毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
比赤酵母表达载体
表1.2 Invitrogen公司开发的常见表达载体
Table 1.2 Pichia pastoris expression vectors provided by Invitrogen.
毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。
目前所采用的表达载体均为穿梭质粒，先在大肠杆菌保存、复制、扩增，然后线性化后被导入宿主酵母细胞。
常用的表达载体包括胞内表达载体及分泌表达载体（表1.2），主要是由启动子、终止子、外源基因克隆位点、选择标记、报告基因和复制起点等元件构成，分泌型载体还需要信号肽序列，如pPICZα、pPIC6α 和pPIC9K 的α-factor序列。
胞内表达适宜于不含二硫键的非糖基化蛋白，其表达水平较胞外高，但产物纯化较为复杂。
而需要翻译后修饰的蛋白，如抗体、细胞因子等一般选择胞外分泌表达。
蛋白被直接分泌到培养基中，而且酵母自身分泌的蛋白很少，更利于下游工作，也有助于形成糖基化的有活性天然构象[32, 90]。
His4组氨酸脱氢酶位点。
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
颍上新城质差室分分析案例摘要：随着VOLTE百日大会战的开启，我部对阜阳质差室分进行摸排分析，目前质差室分原因主要为馈线问题、室分泄漏、宏站与室分切换等，针对不同原因，采用工程维护、RF及工参优化等手段进行改善。
关键字：馈线问题、室分泄漏、工程维护、RF及工参优化【故障现象】：3月上旬，发现该XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3小区室分MR 覆盖率仅为90.1%，该室分覆盖东西两栋30层高层，其中1-4F为商场部分，未做室分覆盖，采样点较少。
【原因分析】：此类室分质差主要从以下几点分析原因：（1）是否存在告警及馈线驻波告警；（2）室分泄漏；（3）室内外切换重选参数是否合理；（4）馈线故障。
1.原因排查：（1）对该小区进行告警排查及驻波测试，无异常，驻波均值正常值范围内,如下图所示：（2）针对是否存在室内泄漏，对该小区周边楼宇进行测试，周边楼宇主要占用的信号为1.8G宏站FY-颍上-鑫都华庭-HFTA-437970-61、FY-颍上-颍上荣禾绿园-HFMA-436418-55。
XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3主要为平层覆盖，为发现室分泄漏。
（3）对颍上新城进行室内摸排，测试过程中，主要占用为室分信号，切换无异常，该楼宇室分覆盖如下所示：根据设计图纸及网管资料，该室分系统主要覆盖东西两单元30F及地下车库，现场摸排中发现，RSRP均值为 -75dbm，SINR均值为28dbm，室分整体覆盖良好，其中东西单元1-4F电梯室分覆盖效果较差，平均RSRP均值为-108dbm，SINR均值为2dbm，西单元的10-11F主要为宏站信号，该层怀疑为室分馈线故障导致，如下所示：并且根据设计图纸，该楼宇存在地下停车场，对该区域进行测试，发现，由于纠纷问题，原覆盖新城1-4F的商场部分的XY-FY-颍上-御水兰庭-HFTA-437017-2室分，未能覆盖该区域，该设备位于负一层电梯口附近的弱电井，设备AB口为临时接的蘑菇头，该设备只能覆盖电梯口至地下停车场之间走廊的部分区域，剩余区域则为弱覆盖区域，主要占用信号为为地下停车XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3室分覆盖，平均RSRP均值为-105dbm，SINR均值为6dbm。
毕赤酵母的培养基1
毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉% 氯化钠1% PH 大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL （博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。
MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）L酵母基本氮源；L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。
MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。
不同微生物的基本培养基是不相同的。
2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉% 氯化钠% PH 制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。
4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
