毕赤酵母中高效引导外源蛋白分泌的信号肽的研究

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毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用

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毕赤酵母表达系统是一种高效、灵活的工具，可用于外源蛋白表达研究和应用。

它是一种重要的生物工程技术，可以实现外来基因的大规模表达，分子量可达到200 KD 以上。

目前，毕
赤酵母表达系统已成功地用于各类重要蛋白质的表达，并发挥了重要作用。

毕赤酵母表达系统的优势在于它能够表达复杂的蛋白质，而且不受细胞因子的限制，能够有效提高蛋白表达的效率。

此外，该系统还具有良好的原核性、容易稳定表达、灵活的改造等特点。

因此，毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白表达和重组蛋白的研究中。

例如，已成功利用该系统彻底破解人工合成水稻Hsp70基因编码蛋白的结构，它同时也是人类在蛋白研
究中的有力工具。

毕赤酵母表达系统在医学研究中也得到了很大的发展。

比如，可以用毕赤酵母表达系统来研究和表达病毒血管瘤病毒(HPV)-695E5蛋白，而这种蛋白可能会加速病毒复制和细胞侵入，因
此有助于治疗HPV相关的癌症。

利用毕赤酵母表达系统还可
以大规模表达多肽，如α-肌动蛋白及其相关蛋白，从而探索
肌钙蛋白的生物学功能。

总的来说，毕赤酵母表达系统是一种重要的生物工程技术，它能够实现外来基因的大规模表达，受益于它的灵活性和稳定性，可以成功用于外源蛋白表达及其相关研究与应用中，是一项具有重大意义的研究。

毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

［1］。

同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。

酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。

干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。

毕赤酵母表达研究进展

利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。

影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。

生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母表达系统研究进展马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【摘要】毕赤酵母是外源蛋白表达的一种重要宿主.毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点,又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能,因此毕赤酵母表达系统具有广泛的应用前景和重要的研究价值.本研究对毕赤酵母表达系统的特点、组成、影响外源基因高效表达的影响因素等进行总结.【期刊名称】《黑龙江科学》【年(卷),期】2013(004)009【总页数】5页(P27-31)【关键词】毕赤酵母;表达系统;外源蛋白;甲醇【作者】马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【作者单位】黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020【正文语种】中文【中图分类】Q815大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其具有遗传背景和生化特性清楚、成本低廉、操作简便、生产效率高等优点最早被采用作为外源基因表达系统。

但大肠杆菌表达系统缺少真核生物的蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，表达的蛋白大部分以包含体形式存在，且需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性以及背景杂蛋白较多[1］，为克服这些缺点，人们于1979年开发了酵母表达系统。

酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。

因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低[2］。

信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

ISSN 058229879生物化学与生物物理学报ACT A BIOCHIMICA et BIOPHY SICA SINICA 2003,35(2):154-160CN 3121300/Q收稿日期:2002208221 接受日期:2002210216上海市科委重大项目(N o.993913002)和上海永业农科生物工程公司资助3联系人:T el ,021*********;Fax ,021*********;e 2mail ,yaoquanhong @信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响熊爱生　彭日荷　李　贤　范惠琴　姚泉洪3　郭美锦1　张嗣良1(上海市农业科学院生物技术研究中心、上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;1华东理工大学生物工程学院,上海200237)摘要乙醇氧化酶启动子被分离、克隆,并建立了转化方法后,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。

为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达,对信号肽序列进行了研究。

首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I ,随后在MF4I 信号肽序列的N 端分别引入1～10个毕赤酵母Aox 1蛋白质的N 端氨基酸,构成10种不同的分泌信号肽序列,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。

以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加,而以N 端增加A 、I 、P 三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比,使植酸酶分泌表达量增加5倍,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为90mg/L 。

此外在MF4I 信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了E E A E A E A E P 和K 共10个氨基酸,进一步提高信号肽的分泌效率,使表达又提高约35%,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到120mg/L ,是pPCI9K 表达量的8倍。

关键词毕赤酵母;信号肽序列;表达载体;高效表达毕赤酵母(Pichia pastoris )系统是近年来发展很快的一个真核表达系统,许多有活性的蛋白质已经在毕赤酵母系统中大量表达。

