspergillus 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 大肠埃希菌(Escherichia 大肠埃希菌(Escherichia coli)) [CMCC(B) 44102] 枯草芽孢杆菌(Bacillus 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63501]
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
药典微生物限度检查法
微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时．如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35 ℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28 ℃。
检验结果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量（g 、ml 或cm2）。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100 cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于阳性对照试验）。
检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4 片。
一般应随机抽取不少于检验用星（两个以上最小包装单位）的3 倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，混匀，作为l:10 的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至1OOml ，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1:10 的供试液。
微生物限度检查操作规程
微生物限度检查操作规程微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠1.目的微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠建立一个微生物限度检查（包括细菌、霉菌、酵母菌）标准工作程序，规范QC微生物限度检查人员的微生物限度检查操作。
微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠2.范围微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠适用于本公司的细菌、霉菌、酵母菌的限度检测。
微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠3.责任者微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠QC微生物限度检查人员；质量管理部微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.内容微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.1检测准备微生物限度检查操作规程第2页/共6页文件类型操作规程（SOP）文件编号编制人编制日期年月日编制部门审核人审核日期年月日审核部门批准人批准日期馋架丘墨症纫青嘴葫碟弱嫉亦幽两膳苍灾四绒才煌赠阎股能陵副谦熙之诉康楼稳凋较佣蕊鉴丫怠稀只兼渍肉琐腾斥玛许卉圾誉歧叙厕班夷翰挞琳狠4.1.1 QC人员接到微生物限度检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定微生物限度检查所需的容器具、试液、培养基等的项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行微生物限度检查前的准备工作。
中国药典微生物限度检查法
中国药典微生物限度检查法
中国药典是中华人民共和国国家药品监督管理局编制的用于药品质量标准和规范的权威性文献。
其中，微生物限度检查是对药物产品中的微生物污染进行评估和控制的重要环节。
中国药典中的微生物限度检查法主要包括以下几个方面：
1.检测项目：微生物限度检查主要关注细菌、真菌和酵母菌
的存在与数量。
通常会检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霉
菌和酵母菌等常见微生物。
2.样品准备：样品准备过程中，要根据具体要求制备适当稀
释的样品溶液。
根据不同产品的特点和要求，可能需要使
用适当的培养基进行预处理。
3.检测方法：中国药典中提供了一系列的微生物限度检测方
法，包括涂片法、水洗法、滤膜法等。
这些方法可以根据
不同的样品类型和特性选择适合的检测方法。
4.培养和观察：按照检测方法的要求，将样品接种在适当的
培养基上，进行培养并观察一定时间。
观察期间，需要注
意各种细菌、真菌和酵母菌的生长情况。
5.计数和判定：根据培养结果，进行微生物数量的计数，并
与规定的限度标准进行比较。
根据比较结果，判定样品是
否符合微生物限度标准。
通过微生物限度检查，可以评估药物产品中的微生物污染状况，并确保其在接受者使用时的安全性。
中国药典中的微生物限度
检查法为药品质量控制提供了重要的指导和标准。
微生物限度检测方法
微生物限度检测方法
微生物限度检测方法是指用于确定特定微生物在某种产品中的存在情况的检测方法。
微生物限度检测方法主要包括菌落计数法、培养方法、生化方法和分子生物学方法等。
1. 菌落计数法：这是一种常用的微生物限度检测方法，主要是通过将样品加入适当的培养基，经过一定的时间后，观察产生的菌落数目来估计微生物的数量。