［1］。
同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。
酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。
干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
毕赤酵母蛋白表达载体是什么？
毕赤酵母蛋白表达载体是什么？
毕赤酵母重组蛋白表达载体系统有着非常强大高效的重组蛋白表达能力。
毕赤酵母作为一种甲基营养型酵母，被广泛应用在蛋白产品的研究和工业应用上。
在该载体系统中，目的基因通常被克隆在甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（GAP）和乙醇氧化酶1启动子（AOX1）的下游，这取决于基因的基本结构和表达诱导条件的要求。
GAP是一个强大的组成型启动子，而AOX1则是受甲醇严格高效调控的启动子，这两个启动子都能够介导目的基因的高水平表达，目的蛋白的累加总量往往可达总细胞可溶性蛋白的30%以上。
一般来说，GAP启动子的表达能力略强于诱导状态下的AOX1启动子。
建议您做一个时间曲线测试，以确定表达目的蛋白的最佳启动子类型。
与酿酒酵母不同的是，毕赤酵母以甲醇为基础碳源，能更高水平地介导重组蛋白的表达（通常是酿酒酵母的的10-100倍）。
另外，毕赤酵母和酿酒酵母在技术上有许多共通之处（如互补作用），通用的基因注释和遗传命名法简化了两个物种的研究。
毕赤酵母常用培养基与载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
酵母表达体系
酵母表达体系毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的30%以上。
AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。
利用含有α因子序列的分泌型载体即可。
翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体：pPICZ A,B,and C，一：分子克隆1.设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture(各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlddHO up to 50μl2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl）DNA(空载体或目的基因) 30μlBamHⅠ 1.5μlXholⅠ 1.5μl10×Buffer K 4.0μl4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。
GS115毕赤酵母表达菌使用说明
编号
名称
北京华越洋生物 NRR01030 GS115 毕赤酵母表达菌
基 本 信 息 ：
名称：GS115 毕赤酵母表达菌
规格：300ul 甘油菌
储 存 温 度 ： -‐80℃
发突变为组氨酸野生型的概率一般低于 10-‐8。GS115 毕赤酵母可以在 YPD
培养基中生长，或者在补充有组氨酸的 minimal media 中生长，但是无法
在单独的 minimal media 中生长。GS115 毕赤酵母在做质粒转化的时候，
可 采 用 电 转 化 的 方 式 将 质 粒 转 入 。
基 因 组 ：
His4（ 基 因 5 是毕赤酵母菌株，是巴斯德毕赤酵母的一种，属于真核细胞。
一般的针对原核生物的抗生素例如卡那和氨苄对酵母是无效的，因此为了
操作说明：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
毕赤酵母适宜的生长温度是 28 至 30 度，温度超过 32 度对蛋白的表
达是有害的，并可能导致细胞的死亡。GS115 毕赤酵母是是组氨酸缺陷型
（His4 基因型），如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组
氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h
（必要时，可适当延长培养时间）。