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

1 P． pastoris 表达系统的特点
P． pastoris 是甲醇营养型酵母中的一种，可以在含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
收稿日期： 2010-11-02 基金项目：福建省科技厅资助项目（ 2009N0032），福建省教育厅资助项目（ JA08041）作者简介：杨梅，女，博士，教授，研究方向：生物化学与分子生物学； E-mail： myang@ fjnu． edu． cn
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到 g / L 以上水平，如 Hao 等［27］成功表达的重组人复合 α-干扰素（ cIFN）的表达量达到 1． 24 g / L； Huang 等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表达量千差万别，外源蛋白的表达受多方面因素的影响。 3． 1 外源基因自身的内在特性
母属（ Candida）和汉逊酵母属（ Hansenula）等。毕赤酵母（ P． pastoris）作为甲醇酵母的一种，是单细胞低等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势，其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。

毕赤酵母表达系统使用心得

毕赤酵母表达系统使用心得PichiaPichiaPichiaPichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高但是在实际操作中并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题收集了部分用户在使用EasySelectPichiaExpressionSystem这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中XiangYang是来自美国乔治城大学GeorgetownUniversityLombardi癌症中心LombardiCancerCenter部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工有利于真核蛋白的表达优点-2.AOX强效启动子外源基因产物表达量高可以达到每升数克表达产物的水平3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物远较真核系统简单非常适合大规模工业化生产。

4.可以诱导表达也可以分泌表达便于产物纯化。

5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源生产成本低表示优胜于-表示不如表示差不多EasySelectPichiaExpressionSystem产品性能优点——使用简单表达量高His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种一方面由于其是属于真核生物因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰另一方面毕赤酵母生长速度快可以将表达的蛋白分泌到培养基中方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点MCR3端带有his-tag和c-mycepitopes这些tag有利于常规检测和纯化而且在MCR5端引入了alphafactorα-factor用以增加表达并且在表达后α-factor可以自动被切除。

巴斯德毕赤酵母新启动子PGCW14的调控结构和应用研究

摘要巴斯德毕赤酵母表达系统是分子学领域内被广泛应用于重组蛋白生产的主要系统之一，既具有操作简单，生长快等特点，又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。

在外源蛋白表达系统中，影响蛋白表达的一个主要因素是启动子活性。

启动子作为基因表达的重要调控元件，通过与转录因子相互作用控制基因转录的起始和表达水平，在转录水平上起重要作用，因而启动子活性的高低在很大程度上影响着蛋白的表达水平。

在毕赤酵母表达系统中，醇氧化酶基因的启动子P AOX1是最常用的启动子，已实现了各种外源蛋白的高效表达尤其是人源蛋白的表达。

但P AOX1是甲醇诱导型启动子，在食品、医药上的应用受到限制，且甲醇的储存和运输等存在火灾隐患，因此毕赤酵母非甲醇诱导的启动子在不断被开发。

根据本实验室对毕赤酵母转录组的研究数据，在以甘油为碳源的培养基中，转录水平最高的是被命名为GCW14(NCBI编号：XM_002490678) 的细胞壁蛋白基因，该基因为组成型表达，推断GCW14具有潜在的高活性启动子。

此外，根据已有的实验数据证明：敲除毕赤酵母基因组上的GCW14基因会降低以Gcw14p为锚定蛋白的CALB的表面展示酶活力，说明壁蛋白Gcw14p与外源蛋白表面展示的效果有关。

本研究将壁蛋白Gcw14p的启动子P GCW14应用于南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的毕赤酵母表达中，并与启动子P AOX1、P GAP、P TEF1的活性进行比较；对P GCW14启动子进行突变，初步探索该启动子的作用元件；将活性提高的突变启动子应用于CALB的表达中，提高CALB的酶活力，也为提高毕赤酵母外源蛋白的表达奠定基础。

主要研究内容如下：(1)为了比较P GCW14和其他3种启动子P AOX1、P GAP、P TEF1表达CALB的能力，构建了4种不同启动子的CALB表面展示重组菌：X33/ pPG14-CALB、X33/pZαA-CALB、X33/pPGAP-CALB和X33/pPTEF1-CALB。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。