可以通过直接计数，也可以通过稀释系列来测定数量。
2. 培养方法：培养方法是将样品加入含有适宜营养成分的培养基中，在一定条件下培养微生物，通过观察生长情况、形态特征、生理生化特性等来确定微生物的存在与否。
常用的培养方法有液体培养和固体培养。
3. 生化方法：生化方法是通过检测微生物生长过程中释放的代谢产物来确定微生物的存在与否。
常用的生化方法有气体生成法、乳酸生成法、酶活性测定等。
4. 分子生物学方法：分子生物学方法主要利用特定微生物的DNA或RNA序列进行检测。
常用的分子生物学方法有聚合酶链反应（PCR）、实时荧光PCR、核酸杂交等。
以上是常见的微生物限度检测方法，不同方法的选择取决于具体的检测要求和需求。
药品微生物限度检验方法标准操作规程.(DOC)
标准操作规程目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。
范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。
责任者：QC主任、化验员。
规程：本规程引至《中国药典》2000年版。
1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。
我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。
无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。
2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。
抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。
3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。
供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
4. 检查：4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。
4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。
使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。
除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。
制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。
4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。
4.4. 复检4.4.1. 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。
4.4.2. 以复试项下不合格项目为准，作单项复试。
微生物限度检查法操作规程
2023 WORK SUMMARY
微生物限度检查法操 作规程
REPORTING
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目录
• 介绍 • 微生物限度检查法操作规程 • 注意事项 • 常见问题及解决方法 • 未来展望
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培养条件
设定适宜的培养温度、湿 度、pH等条件，以保证微 生物的正常生长。
培养时间
根据不同微生物的生长周 期和特点，确定适宜的培 养时间，以保证微生物充 分生长。
微生物培养
培养基选择
根据待检测微生物的种类 和数量，选择适宜的培养 基，确保能够满足微生物 生长的需求。
培养条件
设定适宜的培养温度、湿 度、pH等条件，以保证微 生物的正常生长。
实验环境防护
实验过程中应保持室内空气流通，避 免尘埃、细菌等污染。
实验器材防护
实验器材应保持清洁、干燥、无菌， 使用前应进行灭菌处理。
实验试剂防护
实验试剂应妥善保管，避免污染和交 叉污染。
实验后的清理与消毒
实验器材清理
实验结束后，应对实验器材进行 清洁、灭菌处理，并妥善保管。
实验环境清理
实验结束后，应对实验环境进行清 洁、消毒处理，保持室内空气流通。
行微生物检测和控制。
PART 02
微生物限度检查法操作规 程
PART 02
微生物限度检查法操作规 程
样品采集与处理
01
02
03
采样原则
在无菌条件下进行，避免 交叉污染和环境对样品的 污染。
采样方法
根据不同样品类型，采用 适宜的采样方法，如随机 采样、分层采样等。
样品处理
将采集的样品进行预处理， 如粉碎、混合、稀释等， 以便进行后续的微生物培 养和计数。
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
中国药品检验标准操作规程微生物限度检查法
微生物限度检查法一、细菌、霉菌和酵母菌计数１简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。
也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。
以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。
该法测定结果只反映在该规定条件下所生长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。
不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。