毕赤酵母常用表达载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表黑系统之阳早格格创做Mut+战Muts毕赤酵母中有二个基果编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大普遍的醇氧化酶是AOX1基果产品，甲醇可稀切安排、诱导AOX1基果的下火仄表黑，较典型的是占可溶性蛋黑的30%以上.AOX1基果调控分二步：压制/去压制体制加诱导体制.简朴去道，正在含葡萄糖的培植基中，纵然加进诱导物甲醇转录仍受压制.为此，用甲醇举止劣化诱导时，推荐正在苦油培植基中培植.注意纵然正在苦油中死少(去压制)时，仍缺乏以使AOX1基果达到最矮火仄的表黑，诱导物甲醇是AOX1基果可辨表黑火仄所必须的.AOX1基果已被分散，含AOX1开用子的量粒可用去促进编码中源蛋黑的手段基果的表黑.AOX2基果与AOX1基果有97%的共源性，然而正在甲醇中戴AOX2基果的菌株比戴AOX1基果菌株缓得多，通过那种甲醇利用缓缓表型可分散Muts菌株.正在YPD(酵母膏、蛋黑胨、葡萄糖)培植基中，不管是Mut+仍旧Muts其正在对付数期删殖一倍的时间约莫为2h.Mut+战Muts菌株正在不甲醇存留的情况下死少速率是一般的，存留甲醇的情况下，Mut+正在对付数期删殖一倍的时间约莫为4至6个小时，Muts正在对付数期删殖一倍的时间约莫为18个小时.菌株GS115、X-33、KM71战SMD1168的辨别GS115、KM71战SMD1168等是用于表黑中源蛋黑的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋黑过糖基化，糖基化后有好处蛋黑的溶解或者产死粗确的合叠结构.GS115、KM71、SMD1168正在组氨酸脱氢酶位面(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表黑载体上携戴有组氨酸基果，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，果此不妨正在不含组氨酸的培植基上筛选变化子.那些受体菌自收突形成组氨酸家死型的概率普遍矮于10-8.GS115表型为Mut+，沉组表黑载体变化GS115后，少出的变化子大概是Mut+，也大概是Muts(载体与代AXO1基果)，不妨正在MM战MD 培植基上审定表型.SMD1168战GS115类似，然而SMD1168基果组中的Pep4基果爆收突变，是蛋黑酶缺陷型，可落矮蛋黑酶对付中源蛋黑的落解效率.其中X-33由于是家死型，果此耐受性比较佳，如果担心变化率的话不妨思量那种酵母菌，而X33与GS115一般皆是属于MUT＋表示型，也便是道不妨正在含甲醇的培植基中赶快死少，然而是传闻会对付中源基果表黑灵验率，KM71的亲原菌正在粗氨酸琥珀酸裂解酶基果(arg4)有突变，正在不含粗氨酸的培植基中不克不迭死少.用家死型ARG4基果(约2kb)拔出到克隆的家死型AOX1基果的BamHI(AOX1基果15/16暗号子)及SalI(AOX1基果227/228暗号子)位面，与代了AOX1基果16-227暗号子，此结构变化至KM71亲原菌(arg4his4)中，分散爆收KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+变化子遗传领会隐现家死型AOX1被aox1::ARG4结构所与代，所以KM71所有变化子皆是Muts表型.AOX1位面不被真足缺得，表面上可用您的手段结构通过基果与代要领替换aox1::ARG4结构，那样沉组菌株的表型是His+MutsArg-，那表示着沉组菌株死万古需粗氨酸.然而仅增加粗氨酸本去不克不迭真足缓战arg4突变的效率，arg4菌株正在含粗氨酸的最小培植基中不克不迭很佳天死少.果此不推荐正在KM71中通过与代aox1::ARG4结构去赢得His＋变化子.普遍去道，如果是胞内表黑，应尽管用Muts细胞，那样得到的蛋黑产品中醇氧化酶蛋黑量较少而手段蛋黑量相对付较多，使下游杂化更易举止.而对付于分泌蛋黑的表黑，无论是甲醇利用缓(Muts)仍旧甲醇利用快(Mut+)的细胞皆可应用.基果沉组Pichia.pastoris酵母菌体内无天然量粒，所以表黑载体需与宿主染色体爆收共源沉组，将中源基果表黑框架调整于染色体中以真止中源基果的表黑，包罗开用子、中源基果克隆位面、末止序列、筛选标记表记标帜等.细菌内共源沉组被认为是沉组量粒构修历程的易面，果为已线性化的环状量粒之间爆收共源沉组的几率非常矮，所以沉组变化载体必须用特定的节制性内切酶举止线性化处理.那种处理的手段是预防随机拔出沉组时量粒正在功能区断开，制成手段基果表黑得活，让共源沉组以指定的办法爆收.表黑载体主要分为以下几类：(1)胞内表黑载体主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等.该类载体不妨将手段基果表黑正在胞内，不妨预防毕赤酵母的糖基化，主要符合于那些不克不迭被糖基化相闭基果的表黑；(2)分泌型表黑载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等.由于毕赤酵母自己的泌内源蛋黑非常少，将中源蛋黑分泌到胞中，非常有好处手段蛋黑量的杂化及聚集.时常使用的分泌的旗号序列主假如由89个氨基酸组成的α接配果子(α-factor)的带领；(3)多拷贝拔出表黑载体如pPIC9K，pPIC3.5K.正在某些情况下，毕赤酵母中沉组基果多拷贝调整可减少所需蛋黑的表黑量.该载体均可用于正在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或者体中(pAO815)爆收并分散多拷贝拔出，共时可检测减少沉组基果的拷贝数是可减少蛋黑表黑量.