介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。

关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。

2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。

绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。

后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。

重组人β淀粉样蛋白1-42小规模发酵及小量纯化工艺的摸索

重组人β淀粉样蛋白1-42小规模发酵及小量纯化工艺的摸索申茉函;王全才;杨丽【摘要】目的研究重组人β淀粉样蛋白1-42(rhAβ1-42)在5L摇瓶中的高密度发酵实验,以及小量纯化工艺的方法.方法分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生rhAβ1-42的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀目的蛋白、透析、脱盐和阴离子交换层析,对rhAβ1-42小量精确的纯化方法进行了研究.结果确定rhAβ1-42在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在pH6.0的条件下,以0.5％甲醇诱导72 h,经过硫酸铵沉淀目的蛋白、透析、脱盐和阴离子交换层析,rhAβ1-42纯度可达94％以上.结论确定了rhAβ1-42在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,建立了小量纯化rhAβ1-42的新方法.【期刊名称】《实用药物与临床》【年(卷),期】2015(018)003【总页数】4页(P256-259)【关键词】β淀粉样蛋白;发酵;小量纯化【作者】申茉函;王全才;杨丽【作者单位】中国医科大学附属盛京医院,沈阳 110004;辽宁省人民医院,沈阳110016;吉林大学人兽共患研究教育部重点实验室,长春130021【正文语种】中文阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的病理特征以脑神经细胞外出现β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的神经斑或称老年斑、脑神经细胞内tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结(NFT)、脑皮层神经细胞减少以及累及皮层动脉和小动脉的血管淀粉样变性为主[1]。

对β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)进行细胞学与动物实验学的研究需要一定的蛋白作为物质基础。

鉴于此，本研究在常规方法的基础上，进一步探讨了甲醇诱导浓度、pH值和诱导时间对毕赤酵母重组工程菌表达rhAβ1-42的影响，对该表达系统进行了小量纯化方法的探索，提高了重组工程菌中rhAβ1-42的表达量。

通过纯化获得高纯度的rhAβ1-42，更好地满足了研究老年性痴呆疾病细胞学和动物实验学的需要，从而为临床治疗提供指导。

毕赤酵母表达系统简介

巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。

酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。

以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。

作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。

表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。

它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。

当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。

含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。

1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。

外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略孙玮遥;王向东;林剑【摘要】毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白.但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义.该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)009【总页数】5页(P11-15)【关键词】毕赤酵母表达系统;外源蛋白;发酵工艺;优化【作者】孙玮遥;王向东;林剑【作者单位】烟台大学生命科学学院,山东烟台264005;山东大学医学院,山东济南250100;烟台大学生命科学学院,山东烟台264005【正文语种】中文【中图分类】Q815以脱氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）重组技术为代表的基因工程的飞速发展，为分子生物学领域的各项研究提供了契机。

蛋白质作为基因表达的产物，成为了一直以来的研究热点，从而也带动了蛋白质表达系统的快速发展。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一，已成功表达了包括激素、疫苗、细菌毒素以及各类药用制品在内的数百种外源蛋白。

虽然已有数百种外源蛋白在毕赤酵母中表达成功，但不同外源蛋白的表达量却差异巨大。

HASSLACHER M等［1］报道过的用毕赤酵母发酵生产胞内羟基腈裂解酶，表达量可达22 g/L，而WEISS S等［2］用毕赤酵母表达仓鼠阮病毒蛋白质PrPc 的表达量却不足0.1 mg/L。

因此，研究不同蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达机制及发酵条件具有重要意义。

影响不同外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素一方面来自于细胞水平的工程菌构建，即通过基因操作手段提高单个细胞的蛋白分泌量；另一方面，从宏观角度上通过优化发酵工艺来提高外源蛋白的表达量。

毕赤酵母高效表达策略概述

-毕赤酵母高效表达策略概述1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。

由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’-U TR。

尽可能和AOXlmRNA 5’-U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。

A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。

因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%~55% 范围内。

巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。

(赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.)外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。

外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。

2.选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。

PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。

通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体,从中筛选提高表达量的突变体。

(戴秀玉, 王恂, 周坚1毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) :559~5611)3.增加外源基因整合拷贝数(1)Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子(配合电激法转化的效果更好)。

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略1.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。

近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。

越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究。

P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。

但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound proteases）和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的。

胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。

胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养。

根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）。

表1.2毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathwayEnzyme Type Gene Zymogen formVacuole PrA Aspartic PEP4 YesPrB Serine PRB1 YesCpY Serine PRC1 YesCpS Metallo-( Zn2+) CPS1 UnknownApI Metallo-( Zn2+) LAP4 YesApCo Metallo-(Co2+) DAP2 NoDPAP-B Serine SEC11 UnknownSecretory pathway signal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 Yes Kex1 carboxypeptidase Serine KEX1 NoDPAP-A Serine STE13 Unknown,predict noYeast as partyl protease ш Aspartic Y AP3 Unknown,predict yes酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解。