一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。
因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。
2 设备、仪器2.1 设备2.1.1 洁净实验室微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。
2.1.1.1 结构和要求洁净实验室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。
操作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。
洁净实验室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间内不应安装下水道。
洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LX。
2.1.1.2 温度、湿度洁净实验室内的温度应控制在18～26℃，相对湿度最好在40％～60％。
2.1.1.3 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于5Pa。
操作台上备有药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。
2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明
中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉 末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性 菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以 验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影 响试验结果
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
项目三：药品微生物限度检测技术
验证试验 特
征
30-35℃ 24-48h
菌
落
产酸：黄色 产气：气泡
紫黑色/桃 红色
49
二、控制菌检查－大肠菌群检查
★大肠菌群检查结果报告－大肠菌群MPN表
各供试品量的检出结果
最可能的大肠菌群数N
1.0g或1.0ml 根0.1据g或发0.酵1ml乳糖0.0产1g或酸0产.01气ml ，平（个板/g上或m有l）
①大肠埃希菌 ②大肠菌群 ③沙门菌 ④铜绿假单胞菌 ⑤金黄色葡萄球菌 ⑥梭菌
①细菌数检查 ②霉菌和酵母菌检查
微生物总数检查 控制菌检查
6
给药途径 细菌数
霉菌和酵母数 （每1g、1ml或10cm2）
大肠埃希菌 （每1g、1ml或10cm2）
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌
沙门菌 （每10g或10ml）
霉变、长螨
46
二、控制菌检查－大肠菌群检查
★大肠菌群
大肠菌群是指37℃生长时 能发酵乳糖，在24h内产酸产气 的革兰阴性无芽胞需氧及兼性 厌氧杆菌。
47
二、控制菌检查－大肠菌群检查
★大肠菌群检查意义
大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随 粪便排出体外后可直接污染药品，若产品中 检出该菌群，表明该产品受到粪便污染，可 能存在肠道致病菌并引起疾病，药品不得检 出。
53
空白 对照
四硫磺酸钠亮绿 培养基
黑色 菌落
半透明 菌落
2021/10/23
SS培养基
麦康凯培 养基
54
二、控制菌检查－沙门菌检查
★沙门菌检查结果报告
检出沙门 菌
革兰阴性杆菌 三糖铁反应及生化反应符合沙门菌属反应
大肠埃希菌为条件致病菌，当人体免疫力 低下或是侵入肠外组织、器官，可引起肠外 感染，乃至败血症。也可随人和动物的粪便 排出体外，污染环境，在药品中不得检出。
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10-1
1.0ml 10-2 1.0ml 10-3
9.0ml
9.0ml
23~28℃
倒置培养5d
玫瑰红钠 琼脂培养 基
稀 9.0ml
释 液
对照
对照 1.0ml
对照 对照
20
Viable cell count
1 ml
1.dilute sample
9 ml
10
100 1000 104 105 106 107
30
一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查
3.操作注意事项
1.尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成 一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。
2.为防止细菌增殖及产生菌苔，制 成供试液后，应尽快稀释，注皿。 一般稀释后应在1小时内操作完毕。
31
一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查
3.操作注意事项
3.使用吸量管时，应小心沿管壁加入，不 用触及管内溶液，以防吸管尖端外侧黏附 的溶液混入其中。
①大肠埃希菌 ②大肠菌群 ③沙门菌 ④铜绿假单胞菌 ⑤金黄色葡萄球菌 ⑥梭菌 ⑦白色念珠菌
6
①细菌数检查 ②霉菌和酵母菌检查
微生物总数检查
控制菌检查
给药途径 细菌数
霉菌和酵母数 （每1g、1ml或10cm2）
大肠埃希菌 （每1g、1ml或10cm2）
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌
沙门菌 （每10g或10ml）