体内调整可通过下遗传霉素抗性筛选大概的多拷贝拔出，而体中调整可通过对接爆收中源基果的串联拔出.正在GS115中筛选His+Mut+变化子：用SalI或者StuI线性化量粒变化GS115后，大多正在His4位面上爆收沉组，大普遍变化子是Mut+表型；然而由于量粒含有AOX1基果序列，有大概正在AOX1位面爆收沉组，损害家死型AOX1基果，爆收His+Muts变化子，则需要正在MD及MM仄板上检测可证据His+ Mut+变化子.毕赤酵母表黑时常使用培植基10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏火，过滤灭菌，4℃保存.YPD真足培植基：酵母提与物10 g/L，蛋黑胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培植基含1.5%琼脂).变化培植基RDB：每100mL加进山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL.混匀，倒仄板(灭菌时只加进80ml火即可).采用培植基MD(最小葡萄糖)：配100mL，背80mL火中加进琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L).采用培植基MM(最小甲醇)：配100mL，背90mL火中加进琼脂糖2g(20 g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%).诱导表黑培植基BMGY：配1L，酵母提与物10 g/L，蛋黑胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加火至890mL，121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×死物素1mL(4×10-4g/L)，苦油10mL.诱导表黑培植基BMMY：酵母提与物10g/L，蛋黑胨20 g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加火至895mL，121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×死物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL.BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋黑胨，可宁静分泌蛋黑，遏止或者缩小分泌蛋黑的领会.如果手段蛋黑对付中性PH蛋黑酶敏感的话，可正在无缓冲培植基(MGY、MM)中表黑.如果不凭证道明您的分泌蛋黑对付中性PH 值蛋黑酶敏感，修议开初表黑时用BMMY.如果表黑蛋黑落解了，测验考查正在无缓冲培植基中举止表黑.如果以上条件仍不克不迭灵验预防蛋黑落解，可将基果转进SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺得了蛋黑酶，变化与表黑步调与GS115相共，也可用于大规模收酵.用考马斯明蓝G-250测蛋黑含量。
毕赤酵母表达系统（学习资料）
毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入A OX1或his4 而不是取代AOX1）。
巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母表达系统点击认领巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达。
编辑摘要巴斯德毕赤酵母表达系统 - 简介十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。
其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。
它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。
巴斯德毕赤酵母表达系统 - 毕赤酵母表达系统的特点自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。
而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势：1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。
毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。
人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究
人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究人溶菌酶是一种重要的蛋白酶，在机体的免疫系统中起着很重要的作用。
人溶菌酶具有溶解细菌细胞壁的作用，对细菌有很强的抑菌和杀菌作用。