信号肽及其在蛋白质表达中的应用

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生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ
２００６年第６期
建立了通过逆转录病毒介导表达筛选的信号序列捕获系统（ＳＳＴ－ＲＥＸ），该系统能高效捕捉信号肽序列。Ｃｈｅｎ［７］设计了一种以人碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）基因为标记分子的ＰＳＴ系统，只有编码起始和融合在ＰＬＡＰ框内的功能信号肽才能把嵌合蛋白运送到细胞表面或分泌入胞浆，从而利用底物－酶结合的特性进行比色分析。Ｍｏｆｆａｔｔ［８］利用病毒颗粒建立了ＥＢ－ＶＳＳ法，在这一方法中，标记分子的表达可以触发目标核酸运出细胞到培养基中，从而避免了筛选细胞的必要。Ｐéｔｅｒｆｙ等［９］利用基因组ＤＮＡ代替ｃＤＮＡ创立了外显子信号捕获（ｓｉｇｎａｌ－ｅｘｏｎｔｒａｐ，ＳＥＴ）法，该法适用于几乎所有的表达类型和表达强度的分泌性和膜性信号捕获。Ｇｅｂａｕｅｒ等［１０］利用融合在大肠杆菌新霉素磷酸转移酶表达框内的ＣＤ２表达抗原作为标记分子基因，建立了一种筛选编码分泌性和膜性蛋白调节基因整合分子的逆转录病毒介导的信号序列捕获策略，利用这一策略可以有效地从基因组水平筛选编码分泌性和膜性蛋白整合分子［１１］。
新生肽链或蛋白质中，一些残基的化学修饰也是转译后加工的一个重要内容。发生修饰的残基决不是任意的，也和肽链中的氨基酸序列密切相关。从这个意义而言，这些和残基修饰有关的肽段，也可认为是残基修饰的信号肽。例如，在肽链中连接有Ｎ－糖链的天冬酰胺残基（Ｎ），一定是位于Ｎｘ（Ｓ／Ｔ）这种特定三肽序列中的天冬酰胺；一些蛋白质的Ｃ末端附近可以为萜类所修饰，能接上萜类的半胱氨酸酸残基，同样是具有特定序列的Ｃ末端四肽中的半胱氨酸酸残基，而且其中某些残基还决定了所接上的萜类的长度。为此，可认为在肽链中尚存在着与残基修饰相关的信号肽。

一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用[发明专利]

专利名称：一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用
专利类型：发明专利
发明人：林尧,黄义德,吴静雯,洪文柄
申请号：CN201910339544.3
申请日：20190425
公开号：CN110054667A
公开日：
20190726
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α‑factor信号肽及其应用。

本发明对具有如SEQID NO:1所示氨基酸序列的毕赤酵母GS115α‑factor信号肽引入一个N糖基化位点，得到优化后的毕赤酵母GS115交配外激素α‑factor信号肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

本发明优化的α‑factor信号肽特别适用于引导外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，与优化前信号肽相比，表达水平提高了5‑7倍，其应用有利于筛选到高表达菌株，具有降低生产成本、便于后续纯化等优势。

申请人：福建师范大学
地址：350108 福建省福州市闽侯县上街镇大学城福建师范大学科技处
国籍：CN
代理机构：福州君诚知识产权代理有限公司
代理人：戴雨君
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酵母分泌信号肽实验原理(一)

酵母分泌信号肽实验原理(一)
酵母分泌信号肽实验
1. 引言
•酵母分泌信号肽实验是一种常用的实验方法，用于研究酵母细胞中信号传导过程。

2. 信号传导的重要性
•信号传导是细胞内各种生物学过程的基础，包括细胞增殖、分化和存活等。

3. 信号肽及其功能
•信号肽是细胞间的一种重要通讯分子，能够通过细胞外的信号传递到细胞内，触发特定的生物学反应。

4. 酵母中信号肽的分泌机制
•酵母细胞通过特定的分泌机制将信号肽释放到细胞外，这个过程受到许多内外因素的调控。

5. 酵母分泌信号肽实验的原理
•酵母分泌信号肽实验通过将感兴趣的信号肽基因导入酵母细胞，然后观察信号肽的分泌和效应。

6. 实验步骤
•复制信号肽基因；
•构建基因表达载体；
•转化酵母细胞；
•培养和诱导表达信号肽基因；
•收集和分析分泌的信号肽。

7. 实验技术
•酵母基因工程技术；
•基因表达和转化技术；
•蛋白质分析技术。

8. 实验结果与分析
•通过分析酵母中分泌的信号肽，可以了解信号传导过程中的关键分子和机制。

9. 应用与前景
•酵母分泌信号肽实验在药物研发和细胞信号传导研究中有重要的应用价值。

10. 结论
•酵母分泌信号肽实验是研究信号传导过程的常用实验方法，通过该实验可以深入了解细胞间的通讯机制。