验 对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性
证
进行验证。
13
二、药品微生物限度检测的基本条件
1.抽样方法
㈢ 正
确
①随机
抽
②优先抽有疑问样品
样
③抽样量：检测用量的3~5倍
14
二、药品微生物限度检测的基本条件
2.检测用量
㈢ 正
确
抽
①＞2个最小包装
样
②大蜜丸≥4丸
③膜剂≥4片
3.检测量
①半/固体制剂：10g ②液体制剂：10ml ③膜剂：100cm
含中药原粉、豆豉、神曲、动物组织 等口服制剂
鼻用制剂 洗剂 灌肠剂等
一、药品微生物限度检查意义
确定药物是否污染或其污染程度，控制药 品的质量；
保证用药的有效性和安全性； 可作为衡量药品生产全过程卫生水平的根
据之一。
5
二、药品微生物限度检测的内容
内容
无菌检查 微生物限度检查
非全检，检查种类与 剂型、给药途径、原 料来源等有关。
第八章 药品微生物限度检测技术
中药和生物系
1
第一节 药品微生物限度检测概述
中药和生物系
2
药品微生物限度检查定义
非规定灭菌制剂及其原辅料：微 生物的种类和数量必须限制在一定的 范围内或不得检出。
3
药品微生物限度检查适用剂型
非规定 灭菌制 剂及其 原、辅
料
4
部分口服给药制剂:口服液、酊剂、中 药丸剂、糖浆剂、散剂、特殊部位使 用的片剂（口腔帖片、阴道片、阴道 泡腾片、外用可溶片）
不得检出
铜绿假单胞菌 （每1g、1ml或10cm2）
不得检出
沙门菌
－
霉变、长螨
不合格
9
第二节 药品微生物限度检测条件
中药和生物系பைடு நூலகம்
10
一、药品微生物限度检测的特殊性
活体性和不稳定性 分布的不均匀性 多数处于受损伤状态 生态环境的多样性及复杂性
11
二、药品微生物限度检测的基本条件
检㈠查 环境 和人 员要
求
环境要求:无菌室内进行。背景洁净度 10,000级下的局部100级，单向流空气。 操作人员：卫生、着装符合要求。
操作要求：严格遵守无菌操作，严防污染。
12
二、药品微生物限度检测的基本条件
㈡
由于某些供试品具有抗菌活性，在建
方 立测定方法或原测定法的检验条件发生改
法 变时，可能影响检验结果的准确性，必须
第三节 药品微生物限度检测方法
中药和生物系
18
一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查
1.平皿法
供试液 的制备
混合平板 的制备
细菌、真 菌的培养
书写检验 记录单
19
数据 处理
检查结果、 观察与计数
一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查
1.平皿法
10倍递增稀释法
10g/ml 供试品
倒置培养3d
30~35℃ 营养琼脂 培养基
－（薄膜过滤法）
阴性对照： 取供试品微生物限度检查相应的溶
剂和稀释液同法操作，阴性对照不得长菌
29
一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查
－薄膜过滤法
结果判断 细菌总数 真菌总数
符合药典该品种项下限度规定
判定药物的细菌、 真菌总数检验合格
否则因从同一批次产品中重新抽样，独立复试 三次，以三次结果的品均值报告菌数
霉变、长螨
口服给药制剂 每1g不得过1000个。每1ml
不得过1000个。 不得过100个
不得检出
— — 含动物组织（包括提取物） 的口服制剂，不得检出 不合格
7
给药途径
细菌数 霉菌和酵母数 （每1g、1ml或10cm2）
大肠埃希菌 （每1g、1ml或10cm2） 金黄色葡萄球菌（每1g、
1ml或10cm2） 铜绿假单胞菌 （每1g、1ml或10cm2）
㈤ 结 果 判 断
17
供试品检出控制菌或其它致病菌时，按一次检 出结果为准，不再复试。
供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一 项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品 中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均 值报告菌数。
供试品的细菌数、霉菌和酵母数及控制菌三项 检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品 符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下 的规定，判供试品不符合规定。
15
二、药品微生物限度检测的基本条件
㈣ 培 养 条 件
16
检查菌
培养基
培养温度
培养时间
细菌数
营养琼脂
30℃～35℃
3 days
真菌数 玫瑰红钠琼脂
23℃～28℃
酵母浸出粉胨葡
酵母菌数
萄糖琼脂
23℃～28℃
控制菌
细菌：30℃～35℃ 真菌：23℃～28℃
5 days 5 days
二、药品微生物限度检测的基本条件
2. plate out 0.1 ml
21
一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查
2.薄膜过滤法
10g或10ml 供试品
10－1 供试液
取相当于1g或1ml 供试液用滤膜过滤、 冲洗
取下滤膜，菌面朝 上放培养基上培养
书写检验 记录单
数据 处理
结果观察 与计数
22
23
24
25
26
27
28
一、细菌数、霉菌和酵母菌数检查
沙门菌 霉变、长螨
8
眼部给药制剂 每1g或1ml不得过10个
不得检出
不得检出
不得检出
不得检出
－ 不合格
给药途径
直肠给药制剂
细菌数
每1g不得过1000个，每1ml不 得过100个。
霉菌和酵母数（每1g、1ml或 10cm2）
不得过100个
大肠埃希菌
不得检出
（每1g、1ml或10cm2）
金黄色葡萄球菌（每1g、1ml或 10cm2）