研究人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其体外抑菌活性具有重要的意义。
本文结合已有的研究成果，对人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其体外抑菌活性进行了系统的研究。
一、人溶菌酶在毕赤酵母中的表达1.1毕赤酵母表达系统毕赤酵母(Bacillus subtilis)是一种常见的细菌，在生物学研究中经常被用作表达外源蛋白的宿主。
毕赤酵母具有较高的表达效率和较低的成本，可用于大规模生产外源蛋白。
选择毕赤酵母作为表达宿主，具有重要的意义。
1.2载体的构建在本研究中，我们选择了适合在毕赤酵母中表达的载体，并将人溶菌酶的基因插入到载体中，构建了表达载体。
通过测序验证了载体的构建成功，并确定了人溶菌酶的正确插入。
经过载体的构建，我们将表达载体转化到毕赤酵母中，利用适当的诱导条件，如温度、pH值等，使得毕赤酵母表达人溶菌酶。
通过SDS-PAGE电泳及Western blotting等方法，验证了人溶菌酶在毕赤酵母中的表达。
二、人溶菌酶的体外抑菌活性研究2.1提取和纯化在成功表达人溶菌酶后，我们利用适当的方法对毕赤酵母进行破碎，提取人溶菌酶。
随后对提取的溶液进行纯化，得到纯度较高的人溶菌酶样品。
2.2体外抑菌活性的测定通过在适当的条件下，将人溶菌酶与不同种类的细菌培养液进行共孵育，利用凝胶电泳等方法对细菌培养液中的DNA、RNA等进行分析，以确定人溶菌酶的体外抑菌活性。
实验结果表明，人溶菌酶对细菌培养液中的DNA、RNA等具有明显的分解作用，表明人溶菌酶具有较强的抑菌活性。
为了进一步研究人溶菌酶的体外抑菌活性，我们对其影响因素进行了系统的研究。
实验结果表明，人溶菌酶的体外抑菌活性受到温度、pH值、离子浓度等因素的影响。
在一定的温度、pH值和离子浓度下，人溶菌酶的抑菌活性较高，随着这些因素的改变，抑菌活性呈现不同的变化趋势。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述
毕赤酵母启动子以及诱导物
启动子 诱导表达 AOX1，AOX2(甲醇氧化酶) 以甲醇诱导表达 GAP （3 一磷酸甘油醛脱氢酶） 葡萄糖组成型 表达（甘油或甲醇诱导产量只有2/3，1/3） FLD1（甲醛脱氢酶） 以甲基化胺为氮源 (葡萄 糖为碳源)，甲醇为碳源 (硫酸铵为氮源)表达 PEX8（过氧化物酶体基质蛋白） 以葡萄糖、 甲醇诱导表达 YPT1（GTP酶） 以葡萄糖甲醇、甘露糖醇组 成型表达
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的 表达种类
具有代表性的如下列一些外源蛋白质P.pastoris中已经获得高效产 生： (1)蛋白酶类，如人溶菌酶、人胃促胰酶、葡萄糖苷酶等； （2）激素类，如胰岛素前体、人绒毛膜促性腺激素、鲤鱼生长激 素等； （3）受体、抗体及单链抗体等生物活性蛋白； (4)抗原类，如乙型肝炎表面抗原、破伤风毒素片段C、登革热病 毒E蛋白等； (5)细胞因子类，如肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血管生成抑制 因子等； （6）酶制剂类，如植酸酶等； (7)病毒蛋白类，如乙型脑炎病毒E蛋白、伪狂犬病病毒Ea株gE蛋 白等
毕赤酵母的优点
利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。 外源蛋白基因遗传高稳定性，外源蛋白质具有一定程 度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋 白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备 有功能的蛋白质。
毕赤酵母发酵工艺对产量的影响
甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶 段，即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。 酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，另 一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径，并使 细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。 蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源 和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基 因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因 的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白
毕赤酵母表达系统简介
巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。
酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。
以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。
作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。
表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。
它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。
含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。
随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。
1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
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毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
所以，载体必须整合入酵母基因组中才能实现异源蛋白的稳定表达。
多数情况下，外源基因多拷贝整合可提高表达水平。
一般可采用如下3种方法建立多拷贝表达株：①在表达载体中插入首尾相连的多拷贝表达盒；②在表达载体中插入细菌Tn903Kan基因，因G418抗性水平与载体拷贝数呈正相关；③应用含细菌Shble基因的表达载体，如pPICZ系列，该载体较小，易扩增，具有真光霉素抗性。
1、启动子最常用的启动子是AOX1启动子(AOXl，promoter，PA0X)，它的甲醇诱导性很强，因而它控制下的外源基因能得到较高的表达。
A0X1基因是从用RNA构建的cDNA文库中分离的，RNA来自克隆筛选能在甲醇培养基上生长的P．Pasotris细胞。
P．Pasotris基因组包含2个基因：AOX1和AOX2，编码乙醇氧化酶。
在序列上这2种AOX 蛋白同源性≥97％，并有相似特殊活性，但A0X1表达水平明显高于AOX2，即启动能力AOX1大大强于AOX2。
细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由A0X1提供的。
当以甲醇为唯一的生长碳源时，AOX1基因的表达被甲醇严格调控，并被诱导到相当高的水平，可占整个细胞可溶蛋白的30％以上。
AOX1和AOX2同源性虽然高达97％，但AOX2只承担很少一部分活力。
当A0X1基因缺乏而只存在AOX2时，大部分乙醇氧化酶的活力丧失，细胞利用甲醇能力降低。
因此细胞在甲醇介质上生长很慢，这种菌株被称为Muts；A0X1基因存在时，细胞利用甲醇能力正常，在甲醇介质上生长较快，这种菌株表型被称为Mut+。
A0X1基因的表达为转录水平调控。
以甲醇为碳源时，生长细胞中约5％mRNA来自于A0X1基因。
A0X1基因的调控是两步过程：抑制机制加上诱导机制。
即在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录；而在以甲醇为唯一生长碳源时，诱导基因转录，蛋白表达。
最近在P．Pasotris中克隆到一个组成型启动子：PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)，在它控制下的/doc/7b7315119.html,cz基因表达率比甲醇诱导下的以PAOX1为启动子的产量更高。
由于该组成型启动子不需甲醇诱导，发酵工艺更为简单，产量高，所以它是一个很有潜力的启动子。
2、选择标记选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因，常用HIs4。
由于P．Pasotris不利用蔗糖，所以也可用啤酒酵母的蔗糖酶基因suC2作为标记。
AMP：氨苄抗性基因，可在大肠杆菌中筛选。
G418和Zeocinr(Invitrogen，sandiego，CA)也是筛选标记，使得到高拷贝的转化子，这是因为表达载体上外源基因和卡那基因相偶联。
Zeocinr在E.coli和P.Pastoris 宿主中都表达，因此缩短了穿梭载体的长度，但Zeocin是一种强诱变剂，可能导致转化子产生突变。
3、信号肽序列表达蛋白的分泌需要信号肽引导并沿一定途径才能分泌至细胞外。
P.Pastoris自身分泌的蛋白质很少，分泌表达是一种理想的表达方式，胞外表达有利于蛋白质的提取和纯化，同时有助于不分泌型的蛋白质使其分泌，而像人血清蛋白(HSA)和牛凝乳酶(Rennin)，用自身信号肽序列即可在P．Pastoris中成功表达。
然而，对于有些蛋白的自身信号肽，P.Pastoris不能有效利用，如反转录酶。
甲醇营养型酵母表达系统一般利用2种来源的信号肽序列：一是外源基因本身携带的信号肽序列；二是来源于酵母的信号肽序列，如a-因子、PHO1信号肽序列。
P.Pastoris信号肽主要包括磷酸酶(PHO)、转化酶(inertase)和α-因子，其中α-因子信号肽( MF)使用最广。
α-因子信号序列是由87个氨基酸组成，来自于S.cerevsiae的α性成熟因子前导序列，并且已将这段序列编码的信号肽插入到几个P.Pastoris的表达载体中(Invitrogen)。
在构建α-因子信号肽融合基因时，需保留KeX2蛋白酶切位点附近的谷氨酸一丙氨酸(Glu-Ala)间隔区，GluAla 的存在会避免错误切割的发生。
研究证明：信号肽引导的外源蛋白在P.Pastoris中均能被有效切割。
α-MF是在高尔基体中被KeX2蛋白酶识别并切割，而PHO1一般在内质网被切割。
酵母细胞对信号肽序列的识别有一定的灵活性，在一定程度上可以识别外源蛋白的信号肽进行蛋白输送，但利用外源基因自身信号肽序列不能得到高表达量和高分泌效率。
来源于P.pastoris酵母酸性磷酸酶(PHO1)基因的信号肽序列也常用于甲醇营养型酵母表达载体，由该信号肽引导的蛋白一般仅能分泌至膜周质，分泌效应不如a-因子信号肽强。
4、载体（1）表达载体种类有几种甲醇酵母是用于表达外源蛋白的受体菌，如GS115，KM71和SMD1168等，它们都是组氨酸缺陷型。
如表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主的组氢酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。
这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8，通常不予考虑。
GS115表型为Mut+。
重组表达载体转化GS115后，长出的转化子既有可能是Mut+，又有可能是Muts，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。
SMDI168和Gsll5类似，不同的是它是蛋白酶缺陷型，可减弱蛋白酶对外源蛋白的降解作用。
KM71没有AOX1基因，本身就是Muts，因此转化后所有的转化子都是Muts，不必鉴定表型。
Invitrogen公司构建的多种P.Pastoris表达载体，既有胞内表达的，又有分泌表达的。
这些载体都包括一个表达盒(cassette)，它是由0.9 kb的5 ‘A0X1序列片断和约0.3 kb的转录终止基因的3’序列组成。
分泌型表达载体主要有pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；胞内表达的载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)等。
这些载体在结构上有共同点：AOX1：含有AOX1启动子，可调控异源蛋白表达，同时也是载体和受体菌染色体发生重组的位点；McS：多克隆位点，允许外源基因插入；Sig：编码N末端信号肽序列，可引导蛋白分泌；1vr：转录终止和多聚腺苷酸化序列，允许mRNA有救转录终止和多聚腺苷酸化3’AOx1：TT序列下游区域，同源重组位点之一；His：编码组氨酸，提供转化子的筛选标记，也是重组位点之一；Amp：氨苄抗性基因，允许在大肠杆菌中筛选。
按Invitrogen公司推出的Kit可分为3类。
第一类属高拷贝型：如pPIC3K和pPIC9k都携带有卡那基因，可通过提高G418浓度，很容易得到高拷贝的转化子。
PA0815是先在体外构建串联的外源基因多拷贝(可连接8个拷贝子)，转化后可得到已知的多拷贝转化子。
第二类为易筛选型：pPIczA，pPIcza，不需要营养缺陷筛选、不需要氨苄抗性筛选，且载体小，易操作。
但是筛选标记为Zeocin，它是很强的诱变剂，可使外源蛋白突变。
第三类为原始型：pPIc9等操作繁琐，是单一拷贝，有高水平表达外源蛋白的时候，但不多见。
酵母表达载体有多种，采用较多的是整合型表达载体，可通过整合型载体将外源基因整合到酵母染色体上，获得遗传性稳定重组子，而且能通过前导信号肽引导外源蛋白的分泌表达。
并能识别及有效地切割这些信号肽。
外源基因在酵母中的表达一般是采用酵母基因的启动子。
目前，利用最多的是美国Invitrogen公司出售的毕赤酵母表达载体和相应的试剂盒。
该公司构建了多种甲醇酵母表达载体，既有胞内表达的，又有分泌表达的，该种表达载体表达外源蛋白时，需要加人甲醇进行诱导，不利条件是在表达产物中引人了有毒的甲醇。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
pGAP系列表达载体美国Invitrogen公司的产品pGAeZ和pGAPza，是一种无需甲醇诱导而能表达外源蛋白的毕赤酵母载体。
pGAP系列是典型的组成型酵母表达载体，为穿梭型表达载体，能在大肠杆菌和酵母中进行遗传复制。
是以毕赤酵母中磷酸甘油酸脱氢酶(GAP)基因启动子作为外源基因启动子，该启动子是组成型表达的，所以不存在诱导的问题，在以葡萄糖为碳源的培养基上就可以表达。